JP4050384B2 - ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼの安定化法及び試薬組成物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼの安定化法及び安定性に優れたヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼを含んでなる試薬組成物に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
ヘキソキナーゼ(以下、HKと略記する。)はマグネシウムの存在下でグルコースとアデノシン三リン酸(以下、ATPと略記する。)から、グルコース−6−リン酸及びアデノシン二リン酸(以下、ADPと略記する。)を産生する反応を触媒する酵素である。また、HKはフルクトース、マンノース、N −アセチルグルコサミン等にも作用して各糖の6−リン酸エステルを産生するので、特異性はあまり高くない。一方、グルコキナーゼ(以下、GlcKと略記する。)はHKと同様グルコースのリン酸化を触媒する酵素であるが、グルコースに対する特異性が高く、フルクトース、マンノース等には作用しない。この性質を利用して、HK及びGlcKは分析試料中のグルコース関連物質の定量や、関連酵素の活性測定に広く使用されている。特に、生体由来試料中の前記物質の測定において重要な役割を担っている。例えば、血中クレアチンキナーゼ(以下、CKと略記する。)測定は現在臨床検査の領域において心疾患、筋疾患等のために、血中及び尿中のグルコース測定は糖尿病の診断のために日常的に行われている重要な項目の一つであるが、いずれもHK又はGlcKを使用した測定法が多く用いられている。
【0003】
一方、近年の臨床検査用試薬の動向として、従来の凍結乾燥試薬とその溶解液を組み合わせた試薬形態から、試薬調製に伴う煩わしさや、それに起因する調製ミスを防ぐために、調製不要の液状形態へと要求が変化しつつある。しかし、液状形態では、その流通等の点から、従来の凍結乾燥の形態よりも一段と安定性が必要となっている。
従来、HKを安定化するためにN−アセチルシステイン(以下、NACと略記する。)、メルカプトエタノール等のチオール基保護剤や金属キレート剤を共存させる方法が用いられてきたが、その安定化効果は十分なものではない。また、近年HKを化学修飾して安定化する方法も提案されているが(特許第2539225 号)、その修飾操作は煩雑で実用的でない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、HK又はGlcKの安定化法及びHK又はGlcKを含有する安定な試薬組成物を提供することを目的とするものである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、このような課題を解決するために鋭意検討の結果、カルボニル試薬又はその塩をHK又はGlcKに共存させることにより、HK又はGlcKの安定性が飛躍的に向上することを見出し、さらに、カルボニル試薬又はその塩を、HK又はGlcKを含有する試薬組成物に共存させることにより、試薬組成物中のHK又はGlcKの安定性が飛躍的に向上し、安定性に優れた試薬組成物が得られることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、HK又はGlcKにカルボニル試薬又はその塩を共存させることを特徴とするHK又はGlcKの安定化法、及びHK又はGlcKにカルボニル試薬又はその塩が共存する試薬組成物を要旨とするものである。
【0006】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0007】
本発明の安定化法及び試薬組成物において、HK又はGlcKに共存させるカルボニル試薬及びその塩としては、例えば、塩酸ヒドロキシルアミン、硫酸ヒドロキシルアミン、シュウ酸ヒドロキシルアミン等のヒドロキシルアミン類、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩、ベンゾイルヒドラジン、エチルカルバゼート、4−フェニルセミカルバジド等が挙げられる。
【0008】
本発明の安定化法では、上記カルボニル試薬及びその塩を少なくとも一種以上、HK又はGlcKに共存させればよい。
【0009】
共存させるカルボニル試薬及びその塩の濃度としては、HK又はGlcKの安定化能が生ずる濃度以上であれば良く、例えば、HK又はGlcKの存在する溶液中で0.01〜50mM、好ましくは 0.1〜20mMである。
【0010】
本発明でカルボニル試薬及びその塩を共存させるHK又はGlcKを含有する試薬組成物としては、特に限定されるものではなく、例えば、公知の試薬組成物等が挙げられる。このような試薬組成物の例としては、HK又はGlcKとグルコース−6−リン酸脱水素酵素(以下、G6PDHと略記する。)を用いてCKが触媒する式1の反応の右方向の活性を、式2、式3の反応を通して測定する試薬等が挙げられる。
