JP2002186497A - １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】糖尿病の診断マーカーとして有用な１，５−ア
ンヒドログルシトール（１，５−ＡＧ）の定量方法およ
び試薬を提供する。 【解決手段】１，５−ＡＧ、マルトース（Ｍ）およびグ
ルコース（Ｇ）を含有する検体中のＭを、ＭをＧに変換
できる酵素によってＧに変換し、Ｇを、１，５−アンヒ
ドログルシトール６−リン酸化酵素によってリン酸化さ
れず且つ１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸
デヒドロゲナーゼ（ＡＧ６Ｐ−ＤＨ）によって脱水素さ
れない化合物に変換し得る酵素によって該化合物に変換
し、１，５−ＡＧを１，５−アンヒドログルシトール６
−リン酸化酵素によって１，５−アンヒドログルシトー
ル−６−リン酸（１，５−ＡＧ６Ｐ）に変換し、１，５
−ＡＧ６Ｐを酸化型補酵素の存在下ＡＧ６Ｐ−ＤＨによ
って脱水素し、反応液中の脱水素反応によって生成した
成分または減少した成分を定量することを特徴とする
１，５−ＡＧの定量方法および試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖尿病の診断マー
カーとして有用な１,５−アンヒドログルシトール（以
下、１,５−ＡＧと略すことがある。）の定量方法、こ
の方法に用いる試薬および試薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】１,５−アンヒドログルシトールはヒト
体液等の生体試料中に含まれ、糖尿病の診断マーカーと
して有用である。１,５−アンヒドログルシトールはグ
ルコースと酷似した構造を有し、血液中には通常１,５
−アンヒドログルシトールの１０倍以上のグルコースが
存在し、それ故グルコースは酵素を用いる１,５−アン
ヒドログルシトールの定量方法を妨害する。

【０００３】１，５−アンヒドログルシトールに作用す
る酵素としては、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ（ＥＣ
１．１．３．１１）またはピラノースオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ１．１．３．１０）（特開昭６３−１８５３９７号公
報）、グルコキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．２）（特開
平８−１０７７９６号公報）、ヘキソキナーゼ（ＥＣ
２．７．１．１）（特開平８−１０７７９６公報）、Ａ
ＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＥＣ登録なし）（特開平６
−２４８０５２および特開平１０−１９１９９８公報）
などが知られている。また、１，５−アンヒドログルシ
トールにヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまたはＡＤＰ
依存性ヘキソキナーゼを作用させた後、１，５−アンヒ
ドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用
させ、１，５−アンヒドログルシトールを定量する方法
が知られている（欧州公開特許公報第１００８６５７
号）。

【０００４】従来、酵素を用いて試料中の１,５−アン
ヒドログルシトールを定量する方法は、試料中のグルコ
ースを無視するか、グルコースを消去した後１,５−ア
ンヒドログルシトールを定量する方法が検討されてい
る。前者のグルコースを無視する方法によっては、１,
５−アンヒドログルシトールを正確に定量されない。ま
た、後者においては、グルコースの消去に用いられる酵
素によって１,５−アンヒドログルシトールも影響を受
ける。満足できる方法は最近まで開発されなかったが、
欧州特許公開第１００８６５７号公報はグルコースをフ
ルクトース１,６−２リン酸に変換し、ついで１,５−ア
ンヒドログルシトールをリン酸化して１,５−アンヒド
ログルシトール−６−リン酸に変換し、これを酸化型補
酵素の存在下、１,５−アンヒドログルシトール−６−
リン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素し、生成した還
元型補酵素を定量することによって１,５−アンヒドロ
グルシトールを定量する方法を開示している。この方法
においては、グルコースから変換されたフルクトース−
１,６−二リン酸はグルコースに逆変換されず、その後
の１,５−アンヒドログルシトール定量における酵素反
応に全く影響を与えないので、この方法は試料中の１,
５−アンヒドログルシトールを正確に定量できる優れた
方法である。

【０００５】しかしながら、この公報は試料中のマルト
ースについて何も開示していない。糖尿病患者を含め入
院患者に対して、熱源の補給などのためマルトースを含
む輸液が用いられ、生体試料にマルトースが含まれる。
また、１,５−アンヒドログルシトールの定量に用いる
酵素が、精製の困難等の故にマルトースをグルコースに
変換する活性、例えばα−グルコシダーゼを併せ有する
場合があり、試料中にマルトースが含まれていると１,
５−アンヒドログルシトールの定量に影響を与える。そ
れ故生体試料中の成分の定量においてはマルトースの除
去を検討する必要がある。

【０００６】従来、１,５−アンヒドログルシトールの
定量方法におけるマルトースの除去については、α−グ
ルコシダーゼを用いてマルトースをグルコースに変換し
た後、ヘキソキナーゼとＡＴＰを用いて特定条件下でグ
ルコースを消去し、ついでピラノースオキシダーゼを用
いて１,５−アンヒドログルシトールを定量する方法が
開示されている（特開平０６−７０７９５）。しかしな
がら、この方法においては１,５−アンヒドログルシト
ールが残留するように選択的にグルコースを除去するこ
とを要求していて、操作が複雑で、データの安定性に問
題がある。

【０００７】また、試料中のマルトースをα−グルコシ
ダーゼを用いてグルコースに変換した後、グルコキナー
ゼまたはヘキソキナーゼを用いてグルコースをグルコー
ス６リン酸に変換し、ついでピラノースオキシダーゼあ
るいはソルボースオキシダーゼを用いて１,５−アンヒ
ドログルシトールを定量する方法が開示されている（特
開平０６−７１７９）。この方法においてはグルコース
のグルコース−６−リン酸への変換に際し、１,５−ア
ンヒドログルシトールもリン酸化され、正確な１,５−
アンヒドログルシトールの定量は期待できない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、１,
５−アンヒドログルシトール、マルトースおよびグルコ
ースを含有する検体中の１,５−アンヒドログルシトー
ルを正確に定量する方法およびそれに用いる定量試薬お
よび定量試薬キットを提供することである。さらに、検
体中のマルトースおよびグルコースを消去する方法、そ
れに用いる試薬を提供することである。さらに加えて検
体中のマルトースおよびグルコースを消去し、ついで標
的成分を酵素を用いて定量する方法およびそれに用いる
標的成分の定量試薬を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、検体中の
マルトースをグルコースに変換し、ついでグルコース
を、１,５−アンヒドログルシトールの定量分析で使用
される酵素によって影響されない化合物に変換した後、
１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素およ
び１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼを用いて１,５−アンヒドログルシトールを
定量する方法を完成させた。

【００１０】本発明は次ぎの（１）〜（３９）に関す
る。 （１） １,５−アンヒドログルシトール、マルトース
およびグルコースを含有する検体中のマルトースを、マ
ルトースをグルコースに変換できる酵素システム〔以下
酵素システム（Ａ）という〕によってグルコースに変換
し、グルコースを、１,５−アンヒドログルシトール６
−リン酸化酵素システムによってリン酸化されず且つ
１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼによって脱水素されない化合物に変換し得る酵
素システム〔以下酵素システム（Ｂ）という〕によって
該化合物に変換し、１,５−アンヒドログルシトールを
１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素シス
テムによって１,５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸に変換し、１,５−アンヒドログルシトール−６−
リン酸を酸化型補酵素の存在下１,５−アンヒドログル
シトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素
し、反応液中の脱水素反応によって生成した成分または
減少した成分を定量することを特徴とする１,５−アン
ヒドログルシトールの定量方法。

【００１１】（２） １,５−アンヒドログルシトール
６−リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼおよ
びＮＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および
（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからな
る群から選択される（１）記載の方法。

【００１２】（３） 酵素システム（Ａ）が（イ）α−
グルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホス
ホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホ
リラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群
から選択される（イ）記載の方法。

【００１３】（４） 酵素システム（Ｂ）が（イ）グル
コース６−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイ
ソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴ
Ｐ、（ロ）グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコース
オキシダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオ
キシダーゼおよびカタラーゼ、および（ホ）グルコース
オキシダーゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる
群から選択される（１）記載の方法。

【００１４】（５） １,５−アンヒドログルシトール
６−リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼおよ
びＮＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および
（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからな
る群から選択され、酵素システム（Ａ）が（イ）α−グ
ルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホ
リラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリ
ラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群か
ら選択され、酵素システム（Ｂ）が（イ）グルコース６
−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメラー
ゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ,（ロ）
グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコースオキシダー
ゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオキシダーゼ
およびカタラーゼ、および（ホ）グルコースオキシダー
ゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる群から選択
される（１）記載の定量方法。

【００１５】（６） グルコース６−リン酸化酵素シス
テムが（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グル
コキナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘ
キソキナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される
（４）または（５）記載の方法。

【００１６】（７） １,５−アンヒドログルシトール
−６−リン酸デヒドロゲナーゼが、エシェリヒア属に属
する微生物由来の酵素である（１）記載の方法。

【００１７】（８） 該生成した成分が還元型補酵素で
あって、還元型補酵素の定量が、脱水素反応における反
応液の吸光度を測定することにより行われる（１）記載
の方法。

【００１８】（９） 該生成した成分が還元型補酵素で
あって、補酵素の定量が還元型補酵素とテトラゾリウム
塩とを電子キャリヤーの存在下に反応させて、生成する
ホルマザン色素によって着色した反応液の吸光度を測定
することによって行なわれる（１）記載の方法。

【００１９】（１０） マルトースをグルコースに変換
できる酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグル
コースへの変換試薬、グルコースを、１,５−アンヒド
ログルシトール６−リン酸化酵素システムによってリン
酸化されず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−
リン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物
に変換し得る酵素システム（Ｂ）を含有するグルコース
の消去試薬、１,５−アンヒドログルシトール６−リン
酸化酵素システムを含有する１,５−アンヒドログルシ
トールの１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸
への変換試薬および１,５−アンヒドログルシトール−
６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび酸化型補酵素を含有
する１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸の脱
水素試薬を含有する１,５−アンヒドログルシトールの
定量試薬。

【００２０】（１１） １,５−アンヒドログルシトー
ル６−リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼお
よびＮＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、およ
び（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰから
なる群から選択される（１０）記載の試薬。

【００２１】（１２） 酵素システム（Ａ）が（イ）α
−グルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホ
スホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホス
ホリラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる
群から選択される請求項１０記載の試薬。

【００２２】（１３） 酵素システム（Ｂ）が（イ）グ
ルコース６−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソース
イソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴ
Ｐ、（ロ）グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコース
オキシダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオ
キシダーゼおよびカタラーゼ、および（ホ）グルコース
オキシダーゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる
群から選択される（１０）記載の試薬。

【００２３】（１４） １,５−アンヒドログルシトー
ル６−リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼお
よびＮＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、およ
び（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰから
なる群から選択され、酵素システム（Ａ）が（イ）α−
グルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホス
ホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホ
リラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群
から選択され、酵素システム（Ｂ）が（イ）グルコース
６−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメラ
ーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ、
（ロ）グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコースオキ
シダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオキシ
ダーゼおよびカタラーゼおよび（ホ）グルコースオキシ
ダーゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる群から
選択される（１０）記載の試薬。

【００２４】（１５） グルコース６−リン酸化酵素シ
ステムが（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グ
ルコキナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性
ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される
（１３）または（１４）記載の試薬。

