JPH1132798A - チオール化合物の安定化法及び活性測定用組成物 - Google Patents
チオール化合物の安定化法及び活性測定用組成物Info
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- JPH1132798A JPH1132798A JP13160898A JP13160898A JPH1132798A JP H1132798 A JPH1132798 A JP H1132798A JP 13160898 A JP13160898 A JP 13160898A JP 13160898 A JP13160898 A JP 13160898A JP H1132798 A JPH1132798 A JP H1132798A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｎ−アセチルシステイン等のチオール化合物
を安定化する方法、及びチオール化合物を安定化するこ
とにより長期間安定なＣＫ活性測定用組成物を提供す
る。 【解決手段】 チオール化合物にジエチレントリアミン
五酢酸を共存させることを特徴とするチオール化合物の
安定化法、及びチオール化合物とジエチレントリアミン
五酢酸を含有するクレアチンキナーゼ活性測定用組成
物。
を安定化する方法、及びチオール化合物を安定化するこ
とにより長期間安定なＣＫ活性測定用組成物を提供す
る。 【解決手段】 チオール化合物にジエチレントリアミン
五酢酸を共存させることを特徴とするチオール化合物の
安定化法、及びチオール化合物とジエチレントリアミン
五酢酸を含有するクレアチンキナーゼ活性測定用組成
物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、含有するチオール
化合物が安定なクレアチンキナーゼ（以下ＣＫと略記す
る。）活性測定用組成物、及びチオール化合物の安定化
方法に関するものである。
化合物が安定なクレアチンキナーゼ（以下ＣＫと略記す
る。）活性測定用組成物、及びチオール化合物の安定化
方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｎ−アセチルシステイン（以下ＮＡＣと
略記する。）をはじめとするチオール化合物は臨床検査
の領域において、血中ＣＫ測定時の活性化剤、各種臨床
検査用試薬中の酵素の安定化剤等として使用されてい
る。ＣＫは現在臨床検査の領域において心疾患、筋疾患
等の診断のために日常的に測定されている重要な項目の
一つであるが、血清中で速やかに不活性化されるため、
ＣＫ活性を測定する際には、測定用組成物にＣＫ活性化
剤を添加し、該活性化剤によってＣＫを活性化した後に
測定を行う必要がある。ＣＫ活性化剤としては、ＮＡ
Ｃ、２−メルカプトエタノール（以下ＭＥと略記す
る。）、２−メルカプトエタンスルホン酸（以下ＭＥＳ
と略記する。）、ジチオスレイトール（以下ＧＴＴと略
記する。）、ジチオエリスリトール（以下ＧＥＴと略記
する。）、グルタチオン（以下ＧＳＨと略記する。）、
システイン（以下Ｃｙｓと略記する。）、チオグリセロ
ール（以下ＴＧと略記する。）等のチオール化合物（以
下ＳＨ化合物と略記する。）が一般に使用されている。
また、これらのＣＫ活性化剤の中でも、ＣＫ活性化能、
凍結乾燥への適応、溶解後の安定性、臭気、価格等の点
から、日本臨床化学会ではＮＡＣを推奨している。
略記する。）をはじめとするチオール化合物は臨床検査
の領域において、血中ＣＫ測定時の活性化剤、各種臨床
検査用試薬中の酵素の安定化剤等として使用されてい
る。ＣＫは現在臨床検査の領域において心疾患、筋疾患
等の診断のために日常的に測定されている重要な項目の
一つであるが、血清中で速やかに不活性化されるため、
ＣＫ活性を測定する際には、測定用組成物にＣＫ活性化
剤を添加し、該活性化剤によってＣＫを活性化した後に
測定を行う必要がある。ＣＫ活性化剤としては、ＮＡ
Ｃ、２−メルカプトエタノール（以下ＭＥと略記す
る。）、２−メルカプトエタンスルホン酸（以下ＭＥＳ
と略記する。）、ジチオスレイトール（以下ＧＴＴと略
記する。）、ジチオエリスリトール（以下ＧＥＴと略記
する。）、グルタチオン（以下ＧＳＨと略記する。）、
システイン（以下Ｃｙｓと略記する。）、チオグリセロ
ール（以下ＴＧと略記する。）等のチオール化合物（以
下ＳＨ化合物と略記する。）が一般に使用されている。
また、これらのＣＫ活性化剤の中でも、ＣＫ活性化能、
凍結乾燥への適応、溶解後の安定性、臭気、価格等の点
から、日本臨床化学会ではＮＡＣを推奨している。
【０００３】しかしながら、ＮＡＣは溶液中ではＳＨ基
が徐々に酸化されるため長期間ＣＫ活性化能を維持する
ことができない。更にＮＡＣの酸化生成物はＣＫ活性を
阻害することが報告されており、これらの性質がＣＫ測
定用組成物の溶液状態での安定性を維持する上で大きな
問題となっている。上記問題を解決するため種々の検討
が行われた結果、ＣＫ活性測定用組成物にエチレンジア
ミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと略記する。）を添加するこ
とによりＮＡＣの安定性が向上し、併せてＣＫ活性を阻
害するＮＡＣ酸化物の生成を抑制できることが判明し、
日本臨床化学会ではＣＫ活性測定用組成物にＮＡＣとＥ
ＤＴＡを併用して用いることを推奨している。一方、近
年の臨床検査用試薬の動向として、従来の凍結乾燥試薬
とその溶解液を組み合わせた試薬形態から、試薬調製に
伴う煩わしさや、それに起因する調製ミスを防ぐため
に、調製不要の液状形態へと要求が変化しつつある。し
かし、液状形態では、その流通等の点から、従来の凍結
乾燥の形態よりも一段と安定性が必要となっており、上
記のごとく、ＮＡＣとＥＤＴＡの併用では安定性の面で
十分ではなかった。
が徐々に酸化されるため長期間ＣＫ活性化能を維持する
ことができない。更にＮＡＣの酸化生成物はＣＫ活性を
阻害することが報告されており、これらの性質がＣＫ測
定用組成物の溶液状態での安定性を維持する上で大きな
問題となっている。上記問題を解決するため種々の検討
が行われた結果、ＣＫ活性測定用組成物にエチレンジア
ミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと略記する。）を添加するこ
とによりＮＡＣの安定性が向上し、併せてＣＫ活性を阻
害するＮＡＣ酸化物の生成を抑制できることが判明し、
日本臨床化学会ではＣＫ活性測定用組成物にＮＡＣとＥ
ＤＴＡを併用して用いることを推奨している。一方、近
年の臨床検査用試薬の動向として、従来の凍結乾燥試薬
とその溶解液を組み合わせた試薬形態から、試薬調製に
伴う煩わしさや、それに起因する調製ミスを防ぐため
に、調製不要の液状形態へと要求が変化しつつある。し
かし、液状形態では、その流通等の点から、従来の凍結
乾燥の形態よりも一段と安定性が必要となっており、上
記のごとく、ＮＡＣとＥＤＴＡの併用では安定性の面で
十分ではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＮＡＣ等の
ＳＨ化合物を安定化する方法、及びＳＨ化合物を安定化
することにより長期間安定なＣＫ活性測定用組成物を提
供することを目的とするものである。
ＳＨ化合物を安定化する方法、及びＳＨ化合物を安定化
することにより長期間安定なＣＫ活性測定用組成物を提
供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、このよう
な課題を解決するために鋭意検討の結果、ジエチレント
リアミン五酢酸をＳＨ化合物に共存させることにより、
ＳＨ化合物の安定性が飛躍的に向上することを見出し、
さらに、ジエチレントリアミン五酢酸をＳＨ化合物を含
有するＣＫ活性測定用組成物に共存させることにより、
組成物中のＳＨ化合物の安定性が飛躍的に向上し、安定
性に優れたＣＫ活性測定用組成物が得られることを見出
し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、ＳＨ化合
物にジエチレントリアミン五酢酸を共存させることを特
徴とするＳＨ化合物の安定化法、及びＳＨ化合物とジエ
チレントリアミン五酢酸を含有するＣＫ活性測定用組成
物を要旨とするものである。
な課題を解決するために鋭意検討の結果、ジエチレント
リアミン五酢酸をＳＨ化合物に共存させることにより、
ＳＨ化合物の安定性が飛躍的に向上することを見出し、
さらに、ジエチレントリアミン五酢酸をＳＨ化合物を含
有するＣＫ活性測定用組成物に共存させることにより、
組成物中のＳＨ化合物の安定性が飛躍的に向上し、安定
性に優れたＣＫ活性測定用組成物が得られることを見出
し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、ＳＨ化合
物にジエチレントリアミン五酢酸を共存させることを特
徴とするＳＨ化合物の安定化法、及びＳＨ化合物とジエ
チレントリアミン五酢酸を含有するＣＫ活性測定用組成
物を要旨とするものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】本発明のＳＨ化合物の安定化法は、ＳＨ化
合物にジエチレントリアミン五酢酸を共存させればよ
い。
合物にジエチレントリアミン五酢酸を共存させればよ
い。
【０００８】本発明のＳＨ化合物の安定化法は、試薬組
成物、例えば、公知のＣＫ活性測定用組成物等に含有さ
れたＳＨ化合物に対しても適用できる。この場合、試薬
組成物にジエチレントリアミン五酢酸を添加すればよ
い。また、本発明のＳＨ化合物の安定化法は、ＳＨ化合
物を用いる反応や測定法において、用いるＳＨ化合物を
安定化するのにも好適である。
成物、例えば、公知のＣＫ活性測定用組成物等に含有さ
れたＳＨ化合物に対しても適用できる。この場合、試薬
組成物にジエチレントリアミン五酢酸を添加すればよ
い。また、本発明のＳＨ化合物の安定化法は、ＳＨ化合
物を用いる反応や測定法において、用いるＳＨ化合物を
安定化するのにも好適である。
【０００９】ＳＨ化合物を用いる反応や測定法として
は、例えば、ＣＫ活性測定法が挙げられる。ＣＫ活性測
