JP4723311B2 - クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 - Google Patents

Description

本発明は、試料に含まれるクレアチンキナーゼ(以下、ＣＫとする)の活性を測定するための試薬に関する。

ＣＫは、二つのサブユニットからなる二量体のリン酸化酵素である。ＣＫのサブユニットにはＢ型（脳型）及びＭ型（筋型）の二種類が存在する。ＣＫには、二種類のサブユニットの組み合わせによって三種類のアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ及びＣＫ−ＢＢ）が存在する。ＣＫ−ＭＭは骨格筋に多く含まれ、ＣＫ−ＭＢは心筋に多く含まれ、ＣＫ−ＢＢは脳に多く含まれる。心筋梗塞や筋ジストロフィーなどの疾患によって疾患の原因部位に存在するＣＫアイソザイムが血液中に逸脱するため、臨床検査において血清や血漿などの試料に含まれるＣＫの活性値は上記疾患を診断する際の重要な指標となる。

ＣＫは血液中で不活性化されるため、生体から採取した試料にＣＫ活性化剤を添加してＣＫを活性化した後、活性測定を行なう。従って、ＣＫ活性測定用試薬には、ＣＫ活性化剤としてＮ−アセチル−Ｌ−システイン（以下、ＮＡＣとする）やチオグリセロールなどのＳＨ基を有する化合物（以下、ＳＨ化合物とする）が含有されている。

ＣＫ活性化剤は不安定な物質であり、不純物として試薬に含まれる銅や鉄などの金属イオンの影響により、ＣＫ活性化剤のＳＨ基が試薬保存中に徐々に酸化されてジスルフィド基となってしまう。分子中のＳＨ基がジスルフィド基となったＣＫ活性化剤（劣化したＣＫ活性化剤）は、ＣＫを活性化する作用を失う。このため、日本臨床化学界による勧告法（非特許文献１）は、ＣＫ活性化剤の劣化を防ぎ、安定化させるために、ＣＫ活性化剤の劣化の原因となる金属イオンをキレートするエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を試薬に含有させることを推奨している。

しかしながら、ＥＤＴＡによるＣＫ活性化剤の安定化効果は不十分であり、長期保存した試薬を用いると測定用試料中のＣＫを充分に活性化することができず、正確な測定を行えないことがある。
日本臨床化学会「臨床化学」第３３巻補冊１号（２００４）

本発明は、長期保存後でも正確な測定を行うことができるＣＫ活性測定用試薬を提供することを目的とする。

本発明は、アミノメタンスルホン酸と、ＣＫ活性化剤とを含有するクレアチンキナーゼ活性測定用試薬を提供する。

本発明によると、長期保存後でも正確な測定を行うことができるＣＫ活性測定用試薬が提供される。

本実施形態のＣＫ活性測定用試薬は、アミノメタンスルホン酸とＣＫ活性化剤とを含有する。試薬中のアミノメタンスルホン酸の濃度としてはＣＫ活性化剤を安定化させることができる濃度であれば特に限定されない。
本明細書におけるアミノメタンスルホン酸は、アミノメタンスルホン酸塩をも含む。アミノメタンスルホン酸塩としては、例えばカリウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩（メチルアミン、ジメチルアミン、メチルエチルアミン、トリエチルアミンなどのアミンとの塩を含む）などが挙げられる。

ＣＫ活性化剤としては、試料中のＣＫを活性化する作用を有していれば特に限定されず、例えば、ＮＡＣ、Ｎ−グアニル−Ｌ−システイン、システアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、グルタチオン、メルカプトコハク酸、チオグルコース、ジチオエリスリトール、メルカプト酢酸、２−メルカプトエタノール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、２−メルカプトエタンスルホン酸、チオグリセロールなどのＳＨ化合物を用いることができる。これらのＣＫ活性化剤は、二種類以上を組み合わせて用いてもよいが、単独で用いることが好ましい。試料と試薬とを混合した反応液中のＣＫ活性化剤の濃度（終濃度）は、０．１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭである。