【００２５】（１６） １,５−アンヒドログルシトー
ル−６−リン酸デヒドロゲナーゼが、エシェリヒア属に
属する微生物由来の酵素である（１０）記載の試薬。

【００２６】（１７） マルトースをグルコースに変換
できる酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグル
コースへの変換試薬、グルコースを、１,５−アンヒド
ログルシトール６−リン酸化酵素システムによってリン
酸化されず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−
リン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物
に変換できる酵素システム（Ｂ）を含有するグルコース
の消去試薬および１,５−アンヒドログルシトール６−
リン酸化酵素システムを含有する１,５−アンヒドログ
ルシトールの１,５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸への変換試薬からなる第一試薬および１,５−アン
ヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよ
び酸化型補酵素を含有する１,５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸の脱水素試薬からなる第二試薬からな
る１,５−アンヒドログルシトールの定量試薬キット。

【００２７】（１８） マルトースをグルコースに変換
できる酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグル
コースへの変換試薬およびグルコースを、１,５−アン
ヒドログルシトール６−リン酸化酵素システムによって
リン酸化されず且つ１,５−アンヒドログルシトール−
６−リン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素されない化
合物に変換できる酵素システム（Ｂ）を含有するグルコ
ースの消去試薬からなる第一試薬および１,５−アンヒ
ドログルシトール６−リン酸化酵素システムを含有する
１,５−アンヒドログルシトールの１,５−アンヒドログ
ルシトール−６−リン酸への変換試薬および１,５−ア
ンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼお
よび酸化型補酵素を含有する１,５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸の脱水素試薬からなる第二試薬から
なる１,５−アンヒドログルシトールの定量試薬キッ
ト。

【００２８】（１９） マルトースをグルコースに変換
できる酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグル
コースへの変換試薬、グルコースを１,５−アンヒドロ
グルシトール６−リン酸化酵素システムによってリン酸
化されず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物に
変換できる酵素システム（Ｂ）を含有するグルコースの
消去試薬、１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸
化酵素システムを含有する１,５−アンヒドログルシト
ールの１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸へ
の変換試薬および酸化型補酵素を含有する第一試薬およ
び１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼを含有する第二試薬からなる１,５−アンヒ
ドログルシトールの定量試薬キット。

【００２９】（２０） マルトースをグルコースに変換
できる酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグル
コースへの変換試薬、グルコースを１,５−アンヒドロ
グルシトール６−リン酸化酵素システムによってリン酸
化されず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物に
変換できる酵素システム（Ｂ）を含有するグルコースの
消去試薬および酸化型補酵素を含有する第一試薬および
１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素シス
テムを含有する１,５−アンヒドログルシトールの１,５
−アンヒドログルシトール−６−リン酸への変換試薬お
よび１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼを含有する第二試薬からなる１,５−アン
ヒドログルシトールの定量試薬キット。

【００３０】（２１） マルトースをグルコースに変換
できる酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグル
コースへの変換試薬、（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴ
Ｐ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）
ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからなる群か
ら選択される一つ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６
−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰを含有するグル
コースの消去試薬および酸化型補酵素を含有する第一試
薬および１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸
デヒドロゲナーゼを含有する第二試薬からなる１,５−
アンヒドログルシトールの定量試薬キット。

【００３１】（２２） マルトースをグルコースに変換
できる酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグル
コースへの変換試薬、（ロ）グルコースオキシダーゼ、
（ハ）グルコースオキシダーゼおよびムタロターゼ、
（ニ）グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼ、およ
び（ホ）グルコースオキシダーゼ、ムタロターゼおよび
カタラーゼからなる群から選択される酵素システム
（Ｂ）を含有するグルコースの消去試薬、ＮＴＰまたは
ＮＤＰおよび酸化型補酵素からなる第一試薬、および
１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素およ
び１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼからなる第二試薬からなる１,５−アンヒド
ログルシトールの定量試薬キット。

【００３２】（２３） １,５−アンヒドログルシトー
ル６−リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼお
よびＮＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、およ
び（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰから
なる群から選択される請求項１７〜２０のいずれか１項
に記載の試薬キット。

【００３３】（２４） 酵素システム（Ａ）が（イ）α
−グルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホ
スホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホス
ホリラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる
群から選択される（１７）〜（２２）のいずれか１項に
記載の試薬キット。

【００３４】（２５） 酵素システム（Ｂ）が（イ）グ
ルコース６−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソース
イソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴ
Ｐ,（ロ）グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコース
オキシダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオ
キシダーゼおよびカタラーゼ、および（ホ）グルコース
オキシダーゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる
群から選択される（１７）〜（２０）のいずれか１項に
記載の試薬キット。

【００３５】（２６） １,５−アンヒドログルシトー
ル６−リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼお
よびＮＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、およ
び（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰから
なる群から選択され、酵素システム（Ａ）が（イ）α−
グルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホス
ホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホ
リラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群
から選択され、酵素システム（Ｂ）が（イ）グルコース
６−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメラ
ーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ,
（ロ）グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコースオキ
シダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオキシ
ダーゼおよびカタラーゼ、および（ホ）グルコースオキ
シダーゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる群か
ら選択される（１７）〜（２０）のいずれか１項に記載
の試薬キット。

【００３６】（２７） グルコース６−リン酸化酵素シ
ステムが（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グ
ルコキナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性
ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される
（２５）または（２６）記載の試薬キット。

【００３７】（２８） １,５−アンヒドログルシトー
ル−６−リン酸デヒドロゲナーゼが、エシェリヒア属に
属する微生物由来の酵素である（１７）〜（２２）のい
ずれか１項に記載の試薬キット。

【００３８】（２９） 第一試薬にさらに電子キャリア
ーが含まれ、第二試薬にさらにテトラゾリウム塩が含ま
れる（１７）〜（２８）のいずれか１項に記載の試薬キ
ット。

【００３９】（３０） マルトースおよびグルコースを
含有する検体中のマルトースを、マルトースをグルコー
スに変換できる酵素システム（Ａ）によってグルコース
に変換し、グルコースを、グルコース６−リン酸化酵素
システム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホ
フルクトキナーゼおよびＮＴＰを用いてフルクトースー
１,６−二リン酸に変換することを特徴とするマルトー
スおよびグルコースの消去方法。

【００４０】（３１） 該方法が、１,５−アンヒドロ
グルシトール、マルトースおよびグルコースを含有する
検体中の１,５−アンヒドログルシトールを酵素を用い
て定量する方法において行われる（３０）記載の方法。

【００４１】（３２） 酵素システム（Ａ）が（イ）α
−グルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホ
スホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホス
ホリラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる
群から選択され、グルコース６−リン酸化酵素システム
が（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキ
ナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソ
キナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される（３
０）または（３１）記載の方法。

【００４２】（３３） マルトースをグルコースに変換
できる酵素システム（Ａ）、グルコース６−リン酸化酵
素システム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホス
ホフルクトキナーゼおよびＮＴＰを含有することを特徴
とするマルトースおよびグルコースの消去試薬。

【００４３】（３４） 該試薬が、１,５−アンヒドロ
グルシトールを酵素を用いて定量する際に使用するため
の試薬である（３３）記載の試薬。

【００４４】（３５） 酵素システム（Ａ）が（イ）α
−グルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホ
スホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホス
ホリラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる
群から選択され、グルコース６−リン酸化酵素システム
が（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキ
ナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソ
キナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される（３
３）または（３４）記載の試薬。

【００４５】（３６） マルトースおよびグルコースを
含有する検体中のマルトースを、マルトースをグルコー
スに変換できる酵素システム（Ａ）によってグルコース
に変換し、グルコースを、グルコース６−リン酸化酵素
システム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホ
フルクトキナーゼおよびＮＴＰを用いてフルクトースー
１,６−二リン酸に変換し、ついで検体中の標的成分を
酵素を用いて定量することを特徴とする標的成分の定量
方法。

【００４６】（３７） 酵素システム（Ａ）が（イ）α
−グルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホ
スホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホス
ホリラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる
群から選択され、グルコース６−リン酸化酵素システム
が（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキ
ナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソ
キナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される請求項
３６記載の方法。

【００４７】（３８） マルトースをグルコースに変換
できる酵素システム（Ａ）、グルコース６−リン酸化酵
素システム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホス
ホフルクトキナーゼおよびＮＴＰを含有するマルトース
およびグルコースの消去試薬および標的成分に作用する
酵素およびその酵素反応に必要な成分を含有する標的成
分の定量試薬。

【００４８】（３９） 酵素システム（Ａ）が（イ）α
−グルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホ
スホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホス
ホリラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる
群から選択され、グルコース６−リン酸化酵素システム
が（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキ
ナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソ
キナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される（３
８）記載の試薬。

【００４９】

【発明の実施の形態】１,５−アンヒドログルシトール
を測定する検体としては、マルトースおよびグルコース
が混在する可能性のある検体であればいずれでもよく、
例えば血液、血漿、血清、尿等の生体試料があげられ
る。

【００５０】本発明によれば、検体中のマルトースをグ
ルコースに変換（マルトースのグルコースへの変換）
し、変換されたグルコースおよび検体中に存在していた
グルコースを１,５−アンヒドログルシトールの定量に
影響しない化合物に変換（グルコースの消去）し、１,
５−アンヒドログルシトールをリン酸化して１,５−ア
ンヒドログルシトール−６−リン酸に変換（１,５−ア
ンヒドログルシトールのリン酸化）し、これを酸化型補
酵素の存在下１,５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼで脱水素（１,５−アンヒドログ
ルシトール−６−リン酸の脱水素）して反応液中に生成
もしくは減少した成分を定量することによって１,５−
アンヒドログルシトールを正確に定量できる。

【００５１】マルトースのグルコースへの変換 酵素システム（Ａ）はマルトースをグルコースに変換で
きる酵素およびその酵素反応に必要な補酵素等の成分を
含み、その例は（イ）α−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．
２．１．２０）、（ロ）無機リンおよびマルトースホス
ホリラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホ
リラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼを含む。

【００５２】マルトースはα−グルコシダーゼによって
グルコースに変換され、無機リンの存在下マルトースホ
スホリラーゼによってグルコースとβ−グルコース−１
−リン酸に変換される。β−マルトースはマルトースホ
スホリラーゼによって分解されないので、マルトース１
−エピメラーゼの作用によってマルトース中のβ−マル
トースをα−マルトースに変換することが好ましい。

【００５３】グルコース消去 酵素システム（Ｂ）はグルコースを、１,５−アンヒド
ログルシトール６−リン酸化酵素システムによってリン
酸化されず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−
リン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物
に変換できる酵素およびその酵素反応に必要な補酵素等
の成分を含み、その例は、（イ）グルコース６−リン酸
化酵素システム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−
ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコー
スオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）、（ハ）グル
コースオキシダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコ
ースオキシダーゼおよびカタラーゼ、および（ホ）グル
コースオキシダーゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼを
含む。

【００５４】グルコース６−リン酸化酵素システムはグ
ルコースをリン酸化してグルコース−６−リン酸に変換
できる酵素およびその酵素反応に必要な補酵素等の成分
を含み、その例は、（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴ
Ｐ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）
ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰを含む。これ
らの酵素は通常マグネシウムイオンやマンガンイオンの
ような金属イオンと共に使用される。これらの酵素は
１,５−アンヒドログルシトールを１,５−アンヒドログ
ルシトール−６−リン酸に変換する活性も併せて有し、
１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素とし
ても使用できる。

