JPH11195A - クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 - Google Patents
クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子Info
- Publication number
- JPH11195A JPH11195A JP9139289A JP13928997A JPH11195A JP H11195 A JPH11195 A JP H11195A JP 9139289 A JP9139289 A JP 9139289A JP 13928997 A JP13928997 A JP 13928997A JP H11195 A JPH11195 A JP H11195A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- creatine kinase
- analytical element
- isozyme
- dry analytical
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 常温保存でも感度低下が少なく、従って常温
での保存が可能なクレアチンキナーゼあるいはクレアチ
ンキナーゼＭＢアイソザイムの定量用の乾式分析素子を
提供すること。 【解決手段】 支持体上に、クレアチンキナーゼの存在
下で、ＡＴＰを生成するクレアチンリン酸とＡＤＰ、そ
してそのＡＴＰの生成のためのｐＨ環境を提供する緩衝
性化合物を含有し、更に、生成したＡＴＰとの反応によ
り分光的測定方法で検出が可能な化合物を生成させる指
示薬組成物を含有する検出試薬層を積層したクレアチン
キナーゼ定量用乾式分析素子であって、その緩衝性化合
物がスルホン酸基を有する化合物であることを特徴とす
る分析素子。クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性
を特異的に阻害する抗体を組合せることによってクレア
チンキナーゼＭＢアイソザイムの定量も可能となる。
での保存が可能なクレアチンキナーゼあるいはクレアチ
ンキナーゼＭＢアイソザイムの定量用の乾式分析素子を
提供すること。 【解決手段】 支持体上に、クレアチンキナーゼの存在
下で、ＡＴＰを生成するクレアチンリン酸とＡＤＰ、そ
してそのＡＴＰの生成のためのｐＨ環境を提供する緩衝
性化合物を含有し、更に、生成したＡＴＰとの反応によ
り分光的測定方法で検出が可能な化合物を生成させる指
示薬組成物を含有する検出試薬層を積層したクレアチン
キナーゼ定量用乾式分析素子であって、その緩衝性化合
物がスルホン酸基を有する化合物であることを特徴とす
る分析素子。クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性
を特異的に阻害する抗体を組合せることによってクレア
チンキナーゼＭＢアイソザイムの定量も可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、クレアチンキナー
ゼの定量用またはクレアチンキナーゼのＭＢアイソザイ
ムの定量用の乾式分析素子に関する。
ゼの定量用またはクレアチンキナーゼのＭＢアイソザイ
ムの定量用の乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】被験者から採取した血液に含まれている
クレアチンキナーゼ（ＣＫ、クレアチンホスホキナーゼ
（ＣＰＫ）とも云われる）を定量することにより、進行
性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断が可能なこ
とは以前より知られており、臨床検査に利用されてい
る。また、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）には、クレアチ
ンキナーゼＭＭ（ＣＫＭＭ）、クレアチンキナーゼＭＢ
（ＣＫＭＢ）、そしてクレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢ
Ｂ）という三種のアイソザイムが存在すること、そして
ＣＫＭＭは主として骨格筋中に、ＣＫＭＢは主として心
筋中に、そしてＣＫＢＢは主として脳や脊髄中に存在す
ることも知られている。さらにＣＫＭＢは、心筋梗塞症
が発生すると、心筋より血液中に排出され、その結果、
血液中のＣＫＭＢ量が増加することも判明している。従
って、被験者の血液中のＣＫＭＢの定量は、心筋梗塞症
の発生の有無を検査するために有力な手段とされてい
る。
クレアチンキナーゼ（ＣＫ、クレアチンホスホキナーゼ
（ＣＰＫ）とも云われる）を定量することにより、進行
性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断が可能なこ
とは以前より知られており、臨床検査に利用されてい
る。また、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）には、クレアチ
ンキナーゼＭＭ（ＣＫＭＭ）、クレアチンキナーゼＭＢ
（ＣＫＭＢ）、そしてクレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢ
Ｂ）という三種のアイソザイムが存在すること、そして
ＣＫＭＭは主として骨格筋中に、ＣＫＭＢは主として心
筋中に、そしてＣＫＢＢは主として脳や脊髄中に存在す
ることも知られている。さらにＣＫＭＢは、心筋梗塞症
が発生すると、心筋より血液中に排出され、その結果、
血液中のＣＫＭＢ量が増加することも判明している。従
って、被験者の血液中のＣＫＭＢの定量は、心筋梗塞症
の発生の有無を検査するために有力な手段とされてい
る。
【０００３】上記のように、臨床検査に於て、クレアチ
ンキナーゼを定量（すなわち、総クレアチンキナーゼを
定量）すること、及び／又はクレアチンキナーゼＭＢア
イソザイムを定量することによって、被験者についての
進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断に有力
な手掛かりを得ることができるため、従来より、それら
の定量方法についての研究が進められ、現在では精度の
高い定量方法が確立されている。
ンキナーゼを定量（すなわち、総クレアチンキナーゼを
定量）すること、及び／又はクレアチンキナーゼＭＢア
イソザイムを定量することによって、被験者についての
進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断に有力
な手掛かりを得ることができるため、従来より、それら
の定量方法についての研究が進められ、現在では精度の
高い定量方法が確立されている。
【０００４】すなわち、クレアチンキナーゼの測定方法
としては、被験者から採取した血液から血清あるいは血
漿を得て、この血清や血漿中に含まれるクレアチンキナ
ーゼの酵素活性を利用することにより、分光的方法によ
り検出できる化学種を定量的に生成させ、その化学種の
生成量から、血清あるいは血漿中のクレアチンキナーゼ
の存在量を定量する方法である。さらに詳しく云えば、
この定量方法に利用される検出反応系は次の二つに分け
ることができる。
としては、被験者から採取した血液から血清あるいは血
漿を得て、この血清や血漿中に含まれるクレアチンキナ
ーゼの酵素活性を利用することにより、分光的方法によ
り検出できる化学種を定量的に生成させ、その化学種の
生成量から、血清あるいは血漿中のクレアチンキナーゼ
の存在量を定量する方法である。さらに詳しく云えば、
この定量方法に利用される検出反応系は次の二つに分け
ることができる。
【０００５】１）検出反応系１ クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤ
Ｐ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域にて緩衝能を示す
緩衝性化合物を用いて酵素反応のｐＨ環境を調整しなが
ら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチン
キナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そ
のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡ
ＴＰとグルコース（Ｇｌｕ）とをヘキソキナーゼ（Ｈ
Ｋ）の存在下に反応させてグルコース−６−リン酸（Ｇ
６Ｐ）を生成させ、次にこのＧ６Ｐをニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤ
（Ｐ））と、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（Ｇ６ＰＤＨ）の存在下に反応させてニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（リン酸）還元型（ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ）を生成させ、最後に、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量
を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を
利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法
である。
Ｐ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域にて緩衝能を示す
緩衝性化合物を用いて酵素反応のｐＨ環境を調整しなが
ら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチン
キナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そ
のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡ
ＴＰとグルコース（Ｇｌｕ）とをヘキソキナーゼ（Ｈ
Ｋ）の存在下に反応させてグルコース−６−リン酸（Ｇ
６Ｐ）を生成させ、次にこのＧ６Ｐをニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤ
（Ｐ））と、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（Ｇ６ＰＤＨ）の存在下に反応させてニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（リン酸）還元型（ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ）を生成させ、最後に、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量
を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を
利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法
である。
【０００６】なお、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分光的定
量の精度が充分でない傾向があるため、そのＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを更にテトラゾリウム塩と反応させてホルマザ
ン色素を生成させて、そのホルマザン色素の生成量を定
量することによって、被検液中のクレアチンキナーゼを
定量する方法も既に開発されている（特開昭６３−３２
４９９号公報参照）。この検出反応系１を反応式により
次に示す。
量の精度が充分でない傾向があるため、そのＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを更にテトラゾリウム塩と反応させてホルマザ
ン色素を生成させて、そのホルマザン色素の生成量を定
量することによって、被検液中のクレアチンキナーゼを
定量する方法も既に開発されている（特開昭６３−３２
４９９号公報参照）。この検出反応系１を反応式により
次に示す。
【０００７】 ＣＰ ＋ ＡＤＰ → ＡＴＰ ＋ クレアチン （ＣＫ存在下） ＡＴＰ ＋ Ｇｌｕ → Ｇ６Ｐ ＋ ＡＤＰ （ＨＫ存在下） Ｇ６Ｐ ＋ ＮＡＤ（Ｐ） → ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ＋ ６−ホスフォグルコン酸 （Ｇ６ＰＤＨ存在下） ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ＋ テトラゾリウム塩 → ホルマザン色素 ＋ ＮＡＤ（Ｐ）
【０００８】２）検出反応系２ クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤ
Ｐ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を
示す緩衝性化合物にて酵素反応のｐＨ環境を調整しなが
ら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチン
キナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そ
のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡ
ＴＰとグリセロールとをグリセロールキナーゼ（ＨＫ）
の存在下に反応させてＬ−α−グリセロリン酸を生成さ
せ、次にこのＬ−α−グリセロリン酸をＬ−α−グリセ
ロリン酸オキシダーゼの存在下に酸素と反応させて過酸
化水素を発生させ、最後に過酸化水素とロイコ色素とを
反応させて青色の色素を生成させ、この青色色素の生成
量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線
を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方
法である。この検出反応系２を反応式により次に示す。
Ｐ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を
示す緩衝性化合物にて酵素反応のｐＨ環境を調整しなが
ら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチン
キナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そ
のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡ
ＴＰとグリセロールとをグリセロールキナーゼ（ＨＫ）
の存在下に反応させてＬ−α−グリセロリン酸を生成さ
せ、次にこのＬ−α−グリセロリン酸をＬ−α−グリセ
ロリン酸オキシダーゼの存在下に酸素と反応させて過酸
化水素を発生させ、最後に過酸化水素とロイコ色素とを
反応させて青色の色素を生成させ、この青色色素の生成
量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線
を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方
法である。この検出反応系２を反応式により次に示す。
【０００９】 ＣＰ ＋ ＡＤＰ → ＡＴＰ ＋ クレアチン （ＣＫ存在下） ＡＴＰ ＋ グリセロール → Ｌ−α−グリセロリン酸 ＋ ＡＤＰ （グリセロールキナーゼ存在下） Ｌ−α−グリセロリン酸 ＋ Ｏ2 → Ｈ2 Ｏ2 ＋ ジヒドロキシアセトリン酸 （Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの存在下） Ｈ2 Ｏ2 ＋ ロイコ色素 → 青色色素 ＋ Ｈ2 Ｏ
【００１０】一方、前記のように、クレアチンキナーゼ
には、三種類のアイソザイムが存在するため、クレアチ
ンキナーゼＭＢアイソザイムの定量は容易ではない。す
なわち、原理的には、ＭＭアイソザイムとＢＢアイソザ
イムとからＭＢアイソザイムを分離して定量する必要が
ある。ただし、ＢＢアイソザイムは、本来的に脳や脊髄
中に存在するものであるため、血液中の存在量は非常に
少なく、その存在は無視することができる。従って、Ｍ
Ｂアイソザイムの定量には、ＭＭアイソザイムを分離す
ることができれば可能となるが、その分離は非常に困難
である。このため、クレアチンキナーゼを含む血液試料
（血清や血漿など）中のＭＭアイソザイムを分離する代
わりに、ＭＢアイソザイムの活性に影響を与えること無
く、ＭＭアイソザイムの活性を阻害させる方法により、
実質的なＭＢアイソザイムの分離を実現する方法が既に
開発されている（特公昭５６−１９２３９号公報参
照）。この方法では、予め調製したクレアチンキナーゼ
ＭＢアイソザイム中のサブユニットＢの酵素活性を阻害
することなく、クレアチンキナーゼのＭＭアイソザイム
およびＭＢアイソザイム中のサブユニットＭの酵素活性
を完全に阻害する抗体を使用する。すなわち、被検液を
先ずこのＭサブユニット不活性化抗体で処理することに
よってクレアチンキナーゼの活性をクレアチンキナーゼ
ＭＢアイソザイムに起因するもののみに限定させ、この
酵素活性を前記の検出反応系１あるいは検出反応系２を
利用して測定することによって、クレアチンキナーゼＭ
Ｂアイソザイムの定量が可能となる。
には、三種類のアイソザイムが存在するため、クレアチ
ンキナーゼＭＢアイソザイムの定量は容易ではない。す
なわち、原理的には、ＭＭアイソザイムとＢＢアイソザ
イムとからＭＢアイソザイムを分離して定量する必要が
ある。ただし、ＢＢアイソザイムは、本来的に脳や脊髄
中に存在するものであるため、血液中の存在量は非常に
少なく、その存在は無視することができる。従って、Ｍ
Ｂアイソザイムの定量には、ＭＭアイソザイムを分離す
ることができれば可能となるが、その分離は非常に困難
である。このため、クレアチンキナーゼを含む血液試料
（血清や血漿など）中のＭＭアイソザイムを分離する代
わりに、ＭＢアイソザイムの活性に影響を与えること無
く、ＭＭアイソザイムの活性を阻害させる方法により、
実質的なＭＢアイソザイムの分離を実現する方法が既に
開発されている（特公昭５６−１９２３９号公報参
照）。この方法では、予め調製したクレアチンキナーゼ
ＭＢアイソザイム中のサブユニットＢの酵素活性を阻害
することなく、クレアチンキナーゼのＭＭアイソザイム
およびＭＢアイソザイム中のサブユニットＭの酵素活性
を完全に阻害する抗体を使用する。すなわち、被検液を
先ずこのＭサブユニット不活性化抗体で処理することに
よってクレアチンキナーゼの活性をクレアチンキナーゼ
ＭＢアイソザイムに起因するもののみに限定させ、この
酵素活性を前記の検出反応系１あるいは検出反応系２を
利用して測定することによって、クレアチンキナーゼＭ
Ｂアイソザイムの定量が可能となる。
【００１１】以前のクレアチンキナーゼの臨床検査およ
びクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの臨床検査で
は、これまでに述べてきた方法を利用して、検出反応を
試薬溶液中で実施する湿式法が一般的に利用されてい
た。しかしながら、湿式法による定量分析操作は、結果
を得るまでにかなりの長時間を必要とするという欠点が
あった。すなわち、例えば、心筋梗塞については、梗塞
の発症から治療開始までの時間が短いほど治療の効果が
高いことが知られており、このため特に心筋梗塞発症の
診断については緊急性の要求が非常に高い。従って、検
査の開始から検査結果の入手までの時間が長いことは、
治療の開始の遅れを引き起こすことになり、好ましくな
い。
びクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの臨床検査で
は、これまでに述べてきた方法を利用して、検出反応を
試薬溶液中で実施する湿式法が一般的に利用されてい
た。しかしながら、湿式法による定量分析操作は、結果
を得るまでにかなりの長時間を必要とするという欠点が
あった。すなわち、例えば、心筋梗塞については、梗塞
の発症から治療開始までの時間が短いほど治療の効果が
高いことが知られており、このため特に心筋梗塞発症の
診断については緊急性の要求が非常に高い。従って、検
査の開始から検査結果の入手までの時間が長いことは、
治療の開始の遅れを引き起こすことになり、好ましくな
い。
【００１２】臨床検査の結果を短時間に得る手段とし
て、透明支持体のうえに検出反応に関与する試薬組成物
を含む試薬層を積層した構成の各種の乾式分析素子が以
前より知られている。そして、上記のクレアチンキナー
ゼ検査反応あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイ
ム検査反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層し
たクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレ
アチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子