ＣＫ活性測定用試薬の溶液状態におけるｐＨとしては特に限定されないが、５．０〜１１．０であることが好ましい。ｐＨを維持するために、試薬に緩衝剤を含有させることが好ましい。緩衝剤としては、例えばトリス−塩酸緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッド緩衝剤などを用いることができる。

ＣＫ活性測定用試薬には、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びクレアチンリン酸を含有させることが好ましい。

ＣＫ活性測定用試薬は、各成分を凍結乾燥させた状態でも、溶媒に溶解させた溶液状態であってもよい。
また、ＣＫ活性測定用試薬は第一試薬及び第二試薬の二試薬からなることが好ましい。この場合、第一試薬及び／又は第二試薬が凍結乾燥した状態であってもよく、両方の試薬が溶液状態であってもよい。

ＣＫ活性測定用試薬が第一試薬と第二試薬とからなる場合、第一試薬にＧ６ＰＤＨ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びＣＫ活性化剤を含有させ、第二試薬にクレアチンリン酸を含有させることが好ましい。

Ｇ６ＰＤＨ、ＨＫ及びＧＫとしては、その由来は特に限定されず、バクテリア、酵母、動植物などに由来するもの、又は遺伝子組み換え技術を用いて生成されたものを用いることができる。Ｇ６ＰＤＨの終濃度は、０．５〜４０Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜１０Ｕ／ｍｌである。ＨＫ又はＧＫの終濃度は、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜６Ｕ／ｍｌである。

ＣＫ活性測定用試薬には、ＥＤＴＡ、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）などのキレート剤を含有させることができる。ＣＫ活性測定用試薬が第一試薬と第二試薬とからなる場合、キレート剤は第一試薬に含有させることが好ましい。キレート剤は、ＣＫ活性化剤の劣化の原因となる試薬中の金属イオンをキレートすることによりＣＫ活性化剤の劣化を抑制する効果を有する。

アミノメタンスルホン酸は、第一試薬及び第二試薬の何れに含まれていてもよく、両方に含まれていてもよい。また、第一試薬及び第二試薬の他にアミノメタンスルホン酸を含む第三試薬を調製し、測定前にこれらを混合してもよい。アミノメタンスルホン酸は、ＣＫ活性化剤と接触させることにより、劣化したＣＫ活性化剤のジスルフィド基をＳＨ基に戻す作用があると考えられる。また、アミノメタンスルホン酸にはこのような作用だけでなく、ＣＫ活性化剤のＳＨ基がジスルフィド基となるのを防ぐ作用もあると考えられる。

アミノメタンスルホン酸を第一試薬に添加した場合、長期保存によるＳＨ化合物の劣化を抑制し、ＳＨ化合物を安定化することができる。アミノメタンスルホン酸を第二試薬に添加した場合、長期保存により劣化してＣＫ活性化作用を失ったＳＨ化合物を、劣化前の状態（ＣＫを活性化できる状態）に戻すことができる。このため、アミノメタンスルホン酸を第一試薬又は第二試薬に添加することにより、長期保存した試薬を用いても正確なＣＫ活性の測定を行うことができる。

本実施形態のＣＫ活性測定用試薬の測定対象となるのは、試料に含まれる全てのＣＫの活性、ＣＫ−ＭＭの活性、ＣＫ−ＭＢの活性及びＣＫ−ＢＢの活性の何れかである。一般的に臨床検査では、試料中の全てのＣＫの活性又はＣＫ−ＭＢの活性が測定される。ＣＫ活性測定用試薬に、ＣＫのＭ型サブユニットに特異的に結合する抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ抗体とする）を含有させることにより、試料中のＣＫ−ＭＢの活性を測定することが可能となる(Wurzburg et al., 1977, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 15:131-135)。抗ＣＫ−Ｍ抗体としては、Ｍ型サブユニットを特異的に認識する抗体であればポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の何れでもよく、これらを混合して用いてもよい。また、抗体のフラグメント及びその誘導体を用いることもできる。抗体のフラグメント及びその誘導体としては、具体的にはＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）_２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。