【００５５】前記酵素システム（Ｂ）の（イ）の酵素シ
ステムを用いる場合、グルコースはグルコース６−リン
酸化酵素によってグルコース−６−リン酸に変換され、
ついでホスホヘキソースイソメラーゼと６−ホスホフル
クトキナーゼによってフルクトース−１,６−二リン酸
に変換される。この化合物はグルコースに逆変換され
ず、１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素
によってリン酸化されず、且つ１,５−アンヒドログル
シトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素
されないので、１,５−アンヒドログルシトールの定量
における酵素反応に影響を与えない。

【００５６】前記酵素システム（Ｂ）の（ロ）〜（ホ）
の酵素システムを用いる場合、β−グルコースは溶存酸
素の存在下グルコースオキシダーゼによって酸化されグ
ルコノ−１,５−ラクトンに変換され、過酸化水素が生
成する。試料中のα−グルコースをβ−グルコースに変
換させるため、ムタロターゼ（アルドース１−エピメラ
ーゼとも言われる）を添加することが好ましい。また、
過酸化水素は好ましくはカタラーゼを添加することによ
って分解され酸素が生成する。

【００５７】１,５−アンヒドログルシトールの６−リ
ン酸化 １,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素シス
テムは１,５−アンヒドログルシトールを１,５−アンヒ
ドログルシトール６−リン酸に変換できる１,５−アン
ヒドログルシトール６−リン酸化酵素およびその酵素反
応に必要な補酵素等の成分を含み、その例は（イ）ヘキ
ソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよび
ＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよ
びＮＤＰを含む。

【００５８】１,５−アンヒドログルシトールはこの酵
素システムによってリン酸化され１,５−アンヒドログ
ルシトール−６−リン酸を生成する。前記例示されたグ
ルコース６−リン酸化酵素は１,５−アンヒドログルシ
トールもリン酸化する活性を有するので、グルコース消
去に際しグルコース６−リン酸化酵素として例示の酵素
が用いられた場合、１,５−アンヒドログルシトールも
同時にリン酸化される。従ってグルコースの消去にこれ
らのグルコース６−リン酸化酵素が用いられた場合この
工程を省略できる。

【００５９】１,５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸の脱水素 １,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸は酸化型
補酵素の存在下、１,５−アンヒドログルシトール−６
−リン酸デヒドロゲナーゼで脱水素され、生成する還元
型補酵素を定量することにより試料中の１,５−アンヒ
ドログルシトールを定量することができる。

【００６０】酸化型補酵素の例はＮＡＤ（Ｐ）を含み、
還元型補酵素の例はＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む。ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの定量方法については種々の方法が知られてい
て、それらを利用できる。詳細については後述される。

【００６１】本発明の１,５−アンヒドログルシトール
定量試薬はマルトースをグルコースに変換できる酵素シ
ステム（Ａ）を含有するマルトースのグルコースへの変
換試薬、グルコースを、１,５−アンヒドログルシトー
ル６−リン酸化酵素システムによってリン酸化されず且
つ１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼによって脱水素されない化合物に変換し得る
酵素システム（Ｂ）を含有するグルコースの消去試薬、
１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素シス
テムを含有する１,５−アンヒドログルシトールの１,５
−アンヒドログルシトール−６−リン酸への変換試薬お
よび１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼおよび酸化型補酵素を含有する１,５−ア
ンヒドログルシトール−６−リン酸の脱水素試薬を含有
する。

【００６２】酵素システム（Ａ）、酵素システム
（Ｂ）、グルコース６−リン酸化酵素システムおよび
１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素シス
テムは、本発明の１,５−アンヒドログルシトールの定
量方法の記載におけるこれらと同一の意義を有し、それ
らの例示は前記の例示を含む。本発明の１,５−アンヒ
ドログルシトールの定量試薬は、必要に応じて酵素反応
に必要な成分、前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、安定化
剤、界面活性剤、防腐剤等、色源体、電子キャリアー、
テトラゾリウム塩類、他の酵素等を含むことができる。

【００６３】本発明の１,５−アンヒドログルシトール
定量試薬キットの典型的な２種が例示される。

【００６４】（１）マルトースをグルコースに変換でき
る酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグルコー
スへの変換試薬、グルコースを、１,５−アンヒドログ
ルシトール６−リン酸化酵素によってリン酸化されず且
つ１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼによって脱水素されない化合物に変換できる
酵素システム（Ｂ）を含有するグルコースの消去試薬お
よび１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素
システムを含有する１,５−アンヒドログルシトールの
１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸への変換
試薬からなる第一試薬および１,５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび酸化型補酵
素を含有する１,５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸の脱水素試薬からなる第二試薬からなる１,５−ア
ンヒドログルシトールの定量試薬キット。

【００６５】（２）マルトースをグルコースに変換でき
る酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグルコー
スへの変換試薬およびグルコースを、１,５−アンヒド
ログルシトール６−リン酸化酵素システムによってリン
酸化されず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−
リン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物
に変換できる酵素システム（Ｂ）を含有するグルコース
の消去試薬からなる第一試薬および１,５−アンヒドロ
グルシトール６−リン酸化酵素システムを含有する１,
５−アンヒドログルシトールの１,５−アンヒドログル
シトール−６−リン酸への変換試薬および１,５−アン
ヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよ
び酸化型補酵素を含有する１,５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸の脱水素試薬からなる第二試薬からな
る１,５−アンヒドログルシトールの定量試薬キット。

【００６６】酵素システム（Ａ）、酵素システム
（Ｂ）、グルコース６−リン酸化酵素システムおよび
１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素シス
テムは、本発明の１,５−アンヒドログルシトールの定
量方法の記載におけるこれらと同一の意義を有し、それ
らの例示は前記の例示を含む。上記（１）（２）いずれ
のキットにおいてもグルコース６−リン酸化酵素システ
ムとして例示の酵素が選択された場合、本発明の定量試
薬キットは、１,５−アンヒドログルシトール６−リン
酸化酵素システムを省略できる。

【００６７】必要に応じて酵素反応に必要な成分、前述
の緩衝剤、酵素活性調節剤、安定化剤、界面活性剤、防
腐剤等、色源体、電子キャリアー、テトラゾリウム塩
類、他の酵素等を含むことができる。第二試薬中には
１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼと酸化型補酵素のいずれか片方を含有させ他方
を第一試薬に含有させることもできる。

【００６８】グルコースの消去にグルコースオキシダー
ゼが用いられる場合、ＮＴＰまたはＮＤＰを第一試薬に
包含させ、１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸
化酵素を第二試薬に包含させることができる。１,５−
アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素の例はヘキソ
キナーゼ、グルコキナーゼおよびＮＤＰ依存性ヘキソキ
ナーゼを含む。

【００６９】本発明のマルトースおよびグルコースの消
去方法の発明は、前述の１,５−アンヒドログルシトー
ルの定量方法におけるマルトースのグルコースへの変換
およびグルコースの消去におけるグルコースをフルクト
ース−１,６−二リン酸に変換させる方法の組み合わせ
によって構成される。この方法に用いる試薬は酵素シス
テム（Ａ）および酵素システム（Ｂ）の（イ）グルコー
ス６−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメ
ラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰによ
って構成される。酵素システム（Ａ）は１,５−アンヒ
ドログルシトールの定量方法の記載におけるそれと同一
の意義を有し、それらの例示は前記の例示を含む。

【００７０】本発明のマルトースおよびグルコースの消
去方法における１,５−アンヒドログルシトールを酵素
を用いて定量する方法については、前述の１,５−アン
ヒドログルシトールを６−リン酸化して１,５−アンヒ
ドログルシトール−６−リン酸とし、これを１,５−ア
ンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼに
よって脱水素する方法を初めとして、ピラノースオキシ
ダーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、ＡＤＰ依存
性ヘキソキナーゼ等を用いて酵素反応を行わせ、酵素反
応によって生成もしくは減少した成分を定量することに
よって、またはその成分を他の化合物に変換し、変換に
よる成分の変化を測定することによって、１,５−アン
ヒドログルシトールを定量できることは公知のことであ
る。

【００７１】本発明のマルトース、グルコースおよび標
的成分を含有する検体中の標的成分の定量について、マ
ルトースおよびグルコースの消去部分については前述の
マルトースおよびグルコースの消去方法およびそれに用
いる試薬とそれぞれ同一である。標的成分は検体中のマ
ルトースまたはグルコースの存在が標的成分の定量に影
響を与える可能性があるいかなる場合にも本発明を適用
することによって、それらの存在による影響を排除でき
る。

【００７２】本発明の各試薬は、凍結乾燥品を調製して
供給してもよいが、水等の水性媒体に溶解して供給して
もよい。

【００７３】定量分析の具体的操作 本発明の方法によって１,５−アンヒドログルシトール
の定量を行う場合、マルトースのグルコースへの変換反
応、グルコースの消去反応、１,５−アンヒドログルシ
トール６−リン酸化反応および、１,５−アンヒドログ
ルシトール−６−リン酸の脱水素反応を順次行わせ、得
られた反応液の特定の成分、例えば還元型補酵素を定量
することによって１,５−アンヒドログルシトールを定
量できる。

【００７４】より便利には、１,５−アンヒドログルシ
トール定量試薬キットを用い、第一試薬の酵素反応を行
わせ、ついで反応液に第二試薬を加えて酵素反応を行わ
せ、以下前記と同様にして反応液中の成分を定量するこ
とによって１,５−アンヒドログルシトールを定量でき
る。さらに便利には、キットの第一試薬に電子キャリヤ
ーを含有させ、第二試薬にテトラゾリウム塩を含有させ
た試薬キットを用い、第二試薬による酵素反応終了後の
反応液の吸光度を測定することによって１,５−アンヒ
ドログルシトールを簡単に定量できる。

【００７５】各反応は適当な水性媒体中に検体、試薬、
必要に応じてマグネシウム塩、酵素活性調節剤、安定化
剤、界面活性剤等の存在下に、１０〜５０℃で１〜３０
分間、好ましくは２０〜４０℃で２〜１０分間行われ
る。１,５−アンヒドログルシトールの定量に使用する
酸化型補酵素または１,５−アンヒドログルシトール−
６−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方は、グルコ
ース消去反応に影響しない範囲であらかじめグルコース
消去反応に共存させることができる。

【００７６】本発明に使用するα−グルコシダーゼ、マ
ルトース１−エピメラーゼ、マルトースホスホリラー
ゼ、ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼ例えばＡＤＰ依存性ヘ
キソキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソ
メラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、ムタロター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、１,５−ア
ンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、
ジアホラ−ゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダ−ゼおよびパー
オキシダーゼはいずれも公知の酵素であって市販されて
いてまたは容易に製造できる。

【００７７】ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼとしては、例
えばサーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litor
alis）またはピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus f
uriosus）由来の酵素が旭化成社より、ホスホヘキソー
スイソメラーゼはバチルス・ステアロサーモフィリウス
（Bacillus stearothermophilus）由来の酵素がユニチ
カ社より、６−ホスホフルクトキナーゼはバチルス・ス
テアロサーモフィリウス（Bacillus stearothermophilu
s）由来の酵素がユニチカ社より入手できる。