定法としては、ＣＫが触媒する式１の反応の左方向の活
性を測定する方法、例えば、クレアチンリン酸（以下Ｃ
Ｐと略記する。）の加水分解で生ずる無機リン酸を測定
する方法、アデノシン二リン酸（以下ＡＤＰと略記す
る。）をピルビン酸キナーゼ（以下ＰＫと略記する。）
と乳酸脱水素酵素（以下ＬＤＨと略記する。）の作用で
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下ＮＡＤＨと略記する。）に導き、340nm での吸収減少
として測定する方法、ＡＤＰをＰＫでピルビン酸に導
き、次に、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとの反
応で生成したヒドラゾンを測定する方法等が挙げられ
る。
は、例えば、ＣＫ活性測定法が挙げられる。ＣＫ活性測
定法としては、ＣＫが触媒する式１の反応の左方向の活
性を測定する方法、例えば、クレアチンリン酸（以下Ｃ
Ｐと略記する。）の加水分解で生ずる無機リン酸を測定
する方法、アデノシン二リン酸（以下ＡＤＰと略記す
る。）をピルビン酸キナーゼ（以下ＰＫと略記する。）
と乳酸脱水素酵素（以下ＬＤＨと略記する。）の作用で
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下ＮＡＤＨと略記する。）に導き、340nm での吸収減少
として測定する方法、ＡＤＰをＰＫでピルビン酸に導
き、次に、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとの反
応で生成したヒドラゾンを測定する方法等が挙げられ
る。
【００１０】
【化１】
【００１１】しかしながら、これらの方法はいずれも感
度が低いため、あるいは発色が不安定なため、近年はほ
とんど使用されていない。また、他のＣＫ活性測定法と
して、式１の反応の右方向の活性を測定する方法、例え
ば、生成したクレアチンを色素と反応させて比色する、
あるいは蛍光を測定する方法、ルシフェラーゼを用いる
方法（特開昭51-41597号公報、特開昭55-120796 号公
報、特開昭56-26200号公報、特開昭57-105199 号公
報）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（以下ＰＧＫと略記
する。）とグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと略記する。）を用いる方法
（特公昭59-34119号公報、特開昭56-155000 号公報）、
ヘキソキナーゼ（以下ＨＫと略記する。）又はグルコキ
ナーゼ（以下ＧｌｃＫと略記する。）とグルコース−６
−リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６ＰＤＨと略記する。）を
用いる方法等が挙げられる。上記方法のうち、比色法、
蛍光法は測定値の信頼性が劣ること、また、ルシフェラ
ーゼ法は高価なルシフェラーゼを使用しなければなら
ず、測定装置が特殊なものとなること、さらに、ＰＧＫ
／ＧＡＰＤＨ法はＰＫ／ＬＤＨ法と同様の欠点を有し、
しかもＰＫ、ＬＤＨよりも高価なＰＧＫ、ＧＡＰＤＨを
使用しなければならないこと、等からいずれも実用に供
するには十分とはいえない。一方、ＨＫ又はＧｌｃＫ／
Ｇ６ＰＤＨ法は原理的に最も優れ、感度、再現性も良い
こと、及び多数検体処理も可能なことから最も多用され
ており、その反応原理は式１、式２、式３で示される。
度が低いため、あるいは発色が不安定なため、近年はほ
とんど使用されていない。また、他のＣＫ活性測定法と
して、式１の反応の右方向の活性を測定する方法、例え
ば、生成したクレアチンを色素と反応させて比色する、
あるいは蛍光を測定する方法、ルシフェラーゼを用いる
方法（特開昭51-41597号公報、特開昭55-120796 号公
報、特開昭56-26200号公報、特開昭57-105199 号公
報）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（以下ＰＧＫと略記
する。）とグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと略記する。）を用いる方法
（特公昭59-34119号公報、特開昭56-155000 号公報）、
ヘキソキナーゼ（以下ＨＫと略記する。）又はグルコキ
ナーゼ（以下ＧｌｃＫと略記する。）とグルコース−６
−リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６ＰＤＨと略記する。）を
用いる方法等が挙げられる。上記方法のうち、比色法、
蛍光法は測定値の信頼性が劣ること、また、ルシフェラ
ーゼ法は高価なルシフェラーゼを使用しなければなら
ず、測定装置が特殊なものとなること、さらに、ＰＧＫ
／ＧＡＰＤＨ法はＰＫ／ＬＤＨ法と同様の欠点を有し、
しかもＰＫ、ＬＤＨよりも高価なＰＧＫ、ＧＡＰＤＨを
使用しなければならないこと、等からいずれも実用に供
するには十分とはいえない。一方、ＨＫ又はＧｌｃＫ／