測定に供される試料としては、例えば、血清、血漿、血液、髄液、尿、精液などを用いることができるが、血漿又は血清を用いることが好ましい。

以下、ＣＫ活性測定に用いられる反応系の一例を図１に基づいて説明する。
ＣＫを含む試料に上記成分を含むＣＫ活性測定用試薬を添加することにより、図１に示すような反応系が構築される。図１において、ＣＫ活性化剤によって活性化されたＣＫは、クレアチンリン酸及びＡＤＰからクレアチン及びＡＴＰを生成する反応を触媒する（反応１）。試薬に含まれるＨＫ又はＧＫは、試薬に含まれるグルコース及び反応１で生成したＡＴＰからグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）及びＡＤＰを生成させる(反応２)。さらに試薬に含まれるＧ６ＰＤＨは、反応２で生成したＧ６Ｐ及びＮＡＤ又はＮＡＤＰから６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させる（反応３）。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが生成すると、試料と試薬との混合液の波長３４０ｎｍ付近での吸光度が上昇する。この吸光度の上昇をモニターすることにより、試料中のＣＫの活性を測定することができる。

ＣＫ活性測定用試薬にマグネシウムイオンを含有させることが好ましい。試薬にマグネシウム塩を添加することによってマグネシウムイオンを含有させることができる。マグネシウム塩としては、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを用いることができる。

防腐剤や界面活性作用を有する化合物を試薬に添加してもよい。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウムなどを用いることができる。界面活性作用を有する化合物としては、例えば非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤、アルブミンなどを用いることができ、具体的にはトライトン類（Union Carbide Chemicals and Plastics Co.の登録商標）、エマルゲン類（花王（株）の登録商標）、ＢＳＡなどを用いることができる。

試料にはアデニレートキナーゼが含まれていることがある。アデニレートキナーゼは特に溶血試料に多く含まれており、ＣＫの活性測定に悪影響を及ぼす。この悪影響を回避するため、試薬にアデニレートキナーゼの作用を阻害する阻害剤を加えることが好ましい。阻害剤の種類としてはアデニレートキナーゼの作用を阻害するものであれば特に限定されないが、例えばアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）やＰ１Ｐ５ジアデノシン−５’−ペンタリン酸（ＡＰ５Ａ）などを用いることができる。

さらに、ダブルカイネティック法で活性測定することによりアデニレートキナーゼなどの酵素の悪影響を回避することも可能である。ダブルカイネティック法では、先ずアデニレートキナーゼなどの酵素の活性を測定し、その後クレアチンリン酸を添加し、ＣＫによる酵素反応を開始させて試料に含まれるキナーゼの活性（ＣＫの活性とアデニレートキナーゼなどの酵素の活性との和）を測定する。これらの測定結果の差がＣＫの活性値となる。

（実施例１）
以下にＣＫ活性測定用第一試薬及び第二試薬の基本組成を示す。
＜第一試薬＞ｐＨ６．６
イミダゾール １２５ｍＭ
酢酸マグネシウム １２．５ｍＭ
ＣｙＤＴＡ ２．０ｍＭ
ＡＤＰ ２．５ｍＭ
ＡＭＰ ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．５μＭ
グルコース ２５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ １８７５Ｕ／Ｌ
ヘキソキナーゼ ３７５０Ｕ／Ｌ
ＮＡＣ ３０ｍＭ
＜第二試薬Ａ＞ｐＨ９．０
クレアチンリン酸 １５０ｍＭ

上記物質を上記濃度となるよう精製水に溶解し、第一試薬及び第二試薬Ａを調製した。次に、第二試薬Ａにアミノメタンスルホン酸を５ｍＭ添加して第二試薬Ｂを調製した。第二試薬Ａにアミノメタンスルホン酸を１０ｍＭ添加して第二試薬Ｃを調製した。第二試薬Ａにアミノメタンスルホン酸を２０ｍＭ添加して第二試薬Ｄを調製した。また、第二試薬Ａと同じ組成の第二試薬Ｅを調製した。