【0011】
【化1】
【0012】
【化2】
【0013】
【化3】
【0014】
また、式2、式3の反応に示すごとく、HK又はGlcKとG6PDHを用いて試料中のグルコース、又はマグネシウムを定量する試薬組成物にも、カルボニル試薬及びその塩を共存させることにより、試薬組成物中のHK又はGlcKを安定化することができ、安定性に優れた試薬組成物を得ることができる。
【0015】
本発明の試薬組成物では、HK又はGlcKを含有する試薬組成物に上記カルボニル試薬及びその塩を少なくとも一種以上共存させればよい。
【0016】
共存させるカルボニル試薬及びその塩の試薬組成物中の濃度としては、HK又はGlcKの安定化能が生ずる濃度以上であれば良く、例えば、HK又はGlcKの存在する溶液中で0.01〜50mM、好ましくは 0.1〜20mMである。
【0017】
本発明の試薬組成物としては、HK又はGlcK、ヒドロキシルアミン類等のカルボニル試薬又はその塩と、例えば、CP、ADP、グルコース、NAD又はNADP、G6PDH、マグネシウム塩類等を成分として調製されたもの等が挙げられる。
【0018】
HKとしては、酵母や大腸菌、バチルス属由来のもの等を使用することができ、特にバチルス属由来のものが最も好ましい。
【0019】
また、GlcKとしては、例えば、バチルス ステアロサーモフィルス、バチルス サーモプロテオリテイカス、バチルス アシドカルダリウス等のバチルス属、サーモアクチノマイセス属、サーマス属、サーモミクロビウム属、カルデリア属等の微生物由来のものが挙げられる。これらの中でも特に好ましい微生物としては、バチルス ステアロサーモフィルスが挙げられ、その具体例としては、ATCC7933、7954、10194 、12980 、NCA1503 、UK563 株(微工研菌寄第7275号、FERM P-7275 、昭和58年9月29日寄託)等が挙げられる。
【0020】
試薬組成物中のHK又はGlcKは、公知の測定法で用いられている濃度範囲となるように添加すればよく、例えば、CK活性測定時の反応液では濃度が 0.5〜20U/ml、好ましくは1〜6U/mlとなるように添加すればよい。
【0021】
本発明の試薬組成物を使用して各種測定を行うには、公知の操作法に従って行えばよい。
【0022】
【実施例】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。
【0023】
実施例1〜実施例4
〔保存溶液の調製〕
イミダゾール緩衝液 125mM、酢酸マグネシウム 10mM 、ADP2.5mM 、NADP 2.5mM、NAC25mM、Ap5A 0.013mM、AMP6.25mM、グルコース25mM、アジ化ナトリウム15mM、EDTA2mM、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩10mMとなるように溶解した後、酢酸でpH6.6 (30℃)に調整し、HK(バチルス属由来、旭化成社製)4U/ml、G6PDH(ベーリンガーマンハイム社製)1.9U/ml を添加した後、25℃で所定期間保存した(実施例1)。
これとは別に、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩10mMに代えて、ベンゾイルヒドラジン(実施例2)、エチルカルバゼート(実施例3)、4−フェニルセミカルバジド(実施例4)をそれぞれ10mMとなるように溶解した溶液を調製し、25℃で所定期間保存した。
〔HK活性の測定〕
保存前及び25℃で所定期間保存した後の上記各保存液中のHK活性を測定した。HK活性の測定は、基質としてグルコースとATP、補酵素としてNADP、共役酵素としてG6PDHを含む反応液に、測定試料(各保存液)を添加した時のNADPHの生成量を 340nmにおける吸光度変化から測定した。その結果を表1に示す。
【0024】
比較例1
〔保存溶液〕
イミダゾール緩衝液 125mM、酢酸マグネシウム 10mM 、ADP2.5mM 、NADP 2.5mM、NAC25mM、Ap5A 0.013mM、AMP6.25mM、グルコース25mM、アジ化ナトリウム15mM、EDTA2mMとなるように溶解した後、酢酸でpH6.6 (30℃)に調整し、HK(バチルス属由来、旭化成社製)4U/ml、G6PDH(ベーリンガーマンハイム社製)1.9U/ml を添加したものを保存溶液とし、25℃で所定期間保存した。上記溶液は一般的にCK活性測定時に用いられるものである。
〔HK活性の測定〕
保存前及び25℃で所定期間保存した後の上記保存液中のHK活性を、実施例1と同様の方法で測定した。その結果を表1に示す。
【0025】
【表1】
【0026】
表中の値は、実施例1〜4及び比較例1において保存前に測定したHK活性を 100%とした場合のそれぞれ所定の保存期間を経た保存溶液中のHK活性相対値を示す。