Ｇ６ＰＤＨ法は原理的に最も優れ、感度、再現性も良い
こと、及び多数検体処理も可能なことから最も多用され
ており、その反応原理は式１、式２、式３で示される。
【００１２】
【化２】
【００１３】
【化３】
【００１４】
【化４】
【００１５】本発明のＳＨ化合物の安定化法は、上記い
ずれのＣＫ活性測定法にも適用できるが、ＨＫ又はＧｌ
ｃＫ／Ｇ６ＰＤＨ法への適用が特に適している。
ずれのＣＫ活性測定法にも適用できるが、ＨＫ又はＧｌ
ｃＫ／Ｇ６ＰＤＨ法への適用が特に適している。
【００１６】本発明のＣＫ活性測定用組成物は、ＣＫ活
性化剤としてＳＨ化合物、ＳＨ化合物を安定化するため
にジエチレントリアミン五酢酸を含有するものである。
その他の成分としては、例えば、ＣＰ、ＡＤＰ、グルコ
ース、ＨＫ又はＧｌｃＫ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、Ｇ６Ｐ
ＤＨ、マグネシウム塩類等を含有するものであり、公知
のＣＫ活性測定法で通常用いられる試薬組成物を有する
ものであればよい。
性化剤としてＳＨ化合物、ＳＨ化合物を安定化するため
にジエチレントリアミン五酢酸を含有するものである。
その他の成分としては、例えば、ＣＰ、ＡＤＰ、グルコ
ース、ＨＫ又はＧｌｃＫ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、Ｇ６Ｐ
ＤＨ、マグネシウム塩類等を含有するものであり、公知
のＣＫ活性測定法で通常用いられる試薬組成物を有する
ものであればよい。
【００１７】本発明のＣＫ測定用組成物に用いられるＳ
Ｈ化合物としては、例えば、ＮＡＣ、ＭＥ、ＭＥＳ、Ｇ
ＴＴ、ＧＥＴ、ＧＳＨ、Ｃｙｓ、ＴＧ等が挙げられる。
ＣＫ測定用組成物中のＳＨ化合物の濃度は、ＣＫ活性化
能が生ずる濃度以上であれば良く、例えば、ＳＨ化合物
としてＮＡＣを用いる場合、反応液中の濃度が0.1 〜20
0mM 、好ましくは20〜100mM である。また、複数のＳＨ
化合物を適宜組み合わせて使用してもよい。
Ｈ化合物としては、例えば、ＮＡＣ、ＭＥ、ＭＥＳ、Ｇ
ＴＴ、ＧＥＴ、ＧＳＨ、Ｃｙｓ、ＴＧ等が挙げられる。
ＣＫ測定用組成物中のＳＨ化合物の濃度は、ＣＫ活性化
能が生ずる濃度以上であれば良く、例えば、ＳＨ化合物
としてＮＡＣを用いる場合、反応液中の濃度が0.1 〜20
0mM 、好ましくは20〜100mM である。また、複数のＳＨ
化合物を適宜組み合わせて使用してもよい。
【００１８】本発明のＣＫ活性測定用組成物中のジエチ
レントリアミン五酢酸の濃度としては、ＳＨ化合物が安
定化する濃度以上であればよく、例えば、ＳＨ化合物の
存在する溶液中で0.005mM 〜20mM、好ましくは0.1mM 〜
５mMである。
レントリアミン五酢酸の濃度としては、ＳＨ化合物が安
定化する濃度以上であればよく、例えば、ＳＨ化合物の
存在する溶液中で0.005mM 〜20mM、好ましくは0.1mM 〜
５mMである。
【００１９】本発明のＣＫ活性測定用組成物がＨＫやＧ
ｌｃＫを含有する場合、これらの酵素の給源は限定され
るものではない。ＨＫとしては、例えば、ベーカーズ
イースト（Bakers Yeast）由来のもの等を使用すること
ができる。また、ＨＫよりもグルコースに対して基質特
異性が高いＧｌｃＫとしては、例えば、エーロバクター
エーロゲネス等の微生物由来のもの、動物由来のもの
等各種のものを使用することができるが、最適生育温度
が50℃ないし85℃である微生物の産生するものが好まし
い。例えば、バチルス ステアロサーモフィルス、バチ
ルス サーモプロテオリテイカス、バチルス アシドカ
ルダリウス等のバチルス属、サーモアクチノマイセス
属、サーマス属、サーモミクロビウム属、カルデリア属
等の微生物が挙げられる。特に好ましい微生物として
は、バチルス ステアロサーモフィルスが挙げられ、そ
の具体例としては、ATCC7933、7954、10194 、12980 、
NCA1503 、UK563 株（微工研菌寄第7275号、FERM P-727
5 、昭和58年９月29日寄託）等が挙げられる。
ｌｃＫを含有する場合、これらの酵素の給源は限定され
るものではない。ＨＫとしては、例えば、ベーカーズ
イースト（Bakers Yeast）由来のもの等を使用すること
ができる。また、ＨＫよりもグルコースに対して基質特
異性が高いＧｌｃＫとしては、例えば、エーロバクター
エーロゲネス等の微生物由来のもの、動物由来のもの
等各種のものを使用することができるが、最適生育温度
が50℃ないし85℃である微生物の産生するものが好まし
い。例えば、バチルス ステアロサーモフィルス、バチ
ルス サーモプロテオリテイカス、バチルス アシドカ
ルダリウス等のバチルス属、サーモアクチノマイセス
属、サーマス属、サーモミクロビウム属、カルデリア属
等の微生物が挙げられる。特に好ましい微生物として
は、バチルス ステアロサーモフィルスが挙げられ、そ
の具体例としては、ATCC7933、7954、10194 、12980 、
NCA1503 、UK563 株（微工研菌寄第7275号、FERM P-727