【００７８】１,５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼとしては、エッシェリヒア属に属
する微生物に由来する酵素として、エッシェリヒア・コ
リ（E. coli）・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来
の酵素が、特開平１０−８４９５３号公報の記載に従っ
て調製できる。

【００７９】反応液中の各酵素はα−グルコシダーゼは
０．５〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍ
ｌ、マルトース１エピメラーゼは０．５〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、好ましくは、１〜５０Ｕ／ｍｌ、マルトースホスホ
リラーゼは、１〜３００Ｕ／ｍｌ、好ましくは３〜１０
０Ｕ／ｍｌ、ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼは、０．５〜
１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌ、ヘキソ
キナーゼは１．０〜３００Ｕ／ｍｌ、好ましくは３〜１
００Ｕ／ｍｌ、ホスホヘキソースイソメラーゼは１〜３
００Ｕ／ｍｌ、好ましくは３〜１００Ｕ／ｍｌ、６−ホ
スホフルクトキナーゼは１〜３００Ｕ／ｍｌ、好ましく
は３〜１００Ｕ／ｍｌ、ムタロターゼは０．５〜１００
Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌ、グルコースオ
キシダーゼは１０〜２０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは２０
〜１０００Ｕ／ｍｌ、カタラーゼは１０〜２０００Ｕ／
ｍｌ、好ましくは２０〜１０００Ｕ／ｍｌ、１,５−ア
ンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼは
０．５〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌ
の濃度で用いられる。

【００８０】ＮＴＰ（ヌクレオシド三リン酸）の例は、
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、イノシン三リン酸、シ
チジン三リン酸、チアミン三リン酸、ウリジン三リン
酸、イノシン三リン酸を含み、ＡＴＰが好ましく用いら
れる。ＮＤＰ（ヌクレオシド二リン酸）の例は、アデノ
シン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸、シチジ
ン二リン酸、チアミン二リン酸、ウリジン二リン酸、イ
ノシン二リン酸を含み、ＡＤＰが好ましく用いられる。

【００８１】無機リンの例はリン酸、リン酸ナトリウ
ム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム等のリン酸塩
を含む。無機リンの例はリン酸、リン酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム、リン酸マグネシウム等のリン酸塩を含
む。酸化型補酵素としては、酸化型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、チオＮＡ
Ｄ、チオＮＡＤＰ等があげられる。

【００８２】無機リン、酸化型補酵素、ＮＴＰ、ＮＤＰ
は、反応液中に０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好まし
は０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌで用いられる。水性媒体と
しては、水、蒸留水、緩衝剤を含有する水溶液（緩衝
液）、生理食塩水等を例示できるが緩衝液が好ましい。
緩衝剤としては、例えば乳酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、
コハク酸塩、フタル酸塩、リン酸塩、トリエタノールア
ミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝
剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸
塩、シュウ酸塩、グリシン緩衝剤、ホウ酸塩、炭酸塩、
グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤、Ｎ−（２−アセタミ
ド）イミノ二酢酸緩衝剤（以下、ＡＤＡ緩衝剤と略する
こともある。）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（以下、ＴＡ
ＰＳと略することもある。）等があげられる。緩衝剤
は、反応液中に０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、好まし
くは１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。

【００８３】酵素活性調節剤としては、１,１０−フェ
ナントロリン等の金属キレート剤、マグネシウム、マン
ガン等の金属のイオン等があげらる。マグネシウムイオ
ンの供給源としては酢酸マグネシウムが用いられる。安
定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸等の金
属キレート、可溶性デンプン等の多糖類およびその誘導
体、アルブミン、グロブリン等の蛋白質、ポリエチレン
グリコール等の水溶性高分子化合物があげられる。

【００８４】界面活性剤としては、ポリオキシエチレン
オクチルフェニルエーテル（ノニオンＨＳ−２１０、日
本油脂社製）、３−［（３−クロラミドプロピル）ジメ
チルアミノ］プロパンスルホン酸、トリトンＸ−１０
０、ドデシル硫酸ナトリウム等があげられる。

【００８５】上述の１,５−アンヒドログルシトール定
量反応において、反応によって消費される成分または生
成される成分を定量する方法は、例えば、反応により生
成する還元型補酵素を直接３４０ｎｍ等の吸光度を測定
する方法、該還元型補酵素を他の物質に導いて定量する
方法等があげられる。

【００８６】還元型補酵素を他の物質に導く方法として
は、例えば、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ等の還元型補酵素
とテトラゾリウム塩とを、電子キャリアー、例えばジア
ホラーゼ（ＥＣ １．６．９９．１）、１−メトキシ−
５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート等の存在
下還元反応させて、生成されたホルマザン色素によって
着色した反応液の４３８ｎｍにおける吸光度を測定する
方法があげられる。

【００８７】テトラゾリウム塩としては、色原体として
使用できるものであれば特に制限はないが、感度の増幅
の観点から分子吸光係数が大きいものが好ましく、例え
ばインドニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）やニトロブル
ーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２−（４−ヨ−ドフェニ
ル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２,４−ジ
スルフォニル）−２Ｈ−テトラゾリウム,一ナトリウム
塩（以下、ＷＳＴ−１と略記することがある。）、２−
（４−ヨ−ドフェニル）−３−（２,４−ジニトロフェ
ニル）−５−（２,４−ジスルフェニル）−２Ｈ−テト
ラゾリウム,一ナトリウム塩（ＷＳＴ−３）、３,３'−
［３,３'−ジメトキシ−（１,１'−ビフェニル）４,４'
−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−
フェニル−２Ｈ テトラゾリウム（ＮＴＢ）、３−
（４,５−ジメチルチアゾ−ル−２−フェニル）−５−
（３−カ−ボキシメトキシフェニル）−２−（４−スル
フォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）等
があげられる。

【００８８】電子キャリアーの例はフェナジンメトサル
フェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジンメトサ
ルフェート、メルドラズブルーおよびジアホラーゼを含
む。ジアホラーゼ以外の電子キャリアーおよびテトラゾ
リウム塩は反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好
ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられ
る。

【００８９】ジアホラーゼは市販されていて、例えばバ
チルス・メガテリオウム（Bacillusmegaterium）由来の
酵素があげられ、反応液中、０．０１〜１００Ｕ／Ｌ、
好ましくは０．０５〜５０Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
反応は、１０〜５０℃で１〜３０分間、好ましくは２〜
１０分間行われる。本反応は、前述の１,５−アンヒド
ログルシトール−６−リン酸の脱水素反応が終了した後
行ってもよいが、同時に行うのが好ましい。

【００９０】また、還元型補酵素を他の物質に導びいて
定量する別の方法として、例えば、生成するＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ等の還元型補酵素を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダ
ーゼの作用によって酸化し、生成する過酸化水素と色源
体とをパーオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）の存
在下に反応させて、生成する色素によって着色した反応
液の吸光度を測定する方法があげられる。

【００９１】ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼおよびパーオ
キシダーゼは反応液中に、０．５〜１００Ｕ／ｍｌ、好
ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌの濃度で用いられる。色源体
は、例えば４−アミノアンチピリンと組合わせて用いら
れる色源体を用いることができるが、反応によって単独
で色素に変換される色源体が好ましい。単独で用いられ
る色源体としては、例えばビス［３−ビス（４−クロロ
フェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］ア
ミン（ＢＣＭＡ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニ
ル）−メチル−４−カルボキシエチルアミノフェニル］
アミン、１０−Ｎ−メチルカバモイル−３．７−ジメチ
ルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０
−Ｎ−カルボキシメチルカバモイル−３,７−ジメチル
アミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）等があげ
られる。

【００９２】また、４−アミノアンチピリンと組合わせ
て用いられる色源体としては、例えばＮ−エチル−Ｎ−
（３−メチルフェニル）−Ｎ'−サクシニルエチレンジ
アミン（ＥＭＳＥ）等があげられる。反応は、１０〜５
０℃で１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行う。以
下に具体的な実施例を挙げるが本発明はこれに限定され
るものではない。

【００９３】実施例における各略号の意味は以下に示さ
れる。 化合物 １,５−ＡＧ：１,５−アンヒドログルシトール Ｆ−１,６−２Ｐ：フルクトース−１,６−二リン酸

【００９４】酵素 α−ＧＨ：α−グルコシダーゼ ＡＧ６Ｐ―ＤＨ：１,５−アンヒドログルシトール−６
−リン酸デヒドロゲナーゼ ＡＤＰ−ＨＫ：ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ ＤＩＰ：ジアホラーゼ ＧＯＤ：グルコースオキシダーゼ ＨＫ：ヘキソキナーゼ ＭＥＲ：マルトース１−エピメラーゼ ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、 ＰＦＫ：６−ホスホフルクトキナーゼ ＰＧＩ：ホスホヘキソースイソメラーゼ、

【００９５】補酵素 ＡＤＰ：アデノシン二リン酸 ＡＴＰ：アデアデノシン三リン酸 ＮＡＤ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド ＮＡＤＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド ＮＡＤＰ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸 ＮＡＤＰＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸 ＮＤＰ：ヌクレオシド二リン酸 ＮＴＰ：ヌクレオシド三リン酸 以下に具体的な実施例を挙げるが本発明はこれに限定さ
れるものではない。

【００９６】

【実施例】実施例１ 下記組成の１,５−アンヒドログルシトール定量用試薬
を調製した。

【００９７】 試薬１ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ ７．０） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム ８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ（オリエンタル社製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ（オリエンタル社製） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ（協和発酵製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＧＩ（Bacillus stearothermophilus 由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＰＦＫ（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＤＩＰ（Clostridium ｓｐ．由来、東洋紡社製 ） ３ＫＵ／Ｌ ＡＤＰ−ＨＫ（Thermococcus litoralis由来、旭化成社製 ） １０ＫＵ／Ｌ α−ＧＨ（Bacillus stearothermophilus由来、東洋紡社製 ） ５ＫＵ／Ｌ

【００９８】 試薬２ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−１（同人化学社製） ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＧ６Ｐ−ＤＨ （E. coli・ＤＦ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来、旭化成社製）５０ＫＵ／Ｌ

【００９９】比較例１ 下記組成の１,５−アンヒドログルシトール定量用試薬
を調製した。

【０１００】 試薬１ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ ７．０） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム ８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ（オリエンタル社製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ（オリエンタル社製） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ（協和発酵製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＧＩ（Bacillus stearothermophilus 由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＰＦＫ（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＤＩＰ（Clostridium ｓｐ．由来、東洋紡社製 ） ３ＫＵ／Ｌ ＡＤＰ−ＨＫ（Thermococcus litoralis由来、旭化成社製 ） １０ＫＵ／Ｌ

【０１０１】 試薬２ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−１（同人化学社製） ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＧ６Ｐ−ＤＨ （E. coli・ＤＦ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来、旭化成社製）５０ＫＵ／Ｌ

【０１０２】実施例２ １,５−ＡＧを精製水に溶解し、０、１０、２０、３
０、４０および５０μｇ／ｍＬの標準液を作製した。該
試料０．０７５ｍＬに実施例１で製造した試薬１を２．
２５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例
１で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分
間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、検量線
を作成した。結果を図１に示す。