も既に開発され、実際に使用されている。このようなク
レアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチ
ンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構
成については、下記の特許公開公報に詳しい記載があ
る。特開平６１−２５４１９８号公報、特開平６１−２
５４１９９号公報、特開平６１−２６０１６４号公報、
前記の特開平６３−３２４９９号公報。
て、透明支持体のうえに検出反応に関与する試薬組成物
を含む試薬層を積層した構成の各種の乾式分析素子が以
前より知られている。そして、上記のクレアチンキナー
ゼ検査反応あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイ
ム検査反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層し
たクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレ
アチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子
も既に開発され、実際に使用されている。このようなク
レアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチ
ンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構
成については、下記の特許公開公報に詳しい記載があ
る。特開平６１−２５４１９８号公報、特開平６１−２
５４１９９号公報、特開平６１−２６０１６４号公報、
前記の特開平６３−３２４９９号公報。
【００１３】上記の公知のクレアチンキナーゼ定量用の
乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイ
ム定量用の乾式分析素子は、それぞれクレアチンキナー
ゼおよびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの短時間
での定量分析のために利用できる優れた分析用具である
が、分析素子製造後から実際の定量分析に使用するまで
の間における保存性に劣ると云う問題があった。すなわ
ち、それぞれの分析素子を通常の保存条件にて保存を行
なうと、製造後短い期間の内に、感度の低下が発生する
ことが見出されている。従って、これらの乾式分析素子
を良好な保存状態に維持するためには、分析素子を冷凍
保存する必要があった。このような分析素子の保存に、
冷凍保存が必要であると云うことは、その冷凍保存の設
備が必要である上に、実際の臨床検査の開始に際しても
時間的遅れが発生しやすいという問題がある。
乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイ
ム定量用の乾式分析素子は、それぞれクレアチンキナー
ゼおよびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの短時間
での定量分析のために利用できる優れた分析用具である
が、分析素子製造後から実際の定量分析に使用するまで
の間における保存性に劣ると云う問題があった。すなわ
ち、それぞれの分析素子を通常の保存条件にて保存を行
なうと、製造後短い期間の内に、感度の低下が発生する
ことが見出されている。従って、これらの乾式分析素子
を良好な保存状態に維持するためには、分析素子を冷凍
保存する必要があった。このような分析素子の保存に、
冷凍保存が必要であると云うことは、その冷凍保存の設
備が必要である上に、実際の臨床検査の開始に際しても
時間的遅れが発生しやすいという問題がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、これまでに
知られているクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子
およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾
式分析素子の低い保存性を解決することを目的とする。
本発明は特に、常温で保存しても感度低下が少なく、従
って常温での保存が可能なクレアチンキナーゼ定量用の
乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイ
ム定量用の乾式分析素子を提供することを目的とする。
知られているクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子
およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾
式分析素子の低い保存性を解決することを目的とする。
本発明は特に、常温で保存しても感度低下が少なく、従
って常温での保存が可能なクレアチンキナーゼ定量用の
乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイ
ム定量用の乾式分析素子を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、支持体上に、
クレアチンキナーゼの存在下で、アデノシン三リン酸を
生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そし
てそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提
供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す
緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リ
ン酸との反応により分光的測定方法により検出可能な化
合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキ
ナーゼ検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼ定
量用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン
酸基を有する化合物であることを特徴とするクレアチン
キナーゼ定量用乾式分析素子にある。
クレアチンキナーゼの存在下で、アデノシン三リン酸を
生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そし
てそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提
供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す
緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リ
ン酸との反応により分光的測定方法により検出可能な化
合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキ
ナーゼ検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼ定
量用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン
酸基を有する化合物であることを特徴とするクレアチン
キナーゼ定量用乾式分析素子にある。
【００１６】本発明はまた、支持体上に、クレアチンキ
ナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体、
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの存在下で、アデ
ノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシ
ン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のた
めのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域にお
いて緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成し
たアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法に
より検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有
するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検出試薬層を
積層してなるクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量
用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン酸
基を有する化合物であることを特徴とするクレアチンキ
ナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子にもある。
ナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体、
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの存在下で、アデ
ノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシ
ン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のた
めのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域にお
いて緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成し
たアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法に
より検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有
するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検出試薬層を
積層してなるクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量
用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン酸