5 、昭和58年９月29日寄託）等が挙げられる。
【００２０】ＣＫ活性測定用組成物中のＨＫやＧｌｃＫ
は、ＣＫ活性測定時の濃度が公知の測定法で用いられて
いる濃度範囲となるように添加すればよい。例えば、Ｃ
Ｋ活性測定時の反応液中の濃度が 0.5〜20U/ml、好まし
くは１〜６U/mlとなるように添加すればよい。
は、ＣＫ活性測定時の濃度が公知の測定法で用いられて
いる濃度範囲となるように添加すればよい。例えば、Ｃ
Ｋ活性測定時の反応液中の濃度が 0.5〜20U/ml、好まし
くは１〜６U/mlとなるように添加すればよい。
【００２１】本発明のＣＫ活性測定用組成物がＧ６ＰＤ
Ｈを含有する場合、その給源は限定されるものではない
が、好ましくは補酵素としてＮＡＤＰだけでなくＮＡＤ
にも作用するＧ６ＰＤＨ（例えば、ロイコノストックメ
センテロイデス、シュードモナス フルオレッセンス由
来等）、さらに好ましくはＮＡＤ、ＮＡＤＰ共に作用
し、かつ安定性、保存性に富む好熱性細菌由来のＧ６Ｐ
ＤＨが好ましい。これらのＧ６ＰＤＨは、ＣＫ活性測定
時の濃度が公知の測定法で用いられている濃度範囲とな
るように添加すればよく、例えば、ＣＫ活性測定時の反
応液中の濃度が 0.5〜40U/ml、好ましくは１〜10U/mlと
なるように添加すればよい。
Ｈを含有する場合、その給源は限定されるものではない
が、好ましくは補酵素としてＮＡＤＰだけでなくＮＡＤ
にも作用するＧ６ＰＤＨ（例えば、ロイコノストックメ
センテロイデス、シュードモナス フルオレッセンス由
来等）、さらに好ましくはＮＡＤ、ＮＡＤＰ共に作用
し、かつ安定性、保存性に富む好熱性細菌由来のＧ６Ｐ
ＤＨが好ましい。これらのＧ６ＰＤＨは、ＣＫ活性測定
時の濃度が公知の測定法で用いられている濃度範囲とな
るように添加すればよく、例えば、ＣＫ活性測定時の反
応液中の濃度が 0.5〜40U/ml、好ましくは１〜10U/mlと
なるように添加すればよい。
【００２２】本発明のＣＫ活性測定用組成物に使用され
るＮＡＤ、ＮＡＤＰは、ＣＫ活性測定時の濃度が公知の
測定法で用いられる濃度範囲となるように添加すればよ
く、例えば、ＣＫ活性測定時の反応液中の濃度が 0.1〜
10mM、好ましくは１〜５mMとなるように添加すればよ
い。
るＮＡＤ、ＮＡＤＰは、ＣＫ活性測定時の濃度が公知の
測定法で用いられる濃度範囲となるように添加すればよ
く、例えば、ＣＫ活性測定時の反応液中の濃度が 0.1〜
10mM、好ましくは１〜５mMとなるように添加すればよ
い。
【００２３】本発明のＣＫ活性測定用組成物に使用され
るＡＤＰは、反応液中に高濃度存在させるとＣＫ活性阻
害が認められるため、ＣＫ活性測定時の反応液中の濃度
が 0.1〜10mM、好ましくは１〜5mM となるように添加す
ればよい。
るＡＤＰは、反応液中に高濃度存在させるとＣＫ活性阻
害が認められるため、ＣＫ活性測定時の反応液中の濃度
が 0.1〜10mM、好ましくは１〜5mM となるように添加す
ればよい。
【００２４】本発明のＣＫ活性測定用組成物に使用され
るＣＰは、反応液中に高濃度存在させるとＣＫ活性阻害
が認められるため、ＣＫ活性測定時の反応液中の濃度が
５〜70mM、好ましくは20〜50mMとなるように添加すれば
よい。
るＣＰは、反応液中に高濃度存在させるとＣＫ活性阻害
が認められるため、ＣＫ活性測定時の反応液中の濃度が
５〜70mM、好ましくは20〜50mMとなるように添加すれば
よい。
【００２５】本発明のＣＫ活性測定用組成物に使用され
るグルコースは、ＣＫ活性測定時の濃度が公知の測定法
で用いられる濃度範囲となるように添加すればよく、Ｃ
Ｋ活性測定時の反応液中の濃度が１〜200mM 、好ましく
は５〜50mMとなるように添加すればよい。
るグルコースは、ＣＫ活性測定時の濃度が公知の測定法
で用いられる濃度範囲となるように添加すればよく、Ｃ
Ｋ活性測定時の反応液中の濃度が１〜200mM 、好ましく
は５〜50mMとなるように添加すればよい。
【００２６】本発明のＣＫ活性測定用組成物に使用され
るマグネシウム塩は、例えば、酢酸マグネシウム、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム等、通常当分野で用い
られるマグネシウム塩のいずれのものでも使用すること
ができる。ただし、ＣＫは陰イオンにより非競合阻害を
受けることが知られているので、阻害の程度が小さい陰
イオンを解離する酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム
等を用いることが好ましい。マグネシウム塩類の濃度は
公知の測定法で用いられる濃度範囲となるように添加す
ればよく、ＣＫ活性測定時の反応液中の濃度が２〜50m
M、好ましくは５〜25mMとなるように添加すればよい。
るマグネシウム塩は、例えば、酢酸マグネシウム、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム等、通常当分野で用い
られるマグネシウム塩のいずれのものでも使用すること
ができる。ただし、ＣＫは陰イオンにより非競合阻害を
