JPH026520B2 - - Google Patents

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JPH026520B2
JPH026520B2 JP57039654A JP3965482A JPH026520B2 JP H026520 B2 JPH026520 B2 JP H026520B2 JP 57039654 A JP57039654 A JP 57039654A JP 3965482 A JP3965482 A JP 3965482A JP H026520 B2 JPH026520 B2 JP H026520B2
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JP
Japan
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acetate kinase
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kinase
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acetate
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JP57039654A
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Sachiko Kamei
Kosuke Tomita
Yasunobu Hashimoto
Noriko Inagaki
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Unitika Ltd
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Unitika Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、コリンエステラーゼ（以下ChEと略
称する。）の定量用試薬に関するものである。
近年、酵素と疾病との関係についての研究が進
むことにより、疾病を診断するために生体内酵素
の活性を測定することが広く行われるようになつ
ている。ChEはそのような生体内酵素の一つであ
つて、その活性が肝機能と密接な関係を有してい
ることから、肝疾患の診断に広く利用されるよう
になつている。
現在臨床検査室などで用いられているChEの定
量方法には、 (1) アセチルコリンを基質として、PH変化を測定
する方法。
(2) 基質にチオコリンエステルを用い、遊離する
SH基を測定する方法。
(3) ベンゾイルコリンなどを基質とし、遊離する
コリンをコリンオキシダーゼを用い、H2O2と
して測定する方法。
などがある。これらのうち、(1)の方法が古くから
検査室に取り入れられている標準的な方法である
が、至適PHを維持できないとか、PH変化が必ずし
も指示薬の変色程度と平行しないことなどのため
に精度が悪く、(2)、(3)の方法にとつてかわられつ
つあるのが現状である。しかし、(2)では共存SH
化合物による誤差、(3)ではH2O2定量にまつわる
諸問題や発色系のフエノールによる妨害などの問
題があり、現在のところいずれも満足できるまで
には至つていない。また、いずれも国際単位を呼
称しながら正常範囲の数字が大巾に異なるといつ
た不都合な現象が認められ、検査室を混乱に陥つ
ている。したがつて、標準化が叫ばれるようにな
り、(1)の方法の見直しの機運がある。このような
事情から、(1)の方法を基礎とした、より高精度の
方法があれば、最も理想に近い方法であるという
ことができる。
そこで、本発明者らは、かかる観点に鑑み、
ChEの定量が上記(1)の方法を基礎にしながら、短
時間で精度よく行える定量用試薬を提供すること
を目的として鋭意研究した結果、酢酸キナーゼを
一成分として含有せしめて酢酸キナーゼの酵素作
用を利用すると、上記の目的がすべて達成される
ことを見い出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、アセチルコリンを含むコ
リンエステラーゼ定量用試薬において、酢酸キナ
ーゼとアデノシン三リン酸を含有することを特徴
とするコリンエステラーゼ定量用試薬である。
本発明の試薬について説明すると、基質として
アセチルコリンを使用し、生体試料中のChEを作
用させると、基質は酢酸とコリンとに分解する。
ここで、PH変化を測定すれば、(1)の方法になる
が、ここに酢酸キナーゼが存在するとアデノシン
三リン酸（以下ATPという。）を補基質として酢
酸はアセチルリン酸に変化する。この反応式を下
記に示す。
ChE アセチルコリンChE ――――→ 酢酸＋コリン 酢酸＋ATP酢酸キナーゼ ――――――→ アセチルリン酸＋アデノシン二リン酸 この酢酸キナーゼの作用は、酢酸のみに基質特
異性を有するものであつて、他の有機酸、無機酸
などが共存していても作用するものではない。次
いで、ここで生成したアセチルリン酸又はアデノ
シン二リン酸（以下ADPという。）を定量すれば
ChEの定量は完了する。この際、アセチルリン酸
は適当な色源体と反応させれば、可視部の比色法
で定量可能であり、ADPはピルビン酸キナーゼ
と乳酸脱水素酵素との共役酵素系を使用すること
により定量可能である。特に、後者の方法は全反
応系を酵素系として行うものであり、共存物質の
影響を受けにくく極めて有利な方法である。この
場合の反応式を下記に示す。