基を有する化合物であることを特徴とするクレアチンキ
ナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子にもある。
【００１７】上記の本発明のクレアチンキナーゼ定量用
の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢ定量用
の乾式分析素子では、クレアチンキナーゼまたはクレア
チンキナーゼＭＢアイソザイムの酵素作用によるアデノ
シン三リン酸（ＡＴＰ）の生成のためのクレアチンリン
酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）との反応に
必要なｐＨ環境を提供する緩衝剤組成物として、従来に
おいて一般的に用いられていたトリス（Ｔｒｉｓ）やイ
ミダゾールに代わって、スルホン酸基を有する緩衝性化
合物を用いることを特徴としている。
の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢ定量用
の乾式分析素子では、クレアチンキナーゼまたはクレア
チンキナーゼＭＢアイソザイムの酵素作用によるアデノ
シン三リン酸（ＡＴＰ）の生成のためのクレアチンリン
酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）との反応に
必要なｐＨ環境を提供する緩衝剤組成物として、従来に
おいて一般的に用いられていたトリス（Ｔｒｉｓ）やイ
ミダゾールに代わって、スルホン酸基を有する緩衝性化
合物を用いることを特徴としている。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明のクレアチンキナーゼ定量
用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢ定量
用の乾式分析素子において利用される検出反応系は前記
の検出反応系１あるいは検出反応系２である。従って、
アデノシン三リン酸との反応によって分光的測定方法に
より検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物として
は、前記の検出反応系に利用される指示薬組成物のいず
れもが使用することができる。すなわち、指示薬組成物
の例としては、下記の指示薬組成物を挙げることができ
る。
用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢ定量
用の乾式分析素子において利用される検出反応系は前記
の検出反応系１あるいは検出反応系２である。従って、
アデノシン三リン酸との反応によって分光的測定方法に
より検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物として
は、前記の検出反応系に利用される指示薬組成物のいず
れもが使用することができる。すなわち、指示薬組成物
の例としては、下記の指示薬組成物を挙げることができ
る。
【００１９】１）グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（あるいは、ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、
およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む
指示薬組成物。 ２）グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド酸化型（あるいは、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびテトラゾリウム塩
を含む指示薬組成物。 ３）グリセロール、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グ
リセロリン酸オキシダーゼ及びロイコ色素を含む指示薬
組成物。 なお、分析対象物質（アナライト）が、クレアチンキナ
ーゼＭＢアイソザイムである場合には、そのアナライト
の血液試料中の存在量が比較的微量なこと（心筋梗塞の
発症があった場合でも）、そして血液試料中には本来的
にグルコースが含まれていることから、その血液試料中
のグルコースが検出反応に関与するグルコース（Ｇｌ
ｕ）として利用することができる。従って、クレアチン
キナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子において
は、上記の試薬組成物１）及び２）から、グルコースを
除くことができる。
ンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（あるいは、ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、
およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む
指示薬組成物。 ２）グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド酸化型（あるいは、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびテトラゾリウム塩
を含む指示薬組成物。 ３）グリセロール、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グ
リセロリン酸オキシダーゼ及びロイコ色素を含む指示薬
組成物。 なお、分析対象物質（アナライト）が、クレアチンキナ
ーゼＭＢアイソザイムである場合には、そのアナライト
の血液試料中の存在量が比較的微量なこと（心筋梗塞の
発症があった場合でも）、そして血液試料中には本来的
にグルコースが含まれていることから、その血液試料中
のグルコースが検出反応に関与するグルコース（Ｇｌ
ｕ）として利用することができる。従って、クレアチン
キナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子において
は、上記の試薬組成物１）及び２）から、グルコースを
除くことができる。
【００２０】本発明の乾式分析素子、すなわち、クレア
チンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチン
キナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構
成、及びそれらを構成する各種試薬は、既に知られてお
り、本発明の乾式分析素子に於ても、前述の特定の緩衝
剤化合物を使用する以外は、同様の構成と同様の各種試
薬が利用される。このような乾式分析素子の構成と試薬
の例は、前述の特許公告公報および公開公報に詳しく記
載されているので、ここに改めて詳しく記載しない。
チンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチン
キナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構
成、及びそれらを構成する各種試薬は、既に知られてお
り、本発明の乾式分析素子に於ても、前述の特定の緩衝
剤化合物を使用する以外は、同様の構成と同様の各種試
薬が利用される。このような乾式分析素子の構成と試薬
の例は、前述の特許公告公報および公開公報に詳しく記
載されているので、ここに改めて詳しく記載しない。
【００２１】次に、本発明の特徴的構成要件である「ス
ルホン酸基を有する緩衝性化合物」について詳しく説明
する。クレアチンキナーゼまたはクレアチンキナーゼＭ
Ｂアイソザイムの酵素作用によるアデノシン三リン酸
（ＡＴＰ）の生成の為のリン酸（ＣＰ）とアデノシン二
リン酸（ＡＤＰ）との反応には、特定のｐＨ環境、すな
わちｐＨ５．５〜８．５のｐＨ環境が必要であることは
以前より知られており、このため、初期の頃にはビス−
トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）と略称されるグッドの緩衝
剤組成物が使用されていたが、その後、クレアチンキナ
ーゼの定量に関するＪＳＣＣ勧告により、イミダゾール
が緩衝性化合物として一般的に用いられてきた。
ルホン酸基を有する緩衝性化合物」について詳しく説明
する。クレアチンキナーゼまたはクレアチンキナーゼＭ
Ｂアイソザイムの酵素作用によるアデノシン三リン酸
（ＡＴＰ）の生成の為のリン酸（ＣＰ）とアデノシン二
リン酸（ＡＤＰ）との反応には、特定のｐＨ環境、すな
わちｐＨ５．５〜８．５のｐＨ環境が必要であることは
以前より知られており、このため、初期の頃にはビス−
トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）と略称されるグッドの緩衝
剤組成物が使用されていたが、その後、クレアチンキナ
ーゼの定量に関するＪＳＣＣ勧告により、イミダゾール
が緩衝性化合物として一般的に用いられてきた。
【００２２】一方、本発明の発明者の研究によると、従
来のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびク
レアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素
子の低い保存安定性は、それらの保存中において、試薬
組成物中の試薬が、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）やクレ
アチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）が存在し
ない状態で、徐々に反応を起こすことに起因することが
判明した。すなわち、前記の検出反応系１では、ＣＫや
ＣＫＭＢが存在しなくても、ＣＰとＡＤＰとが部分的に
反応してＡＴＰが生成し、またＣＰとＧｌｕとが反応し
てＧ６Ｐを生成させる現象が確認され、一方、検出反応
系２では、ＣＰとＡＤＰとの部分な反応によるＡＴＰの
生成の他、またＣＰとグリセロールとの反応によるＬ−
α−グリセロリン酸の生成が確認された。従って、これ
らのクレアチンキナーゼあるいはクレアチンキナーゼＭ
Ｂアイソザイムの不存在下で発生する反応が分析精度の
大きな低下をもたらす結果となる。
来のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびク
レアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素
子の低い保存安定性は、それらの保存中において、試薬
組成物中の試薬が、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）やクレ
アチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）が存在し
ない状態で、徐々に反応を起こすことに起因することが
判明した。すなわち、前記の検出反応系１では、ＣＫや
ＣＫＭＢが存在しなくても、ＣＰとＡＤＰとが部分的に
反応してＡＴＰが生成し、またＣＰとＧｌｕとが反応し
てＧ６Ｐを生成させる現象が確認され、一方、検出反応
系２では、ＣＰとＡＤＰとの部分な反応によるＡＴＰの
生成の他、またＣＰとグリセロールとの反応によるＬ−
α−グリセロリン酸の生成が確認された。従って、これ
らのクレアチンキナーゼあるいはクレアチンキナーゼＭ
Ｂアイソザイムの不存在下で発生する反応が分析精度の
大きな低下をもたらす結果となる。
【００２３】上記の理由から、本発明者は、上記の様な
乾式分析素子の常温での保存中に発生する望ましくない
反応の抑制を目的として研究した。そして、その結果、
従来の緩衝剤組成物あるいは緩衝性化合物に代わって、
スルホン酸基（スルホン酸塩基の状態にあっていてもよ
い）を有する緩衝性化合物を用いることにより、乾式分
析素子の保存中に於ける上記の望ましくない反応を顕著
に抑制することが可能となることを見出し、本発明に到
達したものである。
乾式分析素子の常温での保存中に発生する望ましくない
反応の抑制を目的として研究した。そして、その結果、
従来の緩衝剤組成物あるいは緩衝性化合物に代わって、
スルホン酸基（スルホン酸塩基の状態にあっていてもよ
い）を有する緩衝性化合物を用いることにより、乾式分
析素子の保存中に於ける上記の望ましくない反応を顕著
に抑制することが可能となることを見出し、本発明に到
達したものである。
【００２４】本発明で用いるスルホン酸基を有する緩衝
性化合物は、グッドの緩衝剤と一般的に呼ばれている緩
衝性化合物から選ばれることが好ましい。すなわち、グ
ッドの緩衝剤には、スルホン酸基を持つもの、そしてス
ルホン酸基を持たないもののいずれもがあるが、本発明
で用いる緩衝性化合物は、それらの内のスルホン酸基を
持つ緩衝性化合物である。なお、グッドの緩衝剤（ある
いは、グッドの緩衝液とも呼ばれる）については、例え
ば、「化学辞典」（森北出版株式会社、１９８１年発
行）、「化学大辞典」（株式会社東京化学同人、１９８
９年発行）などに簡単な記載があり、また更に多くの臨
床検査試薬に関する成書に詳しい記載がある。
性化合物は、グッドの緩衝剤と一般的に呼ばれている緩
衝性化合物から選ばれることが好ましい。すなわち、グ
ッドの緩衝剤には、スルホン酸基を持つもの、そしてス
ルホン酸基を持たないもののいずれもがあるが、本発明
で用いる緩衝性化合物は、それらの内のスルホン酸基を
持つ緩衝性化合物である。なお、グッドの緩衝剤（ある
いは、グッドの緩衝液とも呼ばれる）については、例え
ば、「化学辞典」（森北出版株式会社、１９８１年発
行）、「化学大辞典」（株式会社東京化学同人、１９８
９年発行）などに簡単な記載があり、また更に多くの臨
床検査試薬に関する成書に詳しい記載がある。
【００２５】グッドの緩衝剤に属し、かつ本発明の乾式
分析素子に於ける使用に適した緩衝性化合物としては、
ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、ＤＩＰＳ
Ｏ、ＨＥＰＥＳ，ＨＥＰＳＯと名付けられている化合物
を挙げることができる。これらの化合物の中でも、ＴＥ
Ｓ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳと名付けら
れている化合物が好ましい。特に好ましいのは、ＴＥＳ
とＴＡＰＳＯである。次に、本発明において好ましく用
いられる緩衝性化合物である、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、Ｍ
ＯＰＳＯ、およびＭＥＳの化学構造を示す。
分析素子に於ける使用に適した緩衝性化合物としては、
ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、ＤＩＰＳ
Ｏ、ＨＥＰＥＳ，ＨＥＰＳＯと名付けられている化合物
を挙げることができる。これらの化合物の中でも、ＴＥ
Ｓ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳと名付けら
れている化合物が好ましい。特に好ましいのは、ＴＥＳ
とＴＡＰＳＯである。次に、本発明において好ましく用
いられる緩衝性化合物である、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、Ｍ
ＯＰＳＯ、およびＭＥＳの化学構造を示す。
【００２６】
【化１】
【００２７】本発明の乾式分析素子におけるスルホン酸
基を持つ緩衝性化合物の使用量については特に制限はな
い。すなわち、グッドの緩衝剤の一般的な使用の態様を
参考にし、使用量を変動させての試験的使用などの一般
的な使用量決定方法を利用することにより、容易に適当
な使用量を決定することができる。なお、本発明のスル
ホン酸基を持つ緩衝性化合物は、二種以上のものを組合
せて使用することも可能であり、またスルホン酸基を持
たない緩衝性化合物あるいは他の緩衝剤組成物と組合せ
て使用することもできる。
基を持つ緩衝性化合物の使用量については特に制限はな
い。すなわち、グッドの緩衝剤の一般的な使用の態様を
参考にし、使用量を変動させての試験的使用などの一般
的な使用量決定方法を利用することにより、容易に適当
な使用量を決定することができる。なお、本発明のスル
ホン酸基を持つ緩衝性化合物は、二種以上のものを組合
せて使用することも可能であり、またスルホン酸基を持
たない緩衝性化合物あるいは他の緩衝剤組成物と組合せ
て使用することもできる。
【００２８】クレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子
あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の
乾式分析素子を用いてのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）あ
るいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭ
Ｂ）の定量分析の操作は、前述の特許公告公報及び特許
公開公報に記載されているように、既に知られており、
本発明の乾式分析素子を用いてのＣＫあるいはＣＫＭＢ
の定量分析操作は、それらと同様な操作に従って実施す
ることができる。
あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の
乾式分析素子を用いてのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）あ
るいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭ
Ｂ）の定量分析の操作は、前述の特許公告公報及び特許
公開公報に記載されているように、既に知られており、
本発明の乾式分析素子を用いてのＣＫあるいはＣＫＭＢ
の定量分析操作は、それらと同様な操作に従って実施す
ることができる。
【００２９】次に本発明の実施例と比較例とを記載す
る。なお、下記の実施例と比較例とに於いては、検出反
応系１を利用するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム
定量用の乾式分析素子のみを示すが、本発明で使用する
緩衝性化合物の機能は、検出反応系が、検出反応系１で
も、検出反応系２であっても、またクレアチンキナーゼ
ＭＢアイソザイム定量用であっても、クレアチンキナー
ゼ（総クレアチンキナーゼ）定量用であっても、実質的
な変りはない。従って、下記の実施例によって、前述の
いずれの態様の乾式分析素子においても、本発明のスル
ホン酸基を有する緩衝性化合物が明らかにされていると
理解すべきである。
る。なお、下記の実施例と比較例とに於いては、検出反
応系１を利用するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム
定量用の乾式分析素子のみを示すが、本発明で使用する
緩衝性化合物の機能は、検出反応系が、検出反応系１で
も、検出反応系２であっても、またクレアチンキナーゼ
ＭＢアイソザイム定量用であっても、クレアチンキナー
ゼ（総クレアチンキナーゼ）定量用であっても、実質的
な変りはない。従って、下記の実施例によって、前述の
いずれの態様の乾式分析素子においても、本発明のスル
ホン酸基を有する緩衝性化合物が明らかにされていると
理解すべきである。
【００３０】
［実施例１］ＴＥＳを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量
用分析素子の製造 透明ポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ１８０
μｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面上に下記の
組成の塗布液を塗布、乾燥して、乾燥層厚が１２μｍの
指示薬層を形成した。
用分析素子の製造 透明ポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ１８０
μｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面上に下記の
組成の塗布液を塗布、乾燥して、乾燥層厚が１２μｍの
指示薬層を形成した。
【００３１】 脱イオンゼラチン ２００ｇ 水 １１００ｇ ５％非イオン系界面活性剤水溶液 ８０ｇ ニトロテトラゾリウムブルー １０ｇ
【００３２】上記指示薬層をゼラチン架橋剤を含む溶液
で湿らせた後（約３０ｇ／ｍ2 ）、その指示薬層の上
に、ポリエチレンテトラフタレート紡績糸からなるトリ
コット編み物を圧着し、乾燥させて展開層とした。次
に、上記展開層の表面に下記の組成の塗布液を、塗布量
１３０ｇ／ｍ2 にて塗布、乾燥した。
で湿らせた後（約３０ｇ／ｍ2 ）、その指示薬層の上
に、ポリエチレンテトラフタレート紡績糸からなるトリ
コット編み物を圧着し、乾燥させて展開層とした。次
に、上記展開層の表面に下記の組成の塗布液を、塗布量
１３０ｇ／ｍ2 にて塗布、乾燥した。