上記第一試薬及び第二試薬Ａ〜Ｄを４℃で４ヶ月間保存した。保存後、日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて第一試薬１８０μｌと、第二試薬４５μｌと、試料として酵素キャリブレーター（シスメックス製）５．６μｌとを混合し、３４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。また、第一試薬及び第二試薬Ｅは４℃４ヶ月の長期保存を行わず、試薬調製直後に上記試料のＣＫ活性を測定した。測定は二回行い、測定結果の平均値を下記表１に示した。表１に示す値は吸光度変化量を１００００倍した値である。

長期保存後の第二試薬Ａを用いた場合の吸光度変化量測定値（以下、単に測定値ともいう）よりも、アミノメタンスルホン酸を含む長期保存後の第二試薬Ｂ〜Ｃを用いた場合の測定値の方が、第二試薬Ｅを用いた場合の測定値に近い値を示した。

これは、長期保存によって劣化したＮＡＣとアミノメタンスルホン酸とを接触させたためにＮＡＣが劣化前の状態に戻り、ＣＫを充分に活性化できたことを示す。以上より、アミノメタンスルホン酸を添加した試薬を用いることにより長期保存後の試薬を用いても試料中のＣＫの活性を正確に測定できることが判った。

（実施例２）
以下にＣＫ活性測定用第一試薬及び第二試薬の基本組成を示す。
＜第一試薬Ａ＞ｐＨ６．６
イミダゾール １２５ｍＭ
酢酸マグネシウム １２．５ｍＭ
ＣｙＤＴＡ ２．０ｍＭ
ＡＤＰ ２．５ｍＭ
ＡＭＰ ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．５μＭ
グルコース ３０ｍＭ
ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ １８７５Ｕ／Ｌ
ヘキソキナーゼ ３７５０Ｕ／Ｌ
ＮＡＣ ３０ｍＭ
＜第二試薬＞ｐＨ９．０
クレアチンリン酸 １５０ｍＭ

上記物質を上記濃度となるよう精製水に溶解し、第一試薬Ａ及び第二試薬を調製した。次に、第一試薬Ａにアミノメタンスルホン酸１ｍＭを添加して第一試薬Ｂを調製した。第一試薬Ａにアミノメタンスルホン酸２ｍＭを添加して第一試薬Ｃを調製した。

上記第一試薬Ａ〜Ｃ及び第二試薬を４℃で１ヶ月間保存した。保存後、日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて第一試薬１８０μｌと、第二試薬４５μｌと、試料として酵素キャリブレータープラス（シスメックス製）５．６μｌとを混合し、３４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。測定は二回行い、測定結果の平均値を下記表２に示した。表２に示す値は吸光度変化量を１００００倍した値である。

長期保存後の第一試薬Ａよりも、アミノメタンスルホン酸を含む長期保存後の第一試薬Ｂ及びＣを用いた方が高い測定値を示した。

これは、アミノメタンスルホン酸とＮＡＣとを共存させることにより長期保存によるＮＡＣの劣化を抑制することができ、試料中のＣＫを充分に活性化できたことを示す。以上より、アミノメタンスルホン酸を添加した試薬を用いることにより試薬の長期保存後でもＣＫの活性を正確に測定できることが判った。

（実施例３）
ＮＡＣ以外のＳＨ化合物を含むＣＫ活性測定用試薬を用いて、アミノメタンスルホン酸によるＳＨ化合物の安定性を評価した。

下記に示す物質を下記濃度となるよう精製水に溶解した。
イミダゾール １２５ｍＭ
酢酸マグネシウム １２．５ｍＭ
ＥＤＴＡ ２．５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５ｍＭ
ＡＭＰ ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．５μＭ
グルコース ３０ｍＭ
ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ １８７５Ｕ／Ｌ
ヘキソキナーゼ ３７５０Ｕ／Ｌ
なお、ｐＨは６．６に調整した。