ADP＋ホスホエノールピルビン酸ピルビン酸キナーゼ ――――――――――→ ATP＋ピルビン酸 ピルビン酸＋NADH乳酸脱水素酵素 ――――――――→ 乳酸＋NAD+ （ただし、NADHは還元型β−ニコチンアミド
−アデニン・ジヌクレオド、NAD+は、酸化型β
−ニコチンアミド−アデニン・ジヌクレオドを表
わす。） このNADHの紫外部（340nｍ）の吸光度を測
定することにより、極めて容易に高精度の定量を
行うことができる。また、ピルビン酸キナーゼの
作用により生成ADPをATPに再生することがで
きるので、酢酸キナーゼの酢酸に対する作用が増
強され極めて高感度の測定が可能となる。
本発明でいう酢酸キナーゼとは、常用名であり
正式にはATP：アセテートホスホトランスフエ
ラーゼ（EC2.7.2.1）である。
本発明を実施するための酢酸キナーゼとしては
微生物由来のもの、動物組織由来のものなど各種
のものを使用することができるが、キナーゼ類は
一般に不安定であるので、バチルス・ステアロサ
ーモフイルス、ストレプトマイセス・サーモアセ
チクム、アクロモバクターＶ−２などのような好
熱菌の産生する耐熱性の酢酸キナーゼを使用する
のが有利である。特にこれらの中では、精製の容
易さ、比活性の高さなどから、バチルス・ステア
ロサーモフイルスからのものが最も好ましい。ま
た全反応系を酵素系として行う場合には、前記し
たようにピルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素
が使用されるが、これらの酵素も微生物由来のも
の、動物組織由来のものなど各種のものを使用す
ることができる。その中でも安定性から、特にピ
ルビン酸キナーゼの場合、バチルス・ステアロサ
ーモフイルスやサーマス属の微生物のような好熱
菌の産生する耐熱性のものを使用するのが有利で
ある。
本発明の試薬は、例えば従来の試薬に酢酸キナ
ーゼとATPとを含有せしめるが、その使用量と
しては、例えばアセチルコリン20〜200ｍＭ、酢
酸キナーゼ５〜50u／ml、ATP1.5〜15ｍＭが適
当である。また全反応系を酵素系とする場合に
は、ピルビン酸キナーゼ３〜30u／ml、乳酸脱水
素酵素１〜20u／ml、ホスホエノールピルビン酸
0.1〜２ｍＭ、NADH0.1〜１ｍＭ程度使用すれば
よい。
本発明の試薬を用いる場合、反応温度としては
通常の臨床化学検査などに用いる温度が好適であ
り、例えば37℃の温度で好都合に使用することが
できる。またPHとしては、例えば6.5〜8.5特に7.0
〜8.0が好ましい。更に反応時間としては、数分
程度でよい。
本発明の試薬を用いることにより、臨床上重要
なコリンエステラーゼの定量を極めて容易に、か
つ短時間で精度良く行うことができる。
次に本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例 １ ATP5ｍＭ、ホスホエノールピルビン酸１ｍ
Ｍ、NADH0.5ｍＭ、塩化マグネシウム20ｍＭ、
ピルビン酸キナーゼ10u／ml、乳酸脱水素酵素
10u／ml、塩化アセチルコリン50ｍＭを含有する
リン酸カリウム緩衝液（50ｍＭ、PH7.2）にバチ
ルス・ステアロサーモフイルスを給源とする酢酸
キナーゼ10u／mlを加えて試薬液とした。
次にこの試薬液に対し、全量0.5mlとなるよう
にして種々の容量のコントロール血清を加え、37
℃で３分間酵素反応を行つてNADHの340nｍに
おける吸光度変化を測定した。その結果、第１図
に示すようにきれいな直線関係で標準曲線が得ら
れた。
【図面の簡単な説明】
第１図は、反応液0.5ml中のコントロール血清
の量と340nｍにおける吸光度変化との関係を示
す図で、横軸にコントロール血清の量、縦軸に吸
光度変化を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ アセチルコリンを含むコリンエステラーゼ定
    量用試薬において、酢酸キナーゼとアデノシン三
    リン酸を含有することを特徴とするコリンエステ
    ラーゼ定量用試薬。 ２ 酢酸キナーゼが、耐熱性の酢酸キナーゼであ
    る特許請求の範囲第１項記載の試薬。
JP57039654A 1982-03-12 1982-03-12 コリンエステラ−ゼ定量用試薬 Granted JPS58155099A (ja)

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JP57039654A JPS58155099A (ja) 1982-03-12 1982-03-12 コリンエステラ−ゼ定量用試薬
DE8383301381T DE3381569D1 (de) 1982-03-12 1983-03-14 Reagenz zum nachweis von cholinesterase.
US06/474,940 US4596772A (en) 1982-03-12 1983-03-14 Reagent for assaying cholinesterase
EP83301381A EP0089210B1 (en) 1982-03-12 1983-03-14 Reagent for assaying cholinsterase

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JPS58155099A (ja) 1983-09-14
US4596772A (en) 1986-06-24
EP0089210B1 (en) 1990-05-16

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