【０１０３】実施例１で調製した試薬を用いると、１,
５−ＡＧ濃度と吸光度がほぼ直線となる検量線が得られ
た。

【０１０４】実施例３ 試験管に実施例１の試薬１を２．２５ｍＬ分注し、
（ａ）精製水（ブランク）、（ｂ）１,５−ＡＧを２５
μｇ／ｍＬ含む溶液、（ｃ）マルトースを１０００ｍｇ
／ｄＬ含む溶液、または（ｄ）１,５−ＡＧを２５μｇ
／ｍＬとマルトース１０００ｍｇ／ｄＬを含む溶液を
０．０７５ｍＬ加えて３７℃で５分間加温後、実施例１
の試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分間反応さ
せ、４３８ｎｍで吸光度を測定した（実施例１の試
薬）。比較例１の試薬を用いて同様に試験した（比較例
１の試薬）。結果を第１表に示す。

【０１０５】

【表１】

【０１０６】第１表の結果が示すように、実施例１の試
薬を用いる本発明の方法では、（ｃ）溶液中のマルトー
スが消去され、（ａ）の精製水とほぼ同様の吸光度を示
し、（ｃ）−（ａ）の値はほぼ０となった。従って、
（ｂ）の１,５−ＡＧ（２５μｇ／ｍＬ）単独でも、
（ｄ）の１,５−ＡＧ（２５μｇ／ｍＬ）にマルトース
（１０００ｍｇ／ｄＬ）を含有する溶液でもほぼ同一の
吸光度が得られ、本発明の方法の有用性が示された。

【０１０７】これに対し比較例１の試薬（α−グルコシ
ダーゼを含有しない試薬）を用いる比較方法では、
（ｃ）の値が示すように検体中のマルトースの影響を受
け、マルトースを含む溶液中の１,５−ＡＧ濃度は正確
に測定することはできなかった。

【０１０８】実施例４ 試験管に実施例１の試薬１を２．２５ｍＬ分注し、
（ａ）精製水（ブランク）、（ｂ）グルコースを１００
０ｍｇ／ｄＬ含む水溶液または（ｃ）グルコース１００
０ｍｇ／ｄＬとマルトース５００ｍｇ／ｄＬとを含む水
溶液を０．０７５ｍＬ加えて３７℃で５分間加温後、試
薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分間反応させ、４
３８ｎｍで吸光度を測定した（実施例１の試薬）。ま
た、比較例１の試薬を用いて同様に試験した（比較例１
の試薬）。結果を第２表に示す。

【０１０９】

【表２】

【０１１０】第２表の結果が示すように、実施例１の試
薬を用いる本発明の方法では、（ｂ）溶液中のグルコー
ス（１０００ｍｇ／ｄＬ）および（ｃ）溶液中のグルコ
ース（１０００ｍｇ／ｄＬ）とマルトース（５００ｍｇ
／ｄＬ）が消去され、（ａ）の精製水とほぼ同様の吸光
度を示し、（ｂ）−（ａ）および（ｃ）−（ａ）の値は
ほぼ０となった。従って、本発明の試薬を用いると試料
中のグルコースおよびマルトースの影響を受けずに１,
５−ＡＧが測定できることが示される。

【０１１１】これに対し比較例１の試薬（α−グルコシ
ダーゼを含有しない試薬）を用いる比較方法では、
（ｃ）の値が示すように検体中のマルトースの影響を受
け、従ってマルトースを含む溶液中の１,５−ＡＧ濃度
は正確に測定することはできないことが判る。

【０１１２】実施例５ 第３表に示す濃度のマルトースと２５μg／ｍＬの１,５
−ＡＧを含む試料をそれぞれ調製した。該試料０．０７
５ｍＬに実施例１で製造した試薬１を２．２５ｍＬ加
え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例１で製造し
た試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分間反応させ
た後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、実施例２の検量線
を用いて１,５−ＡＧを定量した（実施例１の試薬）。
該試料を、比較例１の試薬を用いて同様に定量した（比
較例１の試薬）。結果を第３表に示す。

【０１１３】

【表３】

【０１１４】実施例１の試薬を使用することで、マルト
ースが１０００ｍｇ／ｄＬと高濃度含有する試料でも
１,５−ＡＧの濃度がほぼ正確に測定でき、マルトース
の影響率は最大１．２％であり測定値としては臨床検査
で十分に満足できるものであった。なお、影響率は次式
により求められる。

【０１１５】

【式１】

【０１１６】一方比較例１の試薬を用いると、マルトー
スの影響をうけ、１,５−ＡＧを正確に測定することは
できなかった。

【０１１７】実施例６ グルコース１０００ｍｇ／ｄＬと第４表に示す濃度のマ
ルトースとを含有する試料を調製した。該試料０．０７
５ｍＬに実施例１で製造した試薬１を２．２５ｍＬ加
え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例１で製造し
た試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分間反応させ
た後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、実施例２の検量線
を用いて、１,５−ＡＧを定量した（実施例１の試
薬）。該試料を、比較例１の試薬を用いて同様に定量し
た（比較例１の試薬）。結果を第４表に示す。

【０１１８】

【表４】

【０１１９】表４の結果から実施例１の試薬を用いる場
合は、グルコースとマルトースは殆どを消去され、１,
５−ＡＧの定量はグルコースおよびマルトースによって
殆ど影響されない。一方、比較例１の試薬は、試料中の
マルトースによって１,５−ＡＧの定量が大きく影響を
受ける試薬であることが判る。

【０１２０】実施例７ 下記の１,５−ＡＧ定量試薬を調製した。

【０１２１】 試薬１ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ ７．０） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム ８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ（オリエンタル社製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ（オリエンタル社製） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ（協和発酵製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＧＩ（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＰＦＫ（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＤＩＰ（Clostridium ｓｐ．由来、東洋紡社製 ） ３ＫＵ／Ｌ ＡＤＰ−ＨＫ（Thermococcus litoralis 由来、旭化成社製） １０ＫＵ／Ｌ ＭＥＲ（Lactobacillus brevis由来、キッコーマン社製） ２０ＫＵ／Ｌ ＭＰ（組換 E. coli由来、キッコーマン社製） １２ＫＵ／Ｌ

【０１２２】 試薬２ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−１（同人化学社製） ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＧ６Ｐ−ＤＨ （E. coli・ＤＦ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来、旭化成社製）５０ＫＵ／Ｌ

【０１２３】実施例８ １,５−ＡＧを精製水に溶解し、０、１０、２０、３
０、４０および５０μｇ／ｍＬの標準液を作製した。該
試料０．０７５ｍＬに実施例７で製造した試薬１を２．
２５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例
７で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分
間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、検量線
を作成した。結果を図２に示す。

【０１２４】実施例７で調製した試薬を用いると、１,
５−ＡＧ濃度と吸光度がほぼ直線となる検量線が得られ
た。

【０１２５】実施例９ 実施例７で製造した試薬１を２．２５ｍＬ分注し、
（ａ）精製水（ブランク）、（ｂ）１,５−ＡＧを２５
μｇ／ｍＬ含む溶液、（ｃ）マルトースを１０００ｍｇ
／ｄＬ含む溶液、または（ｄ）１,５−ＡＧを２５μｇ
／ｍＬとマルトース１０００ｍｇ／ｄＬを含む溶液を検
液とし、０．０７５ｍＬ加えて３７℃で５分間加温後、
実施例７で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさら
に５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。結
果を第５表に示す。

【０１２６】

【表５】

【０１２７】第５表の結果が示すように、本発明の方法
では（ｃ）検液中のマルトースが消去され、（ｃ）−
（ａ）の結果は理論通りほぼ０となった。また、（ｂ）
と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本発明の方法の有用性
が示された。

【０１２８】実施例１０ 第６表に示す濃度のマルトースと２５μg／ｍＬの１,５
−ＡＧとを含む試料をそれぞれ調製した。該試料０．０
７５ｍＬに実施例７で製造した試薬１を２．２５ｍＬ加
え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例７で製造し
た試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分間反応させ
た後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、実施例８で得られ
た検量線を用いて、１,５−ＡＧを定量した。結果を第
６表に示す。

【０１２９】

【表６】

【０１３０】実施例７の試薬を使用することで、マルト
ースが１０００ｍｇ／ｄＬと高濃度含有する試料でも
１,５−ＡＧの濃度がほぼ正確に測定でき、マルトース
の影響率は最大１．６％であり測定値としては臨床検査
で十分に満足できるものであった。

【０１３１】実施例１１ 下記の定量試薬を調製した。

【０１３２】 試薬１ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ ７．０） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム ８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ（オリエンタル社製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ（協和発酵製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＧＩ（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＰＦＫ（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＤＩＰ（Clostridium ｓｐ．由来、東洋紡社製） ３ＫＵ／Ｌ ＨＫ（Thermococcus litoralis由来、旭化成社製） １００ＫＵ／Ｌ α−ＧＨ（Bacillus stearothermophilus由来、東洋紡社製） ５ＫＵ／Ｌ

【０１３３】 試薬２ ＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−１（同人化学社製） ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＧ６Ｐ−ＤＨ （E. coli・ＤＦ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来、旭化成社製）５０ＫＵ／Ｌ

【０１３４】実施例１２ １,５−ＡＧを精製水に溶解し、０、５０、１００、１
５０、２００および２５０μｇ／ｍＬの標準液を作製し
た。該試料０．０７５ｍＬに実施例１１で製造した試薬
１を２．２５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その
後、実施例１１で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加し
てさらに５分間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測
定し、検量線を作成した。結果を図３に示す。

【０１３５】実施例１１で調製した試薬を用いると、
１,５−ＡＧ濃度と吸光度がほぼ直線となる検量線が得
られた。

【０１３６】実施例１３ 試験管に実施例１１の試薬１を２．２５ｍＬ分注し、
（ａ）精製水（ブランク）、（ｂ）１,５−ＡＧを２５
０μｇ／ｍＬ含む溶液、（ｃ）マルトースを１０００ｍ
ｇ／ｄＬ含む溶液、または（ｄ）１,５−ＡＧを２５０
μｇ／ｍＬとマルトース１０００ｍｇ／ｄＬを含む溶液
を０．０７５ｍＬ加えて３７℃で５分間加温後、実施例
１の試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分間反応さ
せ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。結果を第７表に示
す。

【０１３７】

【表７】

【０１３８】第７表の結果が示すように、実施例１１の
試薬を用いる本発明の方法では、（ｃ）溶液中のマルト
ースが消去され、（ａ）の精製水とほぼ同様の吸光度を
示し、（ｃ）−（ａ）の値はほぼ０となった。従って、
（ｂ）の１,５−ＡＧ（２５０μｇ／ｍＬ）単独でも、
（ｄ）の１,５−ＡＧ（２５０μｇ／ｍＬ）にマルトー
ス（１０００ｍｇ／ｄＬ）を含有する溶液でもほぼ同一
の吸光度が得られ、本発明の方法の有用性が示された。

【０１３９】実施例１４ 第８表に示す濃度のマルトースと２５０μg／ｍｌの１,
５−ＡＧを含む試料をそれぞれ調製した。該試料０．０
７５ｍＬに実施例１１で製造した試薬１を２．２５ｍＬ
加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例１１で製
造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分間反応
させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定した。結果を第８
表に示す。

【０１４０】

【表８】

【０１４１】実施例１１の試薬を使用することで、マル
トースが１０００ｍｇ／ｄＬと高濃度含有する試料でも
１,５−ＡＧの濃度がほぼ正確に測定でき、マルトース
の影響率は最大０．５％であり測定値としては臨床検査
で十分に満足できるものであった。