【００３３】 水 ４６．６ｇ 抗ヒトＣＫ−Ｍヤギ抗体溶液 ２０ｇ （最終希釈倍率１５００倍時に２０００Ｕ／Ｌの ＣＫＭＭを５０％以上阻害できる能力を持つ溶液） １０％非イオン系界面活性剤水溶液 ２．９ｇ １５％ポリアクリルアミド水溶液 ３３．８ｇ （平均分子量３．７万） ２０％塩化マグネシウム水溶液 ８．７ｇ エチレンジアミン４酢酸・２Ｎａ塩 ０．５ｇ クレアチンリン酸（ＣＫ） １．３ｇ アデノシン−５’−ジホスフェート（ＡＤＰ） ０．３ｇ Ｐ1 ，Ｐ5 −ジ（アデノシン−５’−） ペンタホスフェート（ＡＰ５Ａ） ０．２５ｇ アデノシン−５’−モノホスフェート（ＡＭＰ） １．２ｇ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン ０．１ｇ ニコチンアミドアデニンヌクレオチド酸化型 （ＮＡＤ） ０．６ｇ オキサロ酢酸 ０．０７ｇ Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２− アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ） ５．１ｇ １Ｎ ＮａＯＨ １０．０ｇ ジアホラーゼ １５００Ｕ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ １４０００Ｕ ヘキソキナーゼ（ＨＫ） １９４００Ｕ アスコルビン酸オキシダーゼ ５０００Ｕ
【００３４】最後に、上記にて形成した、支持体上に指
示薬層と反応試薬含有展開層とが積層された積層体を１
２ｍｍ×１２ｍｍの寸法に裁断して、ＴＥＳを緩衝剤と
して用いたＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。なお、得ら
れたＣＫＭＢ定量用分析素子中の試薬分布を調べたとこ
ろ、指示薬層に導入したニトロテトラゾリウムブルーの
大部分が展開層に移動していることが確認された。
示薬層と反応試薬含有展開層とが積層された積層体を１
２ｍｍ×１２ｍｍの寸法に裁断して、ＴＥＳを緩衝剤と
して用いたＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。なお、得ら
れたＣＫＭＢ定量用分析素子中の試薬分布を調べたとこ
ろ、指示薬層に導入したニトロテトラゾリウムブルーの
大部分が展開層に移動していることが確認された。
【００３５】［実施例２］ＴＡＰＳＯを緩衝剤として用
いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＴＡＰＳＯ（モル換
算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にし
てＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＴＡＰＳＯ（モル換
算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にし
てＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３６】［実施例３］ＭＯＰＳＯを緩衝剤として用
いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＭＯＰＳＯ（モル換
算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にし
てＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＭＯＰＳＯ（モル換
算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にし
てＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３７】［実施例４］ＭＥＳを緩衝剤として用いた
ＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＭＥＳ（モル換算で
同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣ
ＫＭＢ定量用分析素子を得た。
ＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＭＥＳ（モル換算で
同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣ
ＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３８】［比較例１］イミダゾールを緩衝剤として
用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳ（５．１ｇ）を、１．
５ｇのイミダゾールに替え、１Ｎ−ＮａＯＨ（１０．０
ｇ）を１０．０ｇの１Ｎ−ＨＣｌに替えた以外は実施例
１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳ（５．１ｇ）を、１．
５ｇのイミダゾールに替え、１Ｎ−ＮａＯＨ（１０．０
ｇ）を１０．０ｇの１Ｎ−ＨＣｌに替えた以外は実施例
１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３９】［比較例２］Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを緩衝剤と
して用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＢｉｓ−Ｔｒｉｓ
（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と
同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
して用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造 緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＢｉｓ−Ｔｒｉｓ
（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と
同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００４０】［ＣＫＭＢ定量用分析素子の評価：保存中
のＡＴＰの生成］実施例１乃至４で得られた分析素子、
そして比較例１及び２で得られた分析素子を、それぞれ
４５℃、１１％ＲＨの保存条件で１日間保存し、次いで
水を用いて、指示薬層と反応試薬含有展開層にて生成し
たＡＴＰを抽出した。各抽出液を高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）に掛けて、各分析素子中でのＡＴＰ
の生成量を測定した。この測定により判明した各分析素
子のＡＴＰ生成量を下記の第１表に示す。
のＡＴＰの生成］実施例１乃至４で得られた分析素子、
そして比較例１及び２で得られた分析素子を、それぞれ
４５℃、１１％ＲＨの保存条件で１日間保存し、次いで
水を用いて、指示薬層と反応試薬含有展開層にて生成し
たＡＴＰを抽出した。各抽出液を高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）に掛けて、各分析素子中でのＡＴＰ
の生成量を測定した。この測定により判明した各分析素
子のＡＴＰ生成量を下記の第１表に示す。
【００４１】
【表１】 第１表 ──────────────────────────────────── 分析素子 緩衝性化合物 ＡＴＰ生成量（ナノモル） ──────────────────────────────────── 実施例１ ＴＥＳ ０．００ 実施例２ ＴＡＰＳＯ ０．００ 実施例３ ＭＯＰＳＯ １．１２ 実施例４ ＭＥＳ ３．０２ ──────────────────────────────────── 比較例１ イミダゾール ２７．１５ 比較例２ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ １１．５２ ────────────────────────────────────
【００４２】上記の第１表の結果から、本発明で採用す
るスルホン酸基を有する緩衝性化合物が、クレアチンキ
ナーゼ（あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイ
ム）の不存在下でのＡＴＰの副生を効果的に抑制してい
ることが明らかである。
るスルホン酸基を有する緩衝性化合物が、クレアチンキ
ナーゼ（あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイ
ム）の不存在下でのＡＴＰの副生を効果的に抑制してい
ることが明らかである。
【００４３】［ＣＫＭＢ定量用分析素子の評価：保存中
の感度変動］実施例で得られた分析素子そして比較例１
得られた分析素子のそれぞれについて、製造直後のも
の、そして３５℃、１１ＲＨ％の保存条件で１０日間保
存した後のものを用意し、それぞれの分析素子につい
て、ＣＫＭＢ含有量が１０Ｕ／Ｌ附近の検体とＣＫＭＢ
含有量が１００Ｕ／Ｌ附近の検体とを点着した。検体が
点着された分析素子について、３７℃でインキュベーシ
ョンを行ない、次いで波長５４０ｎｍにて、インキュベ
ーション開始後２分後、そして５分後に分光測定を行な
い、予め作成しておいた検量線を参照することにより、
反応速度法によりＣＫＭＢ量の定量を行なった。その結
果を下記の第２表に示す。
の感度変動］実施例で得られた分析素子そして比較例１
得られた分析素子のそれぞれについて、製造直後のも
の、そして３５℃、１１ＲＨ％の保存条件で１０日間保
存した後のものを用意し、それぞれの分析素子につい
て、ＣＫＭＢ含有量が１０Ｕ／Ｌ附近の検体とＣＫＭＢ
含有量が１００Ｕ／Ｌ附近の検体とを点着した。検体が
点着された分析素子について、３７℃でインキュベーシ
ョンを行ない、次いで波長５４０ｎｍにて、インキュベ
ーション開始後２分後、そして５分後に分光測定を行な
い、予め作成しておいた検量線を参照することにより、
反応速度法によりＣＫＭＢ量の定量を行なった。その結
果を下記の第２表に示す。
【００４４】
【表２】 第２表 ──────────────────────────────────── 分析素子 検体 ＣＫＭＢ測定値 （ＣＫＭＢ量） 製造直後の分析素子 １０日保存後の分析素子 ──────────────────────────────────── 実施例１ 約１０Ｕ／Ｌ ８Ｕ／Ｌ ７Ｕ／Ｌ 約１００Ｕ／Ｌ １０８Ｕ／Ｌ １０４Ｕ／Ｌ ──────────────────────────────────── 比較例１ 約１０Ｕ／Ｌ ８Ｕ／Ｌ ２２Ｕ／Ｌ 約１００Ｕ／Ｌ １００Ｕ／Ｌ １１３Ｕ／Ｌ ────────────────────────────────────
【００４５】上記の第２表の結果から、本発明で採用す
るスルホン酸基を有する緩衝性化合物を用いたＣＫＭＢ