【0027】
表1の結果から、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩、ベンゾイルヒドラジン、エチルカルバゼート、4フェニルセミカルバジドが顕著にHKを安定化することが明らかである。
【0028】
実施例5〜実施例11
HKの代わりにGlcKを使用した以外は、実施例1と同様に保存溶液を調製し、実施例1と同様の方法で保存溶液中のGlcKの活性を測定した(実施例5)。その結果を表2に示す。
また、実施例5におけるカルボキシメトキシルアミン塩酸塩の代わりに、ベンゾイルヒドラジンを添加したものを実施例6、エチルカルバゼートを添加したものを実施例7、4−フェニルセミカルバジドを添加したものを実施例8、塩酸ヒドロキシルアミンを添加したものを実施例9、硫酸ヒドロキシルアミンを添加したものを実施例10、シュウ酸ヒドロキシルアミンを添加したものを実施例11として同様に保存溶液中のGlcKの活性を測定した。その結果を表2に示す。
【0029】
比較例2
HKの代わりにGlcKを使用した以外は、比較例1と同様に保存溶液を調製し、実施例1と同様の方法で保存溶液中のGlcKの活性を測定した。その結果を表2に示す。
【0030】
【表2】
【0031】
表中の値は、実施例5〜11及び比較例2において保存前に測定したGlcK活性を 100%とした場合のそれぞれ所定の保存期間を経た保存溶液中のGlcK活性相対値を示す。
【0032】
表2の結果から、塩酸ヒドロキシルアミン、硫酸ヒドロキシルアミン、シュウ酸ヒドロキシルアミン、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩、ベンゾイルヒドラジン、エチルカルバゼート、4−フェニルセミカルバジドが顕著にGlcKを安定化することが明らかである。
【0033】
実施例12〜実施例14
〔保存溶液の調製〕
トリス緩衝液100mM 、塩酸マグネシウム 12.5mM 、NADP2mM、NAC 6.3mM、EDTA2mM、アジ化ナトリウム15mM、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩10mMとなるように溶解した後、塩酸でpH7.8 (25℃)に調整し、HK(バチルス属由来、旭化成社製)1U/ml、G6PDH(ベーリンガーマンハイム社製)0.8U/ml を添加したものを保存溶液とし、25℃で所定期間保存した(実施例12)。
これとは別に、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩10mMに代えて、ベンゾイルヒドラジン(実施例13)、エチルカルバゼート(実施例14)をそれぞれ10mMとなるように溶解した溶液を調製し、25℃で所定期間保存した。
〔HK活性の測定〕
保存前及び25℃で所定期間保存した後の上記各保存液中のHK活性を、実施例1と同様の方法で測定した。その結果を表3に示す。
【0034】
比較例3
〔保存溶液の調製〕
トリス緩衝液100mM 、塩酸マグネシウム 12.5mM 、NADP2mM、NAC 6.3mM、EDTA2mM、アジ化ナトリウム15mMとなるように溶解した後、塩酸でpH7.8 (25℃)に調整し、HK(バチルス属由来、旭化成社製)1U/ml、G6PDH(ベーリンガーマンハイム社製)0.8U/ml を添加したものを保存溶液とし、25℃で所定期間保存した。上記溶液は一般的にグルコース濃度測定時に用いられるものである。
〔HK活性の測定〕
保存前及び25℃で所定期間保存した後の上記各保存液中のHK活性を、実施例1と同様の方法で測定した。その結果を表3に示す。
【0035】
【表3】
【0036】
表中の値は、実施例12〜14及び比較例3において保存前に測定したHK活性を 100%とした場合のそれぞれ所定の保存期間を経た保存溶液中のHK活性相対値を示す。
表3の結果から、カルボキシメトキシルアミン塩酸塩、ベンゾイルヒドラジン、エチルカルバゼートが顕著にHKを安定化することが明らかである。
【0037】
【発明の効果】
本発明の方法は、HK又はGlcKの安定性を飛躍的に向上することが可能である。また、本発明の試薬組成物は、共存するHK又はGlcKが安定なので、安定性に優れている。
Claims (2)
- ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼにカルボニル試薬又はその塩を共存させることを特徴とするヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼの安定化法。
- ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼにカルボニル試薬又はその塩が共存する試薬組成物。
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