受けることが知られているので、阻害の程度が小さい陰
イオンを解離する酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム
等を用いることが好ましい。マグネシウム塩類の濃度は
公知の測定法で用いられる濃度範囲となるように添加す
ればよく、ＣＫ活性測定時の反応液中の濃度が２〜50m
M、好ましくは５〜25mMとなるように添加すればよい。
【００２７】また、本発明のＣＫ活性測定用組成物に
は、上記物質の他、当分野で用いられるアジ化ナトリウ
ム等の防腐剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝剤等を適宜
使用することができる。
は、上記物質の他、当分野で用いられるアジ化ナトリウ
ム等の防腐剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝剤等を適宜
使用することができる。
【００２８】また、体液試料中にはＣＫ活性に正誤差を
与えるアデニル酸キナーゼ（以下ＡＫと略記する。）が
含まれているため、本発明のＣＫ活性測定用組成物に
は、ＡＫ活性を阻害する作用を有するアデノシン一リン
酸（以下ＡＭＰと略記する。）や、ジアデノシン五リン
酸（以下Ａｐ５Ａと略記する。）等を添加するのが好ま
しい。
与えるアデニル酸キナーゼ（以下ＡＫと略記する。）が
含まれているため、本発明のＣＫ活性測定用組成物に
は、ＡＫ活性を阻害する作用を有するアデノシン一リン
酸（以下ＡＭＰと略記する。）や、ジアデノシン五リン
酸（以下Ａｐ５Ａと略記する。）等を添加するのが好ま
しい。
【００２９】本発明のＣＫ活性測定用組成物は、一試薬
系でも使用できるが、自動分析機の都合上や安定性の向
上等のため、公知技術を適宜組み合わせて二試薬系に分
けて使用することも可能である。この場合、ＨＫ又はＧ
ｌｃＫ、Ｇ６ＰＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）、マグネシウム塩、
グルコース、ＡＤＰ等からなる第一試薬と、ＣＰ等から
なる第二試薬とに分け、検体盲検を差し引くことにより
検体中の各種共存物質の影響回避を更に強固にする、ダ
ブルキネティック法対応試薬系とすることが可能であ
る。また、酸性溶液中で安定なＮＡＣ等のＳＨ化合物、
ＮＡＤ（Ｐ）と、アルカリ性溶液中で安定なＣＰとを分
配し、各々好ましいｐＨの溶液とすることもできる。
系でも使用できるが、自動分析機の都合上や安定性の向
上等のため、公知技術を適宜組み合わせて二試薬系に分
けて使用することも可能である。この場合、ＨＫ又はＧ
ｌｃＫ、Ｇ６ＰＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）、マグネシウム塩、
グルコース、ＡＤＰ等からなる第一試薬と、ＣＰ等から
なる第二試薬とに分け、検体盲検を差し引くことにより
検体中の各種共存物質の影響回避を更に強固にする、ダ
ブルキネティック法対応試薬系とすることが可能であ
る。また、酸性溶液中で安定なＮＡＣ等のＳＨ化合物、
ＮＡＤ（Ｐ）と、アルカリ性溶液中で安定なＣＰとを分
配し、各々好ましいｐＨの溶液とすることもできる。
【００３０】本発明のＣＫ活性測定用組成物を使用して
ＣＫ活性の測定を行うには、公知の操作法に従って行え
ばよい。
ＣＫ活性の測定を行うには、公知の操作法に従って行え
ばよい。
【００３１】
【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。
る。
【００３２】実施例１ 〔保存溶液の調製〕イミダゾール緩衝液 125mM、酢酸マ
グネシウム10mM、ＡＤＰ2.5mM 、ＮＡＤＰ2.5mM、ＮＡ
Ｃ 25mM 、Ａｐ５Ａ 0.013mM、ＡＭＰ6.25mM、グルコー
ス25mM、アジ化ナトリウム15mM、ジエチレントリアミン
五酢酸（以下ＤＴＰＡと略記する）２mMとなるように溶
解した後、酢酸で pH6.6（30℃）に調整し、ＧｌｃＫ
（ユニチカ社製）４U/ml、Ｇ６ＰＤＨ（ベーリンガーマ
ンハイム社製）1.9U/ml を添加した後、25℃で所定期間
保存した。 〔ＮＡＣ濃度の測定〕保存前及び所定期間保存した後の
上記保存溶液中のＮＡＣ（ＳＨ基）濃度をジチオビスニ
トロベンゼン酸（ＤＴＮＢ）法により測定した。すなわ
ち、ジチオビスニトロベンゼン酸を含む反応液（エルマ
ン試薬）に測定試料（各保存溶液）を添加した時のチオ
ニトロ安息香酸の生成量を 415nmにおける吸光度変化か
ら測定した。その結果を表１に示す。
グネシウム10mM、ＡＤＰ2.5mM 、ＮＡＤＰ2.5mM、ＮＡ
Ｃ 25mM 、Ａｐ５Ａ 0.013mM、ＡＭＰ6.25mM、グルコー
ス25mM、アジ化ナトリウム15mM、ジエチレントリアミン
五酢酸（以下ＤＴＰＡと略記する）２mMとなるように溶
解した後、酢酸で pH6.6（30℃）に調整し、ＧｌｃＫ
（ユニチカ社製）４U/ml、Ｇ６ＰＤＨ（ベーリンガーマ
ンハイム社製）1.9U/ml を添加した後、25℃で所定期間
保存した。 〔ＮＡＣ濃度の測定〕保存前及び所定期間保存した後の