【０１４２】実施例１５ 下記の定量試薬を調製した。

【０１４３】 試薬１ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ ７．０） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム ８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ（オリエンタル社製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ（協和発酵製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＧＩ（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＰＦＫ（Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ５０ＫＵ／Ｌ ＤＩＰ（Clostridium ｓｐ．由来、東洋紡社製） ３ＫＵ／Ｌ ＨＫ（Thermococcus litoralis由来、旭化成社製） １００ＫＵ／Ｌ ＭＥＲ（Lactobacillus brevis由来、キッコーマン社製） ２０ＫＵ／Ｌ ＭＰ（組換 E. coli由来、キッコーマン社製） １２ＫＵ／Ｌ

【０１４４】 試薬２ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−１（同人化学社製） ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＧ６Ｐ−ＤＨ （E．coli・ＤＦ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来、旭化成社製）５０ＫＵ／Ｌ

【０１４５】実施例１６ １,５−ＡＧを精製水に溶解し、０、５０、１００、１
５０、２００および２５０μｇ／ｍＬの標準液を作製し
た。該試料０．０７５ｍＬに実施例１５で製造した試薬
１を２．２５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その
後、実施例１５で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加し
てさらに５分間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測
定し、検量線を作成した。結果を図４に示す。

【０１４６】実施例１５で調製した試薬を用いると、
１,５−ＡＧ濃度と吸光度がほぼ直線となる検量線が得
られた。

【０１４７】実施例１７ 実施例１５で製造した試薬１を２．２５ｍＬ分注し、
（ａ）精製水（ブランク）、（ｂ）１,５−ＡＧを２５
０μｇ／ｍＬ含む溶液、（ｃ）マルトースを１０００ｍ
ｇ／ｄＬ含む溶液、または（ｄ）１,５−ＡＧを２５０
μｇ／ｍＬとマルトース１０００ｍｇ／ｄＬを含む溶液
を検液とし、０．０７５ｍＬ加えて３７℃で５分間加温
後、実施例１５で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加し
てさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定し
た。結果を第９表に示す。

【０１４８】

【表９】

【０１４９】第９表の結果が示すように、本発明の方法
では（ｃ）検液中のマルトースが消去され、（ｃ）−
（ａ）の結果は理論通りほぼ０となった。また、（ｂ）
と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本発明の方法の有用性
が示された。

【０１５０】実施例１８ 第１０表に示す濃度のマルトースと２５０μg／ｍｌの
１,５−ＡＧとを含む試料をそれぞれ調製した。該試料
０．０７５ｍＬに実施例１５で製造した試薬１を２．２
５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例１
５で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分
間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、実施例
１６で得られた検量線を用いて、１,５−ＡＧを定量し
た。結果を第１０表に示す。

【０１５１】

【表１０】

【０１５２】実施例１５の試薬を使用することで、マル
トースが１０００ｍｇ／ｄＬと高濃度含有する試料でも
１,５−ＡＧの濃度がほぼ正確に測定でき、マルトース
の影響率は最大０．３％であり測定値としては臨床検査
で十分に満足できるものであった。

【０１５３】実施例１９ 下記の定量試薬を調製した。

【０１５４】 試薬１ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ ７．０） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム ８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ（オリエンタル社製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ（オリエンタル社製） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＩＰ（Clostridium ｓｐ．由来、東洋紡社製） ３ＫＵ／Ｌ α−ＧＨ（Bacillus stearothermophilus由来、東洋紡社製） ５ＫＵ／Ｌ ムタロターゼ（ブタ腎臓由来、オリエンタル社製） １０ＫＵ／Ｌ ＧＯＤ（Aspergillus ｓｐ.由来、東洋紡社製） ３００ＫＵ／Ｌ カタラーゼ（ウシ肝臓由来、シグマ社製） １００ＫＵ／Ｌ

【０１５５】 試薬２ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−１（同人化学社製） ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ−ＨＫ（Thermococcus litoralis由来、旭化成社製） ４０ＫＵ／Ｌ ＡＧ６Ｐ−ＤＨ （E. coli・ＤＦ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来、旭化成社製）５０ＫＵ／Ｌ

【０１５６】実施例２０ １,５−ＡＧを精製水に溶解し、０、１０、２０、３
０、４０および５０μｇ／ｍＬの標準液を作製した。該
試料０．０７５ｍＬに実施例１９で製造した試薬１を
２．２５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実
施例１９で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさら
に５分間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、
検量線を作成した。結果を図５に示す。

【０１５７】実施例１９で調製した試薬を用いると、
１,５−ＡＧ濃度と吸光度がほぼ直線となる検量線が得
られた。

【０１５８】実施例２１ 実施例１９で製造した試薬１を２．２５ｍＬ分注し、
（ａ）精製水（ブランク）、（ｂ）１,５−ＡＧを２５
μｇ／ｍＬ含む溶液、（ｃ）マルトースを４００ｍｇ／
ｄＬ含む溶液、または（ｄ）１,５−ＡＧを２５μｇ／
ｍＬとマルトース４００ｍｇ／ｄＬを含む溶液を検液と
し、０．０７５ｍＬ加えて３７℃で５分間加温後、実施
例１９で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに
５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。結果
を第１１表に示す。

【０１５９】

【表１１】

【０１６０】第１１表の結果が示すように、本発明の方
法では（ｃ）検液中のマルトースが消去され、（ｃ）−
（ａ）の結果は理論通りほぼ０となった。また、（ｂ）
と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本発明の方法の有用性
が示された。

【０１６１】実施例２２ 第１２表に示す濃度のマルトースと２５μg／ｍｌの１,
５−ＡＧとを含む試料をそれぞれ調製した。該試料０．
０７５ｍＬに実施例１９で製造した試薬１を２．２５ｍ
Ｌ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例１９で
製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分間反
応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、実施例２０
で得られた検量線を用いて、１,５−ＡＧを定量した。
結果を第１２表に示す。

【０１６２】

【表１２】

【０１６３】実施例１９の試薬を使用することで、マル
トースが４００ｍｇ／ｄＬと高濃度含有する試料でも
１,５−ＡＧの濃度がほぼ正確に測定でき、マルトース
の影響率は最大０．８％であり測定値としては臨床検査
で十分に満足できるものであった。

【０１６４】実施例２３ 下記の定量試薬を調製した。

【０１６５】 試薬１ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ ７．０） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム ８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ（オリエンタル社製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ（オリエンタル社製） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＩＰ（Clostridium ｓｐ．由来、東洋紡社製） ３ＫＵ／Ｌ ＭＥＲ（Lactobacillus brevis由来、キッコーマン社製） ２０ＫＵ／Ｌ ＭＰ（組換 Ｅ． ｃｏｌｉ由来、キッコーマン社製） １２ＫＵ／Ｌ ムタロターゼ（ブタ腎臓由来、オリエンタル社製） １０ＫＵ／Ｌ ＧＯＤ（Aspergillus ｓｐ.由来、東洋紡社製） ３００ＫＵ／Ｌ カタラーゼ（ウシ肝臓由来、ＳＩＧＭＡ社製） １００ＫＵ／Ｌ

【０１６６】 試薬２ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−１（同人化学社製） ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ−ＨＫ（Thermococcus litoralis由来、旭化成社製） ４０ＫＵ／Ｌ ＡＧ６Ｐ−ＤＨ （E. coli・ＤＦ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来、旭化成社製）５０ＫＵ／Ｌ

【０１６７】施例２４ １,５−ＡＧを精製水に溶解し、０、１０、２０、３
０、４０および５０μｇ／ｍＬの標準液を作製した。該
試料０．０７５ｍＬに実施例２３で製造した試薬１を
２．２５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実
施例２３で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさら
に５分間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、
検量線を作成した。結果を図６に示す。

【０１６８】実施例２３で調製した試薬を用いると、
１,５−ＡＧ濃度と吸光度がほぼ直線となる検量線が得
られた。

【０１６９】実施例２５ 実施例２３で製造した試薬１を２．２５ｍＬ分注し、
（ａ）精製水（ブランク）、（ｂ）１,５−ＡＧを２５
μｇ／ｍＬ含む溶液、（ｃ）マルトースを４００ｍｇ／
ｄＬ含む溶液、または（ｄ）１,５−ＡＧを２５μｇ／
ｍＬとマルトース４００ｍｇ／ｄＬを含む溶液を検液と
し、０．０７５ｍＬ加えて３７℃で５分間加温後、実施
例２３で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに
５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。結果
を第１３表に示す。

【０１７０】

【表１３】

【０１７１】第１３表の結果が示すように、本発明の方
法では（ｃ）検液中のマルトースが消去され、（ｃ）−
（ａ）の結果は理論通りほぼ０となった。また、（ｂ）
と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本発明の方法の有用性
が示された。

【０１７２】実施例２６ 第１４表に示す濃度のマルトースと２５μg／ｍＬの１,
５−ＡＧとを含む試料をそれぞれ調製した。該試料０．
０７５ｍＬに実施例２３で製造した試薬１を２．２５ｍ
Ｌ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例２３で
製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分間反
応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、実施例２４
で得られた検量線を用いて、１,５−ＡＧを定量した。
結果を第１４表に示す。

【０１７３】

【表１４】

【０１７４】実施例２３の試薬を使用することで、マル
トースが４００ｍｇ／ｄＬと高濃度含有する試料でも
１,５−ＡＧの濃度がほぼ正確に測定でき、マルトース
の影響率は最大１．６％であり測定値としては臨床検査
で十分に満足できるものであった。

【０１７５】実施例２７ 下記の定量試薬を調製した。

【０１７６】 試薬１ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ ７．０） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム ８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ（オリエンタル社製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ（協和発酵製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＩＰ（Clostridium ｓｐ．由来、東洋紡社製） ３ＫＵ／Ｌ α−ＧＨ（Bacillus stearothermophilus由来、東洋紡社製） ５ＫＵ／Ｌ ムタロターゼ（ブタ腎臓由来、オリエンタル社製） １０ＫＵ／Ｌ ＧＯＤ（ Aspergillus sp.由来、東洋紡社製） ３００ＫＵ／Ｌ カタラーゼ（Ｂｏｖｉｎ Ｌｉｖｅｒ由来、ＳＩＧＭＡ社製） １００ＫＵ／Ｌ

【０１７７】 試薬２ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−１（同人化学社製） ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＫ（Thermococcus litoralis由来、旭化成社製） ４００ＫＵ／Ｌ ＡＧ６Ｐ−ＤＨ （E．coli・ＤＦ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来、旭化成社製）５０ＫＵ／Ｌ

【０１７８】実施例２８ １,５−ＡＧを精製水に溶解し、０、５０、１００、１
５０、２００および２５０μｇ／ｍＬの標準液を作製し
た。該試料０．０７５ｍＬに実施例２７で製造した試薬
１を２．２５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その
後、実施例２７で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加し
てさらに５分間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測
定し、検量線を作成した。結果を図７に示す。

【０１７９】実施例２７で調製した試薬を用いると、
１,５−ＡＧ濃度と吸光度がほぼ直線となる検量線が得
られた。

【０１８０】実施例２９ 実施例２７で製造した試薬１を２．２５ｍＬ分注し、
（ａ）精製水（ブランク）、（ｂ）１,５−ＡＧを２５
０μｇ／ｍＬ含む溶液、（ｃ）マルトースを４００ｍｇ
／ｄＬ含む溶液、または（ｄ）１,５−ＡＧを２５０μ
ｇ／ｍＬとマルトース４００ｍｇ／ｄＬを含む溶液を検
液とし、０．０７５ｍＬ加えて３７℃で５分間加温後、
実施例２７で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさ
らに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。
結果を第１５表に示す。

【０１８１】

【表１５】

【０１８２】第１５表の結果が示すように、本発明の方
法では（ｃ）検液中のマルトースが消去され、（ｃ）−
（ａ）の結果は理論通りほぼ０となった。また、（ｂ）
と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本発明の方法の有用性
が示された。

【０１８３】実施例３０ 第１６表に示す濃度のマルトースと２５０μg／ｍｌの
１,５−ＡＧとを含む試料をそれぞれ調製した。該試料
０．０７５ｍＬに実施例２７で製造した試薬１を２．２
５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例２
７で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分
間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、実施例
２８で得られた検量線を用いて、１,５−ＡＧを定量し
た。結果を第１６表に示す。

【０１８４】

【表１６】

【０１８５】実施例２７の試薬を使用することで、マル
トースが４００ｍｇ／ｄＬと高濃度含有する試料でも
１,５−ＡＧの濃度がほぼ正確に測定でき、マルトース
の影響率は最大０．６％であり測定値としては臨床検査
で十分に満足できるものであった。

【０１８６】実施例３１ 下記の定量試薬を調製した。

【０１８７】 試薬１ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ ７．０） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム ８ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ（オリエンタル社製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ（協和発酵製） １０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＩＰ（Clostridium ｓｐ．由来、東洋紡社製） ３ＫＵ／Ｌ ＭＥＲ（Lactobacillus brevis由来、キッコーマン社製） ２０ＫＵ／Ｌ ＭＰ（組換 E． coli由来、キッコーマン社製） １２ＫＵ／Ｌ ムタロターゼ（ブタ腎臓由来、オリエンタル社製） １０ＫＵ／Ｌ ＧＯＤ（Aspergillus ｓｐ.由来、東洋紡社製） ３００ＫＵ／Ｌ カタラーゼ（ウシ肝臓由来、シグマ社製） １００ＫＵ／Ｌ

【０１８８】 試薬２ ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−１（同人化学社製） ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＫ（Thermococcus litoralis由来、旭化成社製） ４００ＫＵ／Ｌ ＡＧ６Ｐ−ＤＨ （E．coli・ＤＦ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来、旭化成社製）５０ＫＵ／Ｌ

【０１８９】実施例３２ １,５−ＡＧを精製水に溶解し、０、５０、１００、１
５０、２００および２５０μｇ／ｍＬの標準液を作製し
た。該試料０．０７５ｍＬに実施例３１で製造した試薬
１を２．２５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その
後、実施例３１で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加し
てさらに５分間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測
定し、検量線を作成した。結果を図８に示す。

【０１９０】実施例３１で調製した試薬を用いると、
１,５−ＡＧ濃度と吸光度がほぼ直線となる検量線が得
られた。

【０１９１】実施例３３ 実施例３１で製造した試薬１を２．２５ｍＬ分注し、
（ａ）精製水（ブランク）、（ｂ）１,５−ＡＧを２５
０μｇ／ｍＬ含む溶液、（ｃ）マルトースを４００ｍｇ
／ｄＬ含む溶液、または（ｄ）１,５−ＡＧを２５０μ
ｇ／ｍＬとマルトース４００ｍｇ／ｄＬを含む溶液を検
液とし、０．０７５ｍＬ加えて３７℃で５分間加温後、
実施例３１で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさ
らに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。
結果を第１７表に示す。

【０１９２】

【表１７】

【０１９３】第１７表の結果が示すように、本発明の方
法では（ｃ）検液中のマルトースが消去され、（ｃ）−
（ａ）の結果は理論通りほぼ０となった。また、（ｂ）
と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本発明の方法の有用性
が示された。

【０１９４】実施例３４ 第１８表に示す濃度のマルトースと２５０μg／ｍｌの
１,５−ＡＧとを含む試料をそれぞれ調製した。該試料
０．０７５ｍＬに実施例３１で製造した試薬１を２．２
５ｍＬ加え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例３
１で製造した試薬２を０．７５ｍＬ添加してさらに５分
間反応させた後、４３８ｎｍで吸光度を測定し、実施例
３２で得られた検量線を用いて、１,５−ＡＧを定量し
た。結果を第１８表に示す。

【０１９５】

【表１８】

【０１９６】実施例３１の試薬を使用することで、マル
トースが４００ｍｇ／ｄＬと高濃度含有する試料でも
１,５−ＡＧの濃度がほぼ正確に測定でき、マルトース
の影響率は最大０．３％であり測定値としては臨床検査
で十分に満足できるものであった。

【０１９７】

【発明の効果】本発明によれば、検体中にマルトースお
よびグルコースが高濃度に存在していても、該マルトー
スおよびグルコースを酵素的に消去でき、次いで、１,
５−アンヒドログルシトールを１,５−アンヒドログル
シトール６−リン酸化酵素および１,５−アンヒドログ
ルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いて酵素
処理し、反応液中の成分を定量することによって正確に
１,５−アンヒドログルシトールを定量することができ
る。

【０１９８】さらにα−グルコシダーゼが用いる酵素、
特に１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼに付随して存在する可能性が多い場合であ
っても、また、検体中にマルトースをグルコースに変換
する活性を有する物質が存在していても、それらの基質
であるマルトースが先に消去されているので、α−グル
コシダーゼの影響を受けることなく、１,５−アンヒド
ログルシトールを定量することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で製造した試薬を用いた１，５−ア
ンヒドログルシトールの検量線を示す。横軸は１，５−
アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、縦
軸は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

【図２】 実施例７で製造した試薬を用いた１，５−ア
ンヒドログルシトールの検量線を示す。横軸は１，５−
アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、縦
軸は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

【図３】 実施例１１で製造した試薬を用いた１，５−
アンヒドログルシトールの検量線を示す。横軸は１，５
−アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、
縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

【図４】 実施例１５で製造した試薬を用いた１，５−
アンヒドログルシトールの検量線を示す。横軸は１，５
−アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、
縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

【図５】 実施例１９で製造した試薬を用いた１，５−
アンヒドログルシトールの検量線を示す。横軸は１，５
−アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、
縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

【図６】 実施例２３で製造した試薬を用いた１，５−
アンヒドログルシトールの検量線を示す。横軸は１，５
−アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、
縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

【図７】 実施例２７で製造した試薬を用いた１，５−
アンヒドログルシトールの検量線を示す。横軸は１，５
−アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、
縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

【図８】 実施例３１で製造した試薬を用いた１，５−
アンヒドログルシトールの検量線を示す。横軸は１，５
−アンヒドログルシトール濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、
縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/533 Ｃ１２Ｑ 1/533 1/54 1/54 // Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｄ 9/08 9/08 9/12 9/12 9/26 9/26 Ｚ 9/90 9/90 (72)発明者 三池 彰 静岡県駿東郡長泉町南一色字上山地600番 １ 協和メデックス株式会社協和メデック ス研究所内 Ｆターム(参考） 4B050 CC08 DD02 LL05 4B063 QA01 QQ68 QR02 QR03 QR04 QR07 QR08 QR15 QR19 QS02 QX01

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １,５−アンヒドログルシトール、マル
   トースおよびグルコースを含有する検体中のマルトース
   を、マルトースをグルコースに変換できる酵素システム
   〔以下酵素システム（Ａ）という〕によってグルコース
   に変換し、グルコースを、１,５−アンヒドログルシト
   ール６−リン酸化酵素システムによってリン酸化されず
   且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒ
   ドロゲナーゼによって脱水素されない化合物に変換し得
   る酵素システム〔以下酵素システム（Ｂ）という〕によ
   って該化合物に変換し、１,５−アンヒドログルシトー
   ルを１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素
   システムによって１,５−アンヒドログルシトール−６
   −リン酸に変換し、１,５−アンヒドログルシトール−
   ６−リン酸を酸化型補酵素の存在下１,５−アンヒドロ
   グルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼによって脱
   水素し、反応液中の脱水素反応によって生成した成分ま
   たは減少した成分を定量することを特徴とする１,５−
   アンヒドログルシトールの定量方法。
2. 【請求項２】 １,５−アンヒドログルシトール６−リ
   ン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴ
   Ｐ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）
   ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからなる群か
   ら選択される請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 酵素システム（Ａ）が（イ）α−グルコ
   シダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホリラ
   ーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリラー
   ゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群から選
   択される請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 酵素システム（Ｂ）が（イ）グルコース
   ６−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメラ
   ーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ、
   （ロ）グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコースオキ
   シダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオキシ
   ダーゼおよびカタラーゼ、および（ホ）グルコースオキ
   シダーゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる群か
   ら選択される請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 １,５−アンヒドログルシトール６−リ
   ン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴ
   Ｐ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）
   ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからなる群か
   ら選択され、酵素システム（Ａ）が（イ）α−グルコシ
   ダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホリラー
   ゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリラーゼ
   およびマルトース１−エピメラーゼからなる群から選択
   され、酵素システム（Ｂ）が（イ）グルコース６−リン
   酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６
   −ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ,（ロ）グルコ
   ースオキシダーゼ、（ハ）グルコースオキシダーゼおよ
   びムタロターゼ、（ニ）グルコースオキシダーゼおよび
   カタラーゼ、および（ホ）グルコースオキシダーゼ、ム
   タロターゼおよびカタラーゼからなる群から選択される
   請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 グルコース６−リン酸化酵素システムが
   （イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキナ
   ーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキ
   ナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される請求項４
   または５記載の方法。
7. 【請求項７】 １,５−アンヒドログルシトール−６−
   リン酸デヒドロゲナーゼが、エシェリヒア属に属する微
   生物由来の酵素である請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 該生成した成分が還元型補酵素であっ
   て、還元型補酵素の定量が、脱水素反応における反応液
   の吸光度を測定することにより行われる請求項１記載の
   方法。
9. 【請求項９】 該生成した成分が還元型補酵素であっ
   て、補酵素の定量が還元型補酵素とテトラゾリウム塩と
   を電子キャリヤーの存在下に反応させて、生成するホル
   マザン色素によって着色した反応液の吸光度を測定する
   ことにより行われる請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 マルトースをグルコースに変換できる
    酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグルコース
    への変換試薬、グルコースを、１,５−アンヒドログル
    シトール６−リン酸化酵素によってリン酸化されず且つ
    １,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロ
    ゲナーゼによって脱水素されない化合物に変換し得る酵
    素システム（Ｂ）を含有するグルコースの消去試薬、
    １,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素シス
    テムを含有する１,５−アンヒドログルシトールの１,５
    −アンヒドログルシトール−６−リン酸への変換試薬お
    よび１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒ
    ドロゲナーゼおよび酸化型補酵素を含有する１,５−ア
    ンヒドログルシトール−６−リン酸の脱水素試薬を含有
    する１,５−アンヒドログルシトールの定量試薬。
11. 【請求項１１】 １,５−アンヒドログルシトール６−
    リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼおよびＮ
    ＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および
    （ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからな
    る群から選択される請求項１０記載の試薬。
12. 【請求項１２】 酵素システム（Ａ）が（イ）α−グル
    コシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホリ
    ラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリラ
    ーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群から
    選択される請求項１０記載の試薬。
13. 【請求項１３】 酵素システム（Ｂ）が（イ）グルコー
    ス６−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメ
    ラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ、
    （ロ）グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコースオキ
    シダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオキシ
    ダーゼおよびカタラーゼ、および（ホ）グルコースオキ
    シダーゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる群か
    ら選択される請求項１０記載の試薬。
14. 【請求項１４】 １,５−アンヒドログルシトール６−
    リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼおよびＮ
    ＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および
    （ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからな
    る群から選択され、酵素システム（Ａ）が（イ）α−グ
    ルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホ
    リラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリ
    ラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群か
    ら選択され、酵素システム（Ｂ）が（イ）グルコース６
    −リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメラー
    ゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）
    グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコースオキシダー
    ゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオキシダーゼ
    およびカタラーゼおよび（ホ）グルコースオキシダー
    ゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる群から選択
    される請求項１０記載の試薬。
15. 【請求項１５】 グルコース６−リン酸化酵素システム
    が（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキ
    ナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソ
    キナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される請求項
    １３または１４記載の試薬。
16. 【請求項１６】 １,５−アンヒドログルシトール−６
    −リン酸デヒドロゲナーゼが、エシェリヒア属に属する
    微生物由来の酵素である請求項１０記載の試薬。
17. 【請求項１７】 マルトースをグルコースに変換できる
    酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグルコース
    への変換試薬、グルコースを、１,５−アンヒドログル
    シト−ル６−リン酸化酵素システムによってリン酸化さ
    れず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸
    デヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物に変換
    できる酵素システム（Ｂ）を含有するグルコースの消去
    試薬および１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸
    化酵素システムを含有する１,５−アンヒドログルシト
    ールの１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸へ
    の変換試薬からなる第一試薬および１,５−アンヒドロ
    グルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび酸化
    型補酵素を含有する１,５−アンヒドログルシトール−
    ６−リン酸の脱水素試薬からなる第二試薬からなる１,
    ５−アンヒドログルシトールの定量試薬キット。
18. 【請求項１８】 マルトースをグルコースに変換できる
    酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグルコース
    への変換試薬およびグルコースを、１,５−アンヒドロ
    グルシトール６−リン酸化酵素システムによってリン酸
    化されず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−リ
    ン酸デヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物に
    変換できる酵素システム（Ｂ）を含有するグルコースの
    消去試薬からなる第一試薬および１,５−アンヒドログ
    ルシトール６−リン酸化酵素システムを含有する１,５
    −アンヒドログルシトールの１,５−アンヒドログルシ
    トール−６−リン酸への変換試薬および１,５−アンヒ
    ドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび
    酸化型補酵素を含有する１,５−アンヒドログルシトー
    ル−６−リン酸の脱水素試薬からなる第二試薬からなる
    １,５−アンヒドログルシトールの定量試薬キット。
19. 【請求項１９】 マルトースをグルコースに変換できる
    酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグルコース
    への変換試薬、グルコースを１,５−アンヒドログルシ
    トール６−リン酸化酵素システムによってリン酸化され
    ず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デ
    ヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物に変換で
    きる酵素システム（Ｂ）を含有するグルコースの消去試
    薬、１,５−アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素
    システムを含有する１,５−アンヒドログルシトールの
    １,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸への変換
    試薬および酸化型補酵素を含有する第一試薬および１,
    ５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナ
    ーゼを含有する第二試薬からなる１,５−アンヒドログ
    ルシトールの定量試薬キット。
20. 【請求項２０】 マルトースをグルコースに変換できる
    酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグルコース
    への変換試薬、グルコースを１,５−アンヒドログルシ
    トール６−リン酸化酵素システムによってリン酸化され
    ず且つ１,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デ
    ヒドロゲナーゼによって脱水素されない化合物に変換で
    きる酵素システム（Ｂ）を含有するグルコースの消去試
    薬および酸化型補酵素を含有する第一試薬および１,５
    −アンヒドログルシトール６−リン酸化酵素システムを
    含有する１,５−アンヒドログルシトールの１,５−アン
    ヒドログルシトール−６−リン酸への変換試薬および
    １,５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロ
    ゲナーゼを含有する第二試薬からなる１,５−アンヒド
    ログルシトールの定量試薬キット。
21. 【請求項２１】 マルトースをグルコースに変換できる
    酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグルコース
    への変換試薬、（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、
    （ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤ
    Ｐ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからなる群から選
    択される一つ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホ
    スホフルクトキナーゼおよびＮＴＰを含有するグルコー
    スの消去および１,５−アンヒドログルシトールの１,５
    −アンヒドログルシトール−６−リン酸への変換試薬お
    よび酸化型補酵素を含有する第一試薬および１,５−ア
    ンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを
    含有する第二試薬からなる１,５−アンヒドログルシト
    ールの定量試薬キット。
22. 【請求項２２】 マルトースをグルコースに変換できる
    酵素システム（Ａ）を含有するマルトースのグルコース
    への変換試薬、（ロ）グルコースオキシダーゼ、（ハ）
    グルコースオキシダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グ
    ルコースオキシダーゼおよびカタラーゼ、および（ホ）
    グルコースオキシダーゼ、ムタロターゼおよびカタラー
    ゼからなる群から選択される酵素システム（Ｂ）を含有
    するグルコースの消去試薬、ＮＴＰまたはＮＤＰおよび
    酸化型補酵素からなる第一試薬および１,５−アンヒド
    ログルシトール６−リン酸化酵素および１,５−アンヒ
    ドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼからな
    る第二試薬からなる１,５−アンヒドログルシトールの
    定量試薬キット。
23. 【請求項２３】 １,５−アンヒドログルシトール６−
    リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼおよびＮ
    ＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および
    （ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからな
    る群から選択される請求項１７〜２０のいずれか１項に
    記載の試薬キット。
24. 【請求項２４】 酵素システム（Ａ）が（イ）α−グル
    コシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホリ
    ラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリラ
    ーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群から
    選択される請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の試
    薬キット。
25. 【請求項２５】 酵素システム（Ｂ）が（イ）グルコー
    ス６−リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメ
    ラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ,
    （ロ）グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコースオキ
    シダーゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオキシ
    ダーゼおよびカタラーゼ、および（ホ）グルコースオキ
    シダーゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる群か
    ら選択される請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の
    試薬キット。
26. 【請求項２６】 １,５−アンヒドログルシトール６−
    リン酸化酵素システムが（イ）ヘキソキナーゼおよびＮ
    ＴＰ、（ロ）グルコキナーゼおよびＮＴＰ、および
    （ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびＮＤＰからな
    る群から選択され、酵素システム（Ａ）が（イ）α−グ
    ルコシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホ
    リラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリ
    ラーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群か
    ら選択され、酵素システム（Ｂ）が（イ）グルコース６
    −リン酸化酵素システム、ホスホヘキソースイソメラー
    ゼ、６−ホスホフルクトキナーゼおよびＮＴＰ,（ロ）
    グルコースオキシダーゼ、（ハ）グルコースオキシダー
    ゼおよびムタロターゼ、（ニ）グルコースオキシダーゼ
    およびカタラーゼ、および（ホ）グルコースオキシダー
    ゼ、ムタロターゼおよびカタラーゼからなる群から選択
    される請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の試薬キ
    ット。
27. 【請求項２７】 グルコース６−リン酸化酵素システム
    が（イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキ
    ナーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソ
    キナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される請求項
    ２５または２６記載の試薬キット。
28. 【請求項２８】 １,５−アンヒドログルシトール−６
    −リン酸デヒドロゲナーゼが、エシェリヒア属に属する
    微生物由来の酵素である請求項１７〜２０のいずれか１
    項に記載の試薬キット。
29. 【請求項２９】 第一試薬にさらに電子キャリアーが含
    まれ、第二試薬にさらにテトラゾリウム塩が含まれる請
    求項１７〜２８のいずれか１項に記載の試薬キット。
30. 【請求項３０】 マルトースおよびグルコースを含有す
    る検体中のマルトースを、マルトースをグルコースに変
    換できる酵素システム（Ａ）によってグルコースに変換
    し、グルコースを、グルコース６−リン酸化酵素システ
    ム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルク
    トキナーゼおよびＮＴＰを用いてフルクトースー１,６
    −二リン酸に変換することを特徴とするマルトースおよ
    びグルコースの消去方法。
31. 【請求項３１】 該方法が、１,５−アンヒドログルシ
    トール、マルトースおよびグルコースを含有する検体中
    の１,５−アンヒドログルシトールを酵素を用いて定量
    する方法において行われる請求項３０記載の方法。
32. 【請求項３２】 酵素システム（Ａ）が（イ）α−グル
    コシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホリ
    ラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリラ
    ーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群から
    選択され、グルコース６−リン酸化酵素システムが
    （イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキナ
    ーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキ
    ナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される請求項３
    ０または３１記載の方法。
33. 【請求項３３】 マルトースをグルコースに変換できる
    酵素システム（Ａ）、グルコース６−リン酸化酵素シス
    テム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフル
    クトキナーゼおよびＮＴＰを含有することを特徴とする
    マルトースおよびグルコースの消去試薬。
34. 【請求項３４】 該試薬が、１,５−アンヒドログルシ
    トールを酵素を用いて定量する際に使用するための試薬
    である請求項３２記載の試薬。
35. 【請求項３５】 酵素システム（Ａ）が（イ）α−グル
    コシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホリ
    ラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリラ
    ーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群から
    選択され、グルコース６−リン酸化酵素システムが
    （イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキナ
    ーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキ
    ナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される請求項３
    ３または３４記載の試薬。
36. 【請求項３６】 マルトースおよびグルコースを含有す
    る検体中のマルトースを、マルトースをグルコースに変
    換できる酵素システム（Ａ）によってグルコースに変換
    し、グルコースを、グルコース６−リン酸化酵素システ
    ム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルク
    トキナーゼおよびＮＴＰを用いてフルクトースー１,６
    −二リン酸に変換し、ついで検体中の標的成分を酵素を
    用いて定量することを特徴とする標的成分の定量方法。
37. 【請求項３７】 酵素システム（Ａ）が（イ）α−グル
    コシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホリ
    ラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリラ
    ーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群から
    選択され、グルコース６−リン酸化酵素システムが
    （イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキナ
    ーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキ
    ナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される請求項３
    ６記載の方法。
38. 【請求項３８】 マルトースをグルコースに変換できる
    酵素システム（Ａ）、グルコース６−リン酸化酵素シス
    テム、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフル
    クトキナーゼおよびＮＴＰを含有するマルトースおよび
    グルコースの消去試薬および標的成分に作用する酵素お
    よびその酵素反応に必要な成分を含有する標的成分の定
    量試薬。
39. 【請求項３９】 酵素システム（Ａ）が（イ）α−グル
    コシダーゼ、（ロ）無機リンおよびマルトースホスホリ
    ラーゼ、および（ハ）無機リン、マルトースホスホリラ
    ーゼおよびマルトース１−エピメラーゼからなる群から
    選択され、グルコース６−リン酸化酵素システムが
    （イ）ヘキソキナーゼおよびＮＴＰ、（ロ）グルコキナ
    ーゼおよびＮＴＰ、および（ハ）ＮＤＰ依存性ヘキソキ
    ナーゼおよびＮＤＰからなる群から選択される請求項３
    ８記載の試薬。