定量用分析素子（実施例１）を用いた場合には、通常の
保存条件よりも苛酷な保存条件においてもＣＫＭＢ測定
に関する感度の変動は僅かであることが分る。一方、従
来のイミダゾール緩衝剤を用いたＣＫＭＢ定量用分析素
子（比較例１）は、その製造直後に於ては満足すべき感
度を示すが、保存を行なうことにより明らかな感度低下
（ＡＴＰの副生によるバックグランド発色の発生）が発
生している。
るスルホン酸基を有する緩衝性化合物を用いたＣＫＭＢ
定量用分析素子（実施例１）を用いた場合には、通常の
保存条件よりも苛酷な保存条件においてもＣＫＭＢ測定
に関する感度の変動は僅かであることが分る。一方、従
来のイミダゾール緩衝剤を用いたＣＫＭＢ定量用分析素
子（比較例１）は、その製造直後に於ては満足すべき感
度を示すが、保存を行なうことにより明らかな感度低下
（ＡＴＰの副生によるバックグランド発色の発生）が発
生している。
【００４６】
【発明の効果】クレアチンキナーゼ（ＣＫ）或はクレア
チンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析
用の乾式分析素子に導入する緩衝剤として、本発明で規
定したスルホン酸基を持つ緩衝性化合物を使用すること
により、分析素子の保存性が顕著に向上する。このた
め、本発明に従うクレアチンキナーゼあるいはクレアチ
ンキナーゼＭＢアイソザイムの定量のための乾式分析素
子は、従来のＣＫあるいはＣＫＭＢ定量分析用乾式分析
素子の使用前の保存の際に必須とされていた分析素子の
冷凍保存の必要が無くなるため、実用において非常に有
利となる。
チンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析
用の乾式分析素子に導入する緩衝剤として、本発明で規
定したスルホン酸基を持つ緩衝性化合物を使用すること
により、分析素子の保存性が顕著に向上する。このた
め、本発明に従うクレアチンキナーゼあるいはクレアチ
ンキナーゼＭＢアイソザイムの定量のための乾式分析素
子は、従来のＣＫあるいはＣＫＭＢ定量分析用乾式分析
素子の使用前の保存の際に必須とされていた分析素子の
冷凍保存の必要が無くなるため、実用において非常に有
利となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寺島 薫 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内
Claims (10)
- 【請求項１】 支持体上に、クレアチンキナーゼの存在
下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸
とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸
の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５
の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更
に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的
測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組
成物を含有するクレアチンキナーゼ検出試薬層を積層し
てなるクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子であっ
て、該緩衝性化合物がスルホン酸基を有する化合物であ
ることを特徴とするクレアチンキナーゼ定量用乾式分析
素子。 - 【請求項２】 指示薬組成物が、グルコース、ヘキソキ
ナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン
酸）酸化型及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼを含むものである請求項１に記載のクレアチンキナー
ゼ定量用乾式分析素子。 - 【請求項３】 指示薬組成物が、グルコース、ヘキソキ
ナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン
酸）酸化型、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
及びテトラゾリウム塩を含むものである請求項１に記載
のクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子。 - 【請求項４】 指示薬組成物が、グリセロール、グリセ
ロールキナーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ
及びロイコ色素を含むものである請求項１に記載のクレ
アチンキナーゼ定量用乾式分析素子。 - 【請求項５】 支持体上に、クレアチンキナーゼのＭサ
ブユニット活性を特異的に阻害する抗体、クレアチンキ
ナーゼＭＢアイソザイムの存在下で、アデノシン三リン
酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、
そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境
を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を
示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン
三リン酸との反応により分光的測定方法により検出可能
な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチ
ンキナーゼＭＢアイソザイム検出試薬層を積層してなる
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素
子であって、該緩衝性化合物がスルホン酸基を有する化
合物であることを特徴とするクレアチンキナーゼＭＢア
イソザイム定量用乾式分析素子。 - 【請求項６】 指示薬組成物が、グルコース、ヘキソキ
ナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン
酸）酸化型及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼを含むものである請求項５に記載のクレアチンキナー
ゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。 - 【請求項７】 指示薬組成物が、ヘキソキナーゼ、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びテトラゾ
リウム塩を含むものである請求項５に記載のクレアチン
キナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。 - 【請求項８】 指示薬組成物が、グリセロール、グリセ
ロールキナーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ
及びロイコ色素を含むものである請求項５に記載のクレ
アチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。 - 【請求項９】 該緩衝性化合物がグッドの緩衝剤に属す
る化合物である請求項１乃至８の内のいずれかの項に記
載の乾式分析素子。 - 【請求項１０】 該緩衝性化合物がグッドの緩衝剤に属
し、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳと
名付けられている化合物の内の少なくとも一種である請
求項１乃至８の内のいずれかの項に記載の乾式分析素
子。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13928997A JP3750955B2 (ja) | 1997-04-18 | 1997-05-14 | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 |
| US09/158,485 US5972635A (en) | 1997-04-18 | 1998-09-22 | Sulfonic acid group buffered dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase or its MB isozyme |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-116548 | 1997-04-18 | ||
| JP11654897 | 1997-04-18 | ||
| JP13928997A JP3750955B2 (ja) | 1997-04-18 | 1997-05-14 | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 |
| US09/158,485 US5972635A (en) | 1997-04-18 | 1998-09-22 | Sulfonic acid group buffered dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase or its MB isozyme |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11195A true JPH11195A (ja) | 1999-01-06 |
| JP3750955B2 JP3750955B2 (ja) | 2006-03-01 |
Family
ID=27313170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13928997A Expired - Fee Related JP3750955B2 (ja) | 1997-04-18 | 1997-05-14 | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5972635A (ja) |
| JP (1) | JP3750955B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006038512A (ja) * | 2004-07-23 | 2006-02-09 | Fuji Photo Film Co Ltd | 血液濾過用ガラス繊維フィルター、血液濾過器具および血液分析素子 |