上記保存溶液中のＮＡＣ（ＳＨ基）濃度をジチオビスニ
トロベンゼン酸（ＤＴＮＢ）法により測定した。すなわ
ち、ジチオビスニトロベンゼン酸を含む反応液（エルマ
ン試薬）に測定試料（各保存溶液）を添加した時のチオ
ニトロ安息香酸の生成量を 415nmにおける吸光度変化か
ら測定した。その結果を表１に示す。
【００３３】実施例２ 実施例１の保存溶液中のＤＴＰＡ２mMの代わりにＥＤＴ
Ａ１mMとＤＴＰＡ１mMを使用した以外は、実施例１と同
様に保存溶液を調製し、保存溶液中のＮＡＣ（ＳＨ基）
濃度を測定した。その結果を表１に示す。
Ａ１mMとＤＴＰＡ１mMを使用した以外は、実施例１と同
様に保存溶液を調製し、保存溶液中のＮＡＣ（ＳＨ基）
濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【００３４】比較例１ 実施例１の保存溶液中のＤＴＰＡ２mMの代わりにＥＤＴ
Ａ２mMを使用した以外は、実施例１と同様に保存溶液を
調製し、保存溶液中のＮＡＣ（ＳＨ基）濃度を測定し
た。その結果を表１に示す。
Ａ２mMを使用した以外は、実施例１と同様に保存溶液を
調製し、保存溶液中のＮＡＣ（ＳＨ基）濃度を測定し
た。その結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】表中の値は、各測定時におけるＮＡＣ濃度
を保存前のＮＡＣ濃度に対する相対値（％）として示し
た。
を保存前のＮＡＣ濃度に対する相対値（％）として示し
た。
【００３７】表１から、ＥＤＴＡと比較して、ＤＴＰＡ
が顕著にＮＡＣを安定化することが明らかである。ま
た、ＥＤＴＡとＤＴＰＡを併用した場合も、ＥＤＴＡ単
独使用と比較して、有意にＮＡＣを安定化できることが
明らかである。
が顕著にＮＡＣを安定化することが明らかである。ま
た、ＥＤＴＡとＤＴＰＡを併用した場合も、ＥＤＴＡ単
独使用と比較して、有意にＮＡＣを安定化できることが
明らかである。
【００３８】実施例３ 〔保存溶液の調製〕実施例１で使用した保存溶液中のＮ
ＡＣを50mMとした。また、これとは別に、ＮＡＣに代え
てＭＥ、ＭＥＳ、ＤＴＴ、ＤＴＥ、ＧＳＨ、ＣｙＳをそ
れぞれ50mM使用した溶液を調製した。 〔ＳＨ基濃度の測定〕上記の各保存溶液を実施例１と同
様に保存し、各保存溶液中のＮＡＣ、ＭＥ、ＭＥＳ、Ｄ
ＴＴ、ＤＴＥ、ＧＳＨ、ＣｙＳの濃度を実施例１と同様
の方法でそれぞれ測定した。その結果を表２に示す。
ＡＣを50mMとした。また、これとは別に、ＮＡＣに代え
てＭＥ、ＭＥＳ、ＤＴＴ、ＤＴＥ、ＧＳＨ、ＣｙＳをそ
れぞれ50mM使用した溶液を調製した。 〔ＳＨ基濃度の測定〕上記の各保存溶液を実施例１と同
様に保存し、各保存溶液中のＮＡＣ、ＭＥ、ＭＥＳ、Ｄ
ＴＴ、ＤＴＥ、ＧＳＨ、ＣｙＳの濃度を実施例１と同様
の方法でそれぞれ測定した。その結果を表２に示す。
【００３９】比較例２ 〔保存溶液〕実施例３で使用した各保存溶液中のＤＴＰ
Ａの代わりにＥＤＴＡを使用した以外は、実施例３と同
様に、各保存溶液を調製し、各保存溶液中のＮＡＣ、Ｍ
Ｅ、ＭＥＳ、ＤＴＴ、ＤＴＥ、ＧＳＨ、ＣｙＳの濃度を
測定した。その結果を表２に示す。
Ａの代わりにＥＤＴＡを使用した以外は、実施例３と同
様に、各保存溶液を調製し、各保存溶液中のＮＡＣ、Ｍ
Ｅ、ＭＥＳ、ＤＴＴ、ＤＴＥ、ＧＳＨ、ＣｙＳの濃度を
測定した。その結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】表中の値は、各測定時におけるＳＨ化合物
のＳＨ基濃度を保存前のＳＨ化合物のＳＨ基濃度に対す
る相対値（％）として示した。
のＳＨ基濃度を保存前のＳＨ化合物のＳＨ基濃度に対す
る相対値（％）として示した。
【００４２】表２から、ＤＴＰＡはＮＡＣだけでなく他
のチオール化合物についても、ＥＤＴＡと比較し有意に
安定化することが明らかである。
のチオール化合物についても、ＥＤＴＡと比較し有意に
安定化することが明らかである。
【００４３】実施例４ 〔保存溶液の調製〕実施例１と同様に保存溶液を調製
し、30℃で３週間保存した。 〔ＣＫ活性値の測定〕保存前及び30℃で３週間保存した
上記保存溶液を第一試薬（以下Ｒ１と略記する。）と
し、ＣＰの150mM 水溶液を第二試薬（以下Ｒ２と略記す
る。）として、２種のヒト血清、４種の標準血清中のＣ
Ｋ活性値を測定した。なお測定は、Ｒ１320μL 、Ｒ２
80 μL 、試料８μL を用い、日立７０７０形自動分析
装置により行った。保存溶液調製当日の各試料のＣＫ測
定値を 100％として、30℃で３週間保存後の相対ＣＫ測
定値を算出した。その結果を表３に示す。
し、30℃で３週間保存した。 〔ＣＫ活性値の測定〕保存前及び30℃で３週間保存した
上記保存溶液を第一試薬（以下Ｒ１と略記する。）と
し、ＣＰの150mM 水溶液を第二試薬（以下Ｒ２と略記す
る。）として、２種のヒト血清、４種の標準血清中のＣ
Ｋ活性値を測定した。なお測定は、Ｒ１320μL 、Ｒ２
80 μL 、試料８μL を用い、日立７０７０形自動分析
装置により行った。保存溶液調製当日の各試料のＣＫ測
定値を 100％として、30℃で３週間保存後の相対ＣＫ測
定値を算出した。その結果を表３に示す。
【００４４】実施例５ 実施例４の保存溶液中のＤＴＰＡ２mMの代わりにＥＤＴ
Ａ１mMとＤＴＰＡ１mMを使用した以外は、実施例４と同
様に保存溶液を調製して30℃で３週間保存し、これをＲ
１として実施例４と同様に各試料中のＣＫ活性値を測定
した。その結果を表３に示す。
Ａ１mMとＤＴＰＡ１mMを使用した以外は、実施例４と同
様に保存溶液を調製して30℃で３週間保存し、これをＲ
１として実施例４と同様に各試料中のＣＫ活性値を測定
した。その結果を表３に示す。
【００４５】比較例３ 実施例４の保存溶液中のＤＴＰＡ２mMの代わりにＥＤＴ
Ａ２mMを使用した以外は、実施例４と同様に保存溶液を
調製して30℃で３週間保存し、これをＲ１として実施例
４と同様に各試料中のＣＫ活性値を測定した。その結果
を表３に示す。
Ａ２mMを使用した以外は、実施例４と同様に保存溶液を
調製して30℃で３週間保存し、これをＲ１として実施例
４と同様に各試料中のＣＫ活性値を測定した。その結果
を表３に示す。
【００４６】
【表３】
【００４７】表３から、ＥＤＴＡ使用ＣＫ測定用組成物
と比較して、ＤＴＰＡ使用ＣＫ測定用組成物ではＣＫ測
定値の変動が顕著に小さいことが明らかであるので、Ｄ
ＴＰＡ使用ＣＫ測定用組成物が有意に安定であることも
明らかである。また、ＥＤＴＡとＤＴＰＡを併用した場
合も、ＥＤＴＡ単独使用と比較して、有意に安定である
ことが明らかである。
と比較して、ＤＴＰＡ使用ＣＫ測定用組成物ではＣＫ測
定値の変動が顕著に小さいことが明らかであるので、Ｄ
ＴＰＡ使用ＣＫ測定用組成物が有意に安定であることも
明らかである。また、ＥＤＴＡとＤＴＰＡを併用した場
合も、ＥＤＴＡ単独使用と比較して、有意に安定である
ことが明らかである。
【００４８】
【発明の効果】本発明の方法は、共存するＮＡＣ等のＳ
Ｈ化合物を安定化することができるものである。また、
本発明のＣＫ活性測定用組成物は、共存するＳＨ化合物
が安定なので、長期間安定である。
Ｈ化合物を安定化することができるものである。また、
本発明のＣＫ活性測定用組成物は、共存するＳＨ化合物
が安定なので、長期間安定である。
Claims (2)
- 【請求項１】 チオール化合物にジエチレントリアミン
五酢酸を共存させることを特徴とするチオール化合物の
安定化法。 - 【請求項２】 チオール化合物とジエチレントリアミン
五酢酸を含有するクレアチンキナーゼ活性測定用組成
物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13160898A JPH1132798A (ja) | 1997-05-22 | 1998-05-14 | チオール化合物の安定化法及び活性測定用組成物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-131887 | 1997-05-22 | ||
| JP13188797 | 1997-05-22 | ||
| JP13160898A JPH1132798A (ja) | 1997-05-22 | 1998-05-14 | チオール化合物の安定化法及び活性測定用組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1132798A true JPH1132798A (ja) | 1999-02-09 |
Family
ID=26466388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13160898A Pending JPH1132798A (ja) | 1997-05-22 | 1998-05-14 | チオール化合物の安定化法及び活性測定用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1132798A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007049931A (ja) * | 2005-08-17 | 2007-03-01 | Sysmex Corp | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 |
-
1998
- 1998-05-14 JP JP13160898A patent/JPH1132798A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007049931A (ja) * | 2005-08-17 | 2007-03-01 | Sysmex Corp | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050511 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20071002 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080219 |