上記組成に、ＣＫ活性化剤として、システアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、グルタチオン及びチオグリセロールの何れかを３０ｍＭとアミノメタンスルホン酸１０ｍＭとを添加した五種類の第一試薬を調製した。また、ＣＫ活性化剤として、システアミン、ＤＴＴ、システイン、グルタチオン及びチオグリセロールの何れかを３０ｍＭを添加し、アミノメタンスルホン酸を添加せずにさらに五種類の第一試薬を調製した。これら十種類の試薬に対して３７℃で５日間温度負荷をかけた後、試薬中のＳＨ基の定量を行なった。

また、ＣＫ活性化剤として、システアミン、ＤＴＴ、システイン、グルタチオン及びチオグリセロールの何れかを３０ｍＭを添加し、アミノメタンスルホン酸を添加せずに五種類の第一試薬を調製し、温度負荷をかけずに試薬中のＳＨ基の定量を行った。

ＳＨ基の定量は、ＤＴＮＢ（5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)）を用いて行なった。試薬にＤＴＮＢを添加すると、ＳＨ化合物が存在する場合はＳＨ化合物のＳＨ基の量に相当する量のジスルフィド結合が切れて5-Mercapto-2-nitrobenzoic acidが生じる。5-Mercapto-2-nitrobenzoic acidが生じると、波長４１２ｎｍにおける吸光度が上昇するため、これを測定することにより試薬中のＳＨ基の定量を行った。定量結果を下記表３に示す。定量結果は、アミノメタンスルホン酸を添加せずに調製した第一試薬を用いて温度負荷をかけずに定量したＳＨ基の量に対する百分率である。

何れのＣＫ活性化剤を用いても、アミノメタンスルホン酸無添加の第一試薬よりもアミノメタンスルホン酸を添加した第一試薬の方が、温度負荷後のＳＨ基の残存量が多かった。これは、何れのＣＫ活性化剤であってもアミノメタンスルホン酸の添加によって劣化を抑制できたことを示す。従って、アミノメタンスルホン酸は、様々なＣＫ活性化剤の保存安定性を向上できることが判明した。

以上より、アミノメタンスルホン酸を第一試薬及び第二試薬の何れかに含有させることによって、試薬を長期保存した後でも正確にＣＫ活性を測定することができた。

ＣＫ活性測定の反応系を示した模式図である。

Claims (8)

1. アミノメタンスルホン酸と、クレアチンキナーゼ活性化剤とを含有するクレアチンキナーゼ活性測定用試薬。
2. 前記クレアチンキナーゼ活性化剤が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、Ｎ−グアニル−Ｌ−システイン、システアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、グルタチオン、メルカプトコハク酸、チオグルコース、ジチオエリスリトール、メルカプト酢酸、２−メルカプトエタノール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、２−メルカプトエタンスルホン酸及びチオグリセロールからなる群より選択される少なくとも一つである請求項１記載のクレアチンキナーゼ活性測定用試薬。
3. グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びクレアチンリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物をさらに含有する請求項１又は２記載のクレアチンキナーゼ活性測定用試薬。
4. クレアチンキナーゼのＭ型サブユニットに特異的に結合する抗体をさらに含有する請求項１〜３の何れかに記載のクレアチンキナーゼ活性測定用試薬。
5. クレアチンキナーゼ活性化剤、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含有する第一試薬と、アミノメタンスルホン酸及びクレアチンリン酸を含有する第二試薬とからなるクレアチンキナーゼ活性測定用試薬キット。
6. アミノメタンスルホン酸、クレアチンキナーゼ活性化剤、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含有する第一試薬と、クレアチンリン酸を含有する第二試薬とからなるクレアチンキナーゼ活性測定用試薬キット。
7. 劣化したクレアチンキナーゼ活性化剤を、アミノメタンスルホン酸と接触させることによってクレアチンキナーゼを活性化できる状態にする方法。
8. クレアチンキナーゼ活性化剤とアミノメタンスルホン酸とを共存させることにより、クレアチンキナーゼ活性化剤を安定化する方法。
   
   
   
   
   

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