| JP4723311B2 (ja) * | 2005-08-17 | 2011-07-13 | シスメックス株式会社 | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 |
| CN114150040A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-03-08 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4080265A (en) * | 1974-08-02 | 1978-03-21 | Antonik Alan S | Method for the determination of creative phosphokinase enzyme |
| DE2548963C3 (de) * | 1975-11-03 | 1982-03-11 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB |
| US4387160A (en) * | 1981-02-17 | 1983-06-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme |
| JPS6188899A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Unitika Ltd | クレアチンキナ−ゼ定量用試薬 |
| CA1251395A (en) * | 1985-05-01 | 1989-03-21 | John B. Findlay | Immunochemical method and analytical compositions and element for determination of creatine kinase-mb |
| US4713327A (en) * | 1985-05-01 | 1987-12-15 | Eastman Kodak Company | Determination of total creatine kinase or an isoenzyme with a multilayer analytical element |
| US4912033A (en) * | 1985-11-14 | 1990-03-27 | Washington University | Creatine kinase MB determination method |
| US5804394A (en) * | 1988-04-06 | 1998-09-08 | Unitika Ltd. | Reagent for measuring creatine kinase activity and measuring method thereof |
| CA2028593C (en) * | 1989-10-31 | 2007-08-21 | Douglas R. Brandt | Stabilized enzyme compositions |
| US5298406A (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Formulation for stabilizing enzymatic activity and immunoreactivity of creatine kinase and creatine kinase isoenzymes |
| WO1995017520A1 (fr) * | 1993-12-20 | 1995-06-29 | Iatron Laboratories, Inc. | Reactif utilise pour doser la creatine-kinase |
-
1997
- 1997-05-14 JP JP13928997A patent/JP3750955B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-09-22 US US09/158,485 patent/US5972635A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3750955B2 (ja) | 2006-03-01 |
| US5972635A (en) | 1999-10-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6309852B1 (en) | Method and reagent for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol | |
| US4806415A (en) | Method and system for determining the presence of adenosine triphosphate or flavin mononucleotide | |
| US4012286A (en) | Determination of creatine phosphokinase in body fluids | |
| JPH11195A (ja) | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 | |
| JP4106270B2 (ja) | 新規測定方法 | |
| US10472665B2 (en) | Measuring method and composition using kinase | |
| JPH08280399A (ja) | トレハロースまたは無機リンの定量法 | |
| JP3034987B2 (ja) | Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸、無機リン、または１，３−ジホスホグリセリン酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP3170320B2 (ja) | 物質の測定法 | |
| EP0989191B1 (en) | Dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase or its MB isozyme | |
| JP3750956B2 (ja) | クレアチンキナーゼｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 | |
| EP0685561B1 (en) | Reagent for assaying creatine kinase | |
| EP0989190B1 (en) | Dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme | |
| Gruber et al. | Analytical Differentiation of Purine and Pyrimidine Nucleotides Determination of ADP, ATP, and Sum of GTP+ ITP in Biological Material | |
| JPH11197A (ja) | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 | |
| JP2818696B2 (ja) | Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 | |
| US5998158A (en) | Glucose free, stable dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme | |
| JP5633669B2 (ja) | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット | |
| JP3217180B2 (ja) | 物質の測定法 | |
| JP4412780B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬 | |
| KR100715924B1 (ko) | 1,5-안하이드로글루시톨의 정량 분석법 및 시약 | |
| JP3036709B2 (ja) | Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP2002186497A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 | |
| JP3034984B2 (ja) | Ｄ−ガラクトースの高感度定量法および定量用組成物 | |
| JPH06253894A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051202 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051205 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081216 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081216 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081216 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091216 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101216 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101216 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111216 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111216 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121216 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121216 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131216 Year of fee payment: 8 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |