JP3170320B2 - 物質の測定法 - Google Patents
物質の測定法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は試料中のグルコースを完
全に消去した後、試料中の特定の成分、例えば１，５−
アンヒドログルシトール等を酵素反応を利用して定量す
る方法に関する。
全に消去した後、試料中の特定の成分、例えば１，５−
アンヒドログルシトール等を酵素反応を利用して定量す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体試料中にはグルコースが存在し、成
分を分析する際に試料中のグルコースが成分の測定結果
に影響を与える場合がある。かかる場合目的成分の定量
に先だってグルコースを分解あるいは当該定量に影響し
ない物質に変換した後定量が行われる。
分を分析する際に試料中のグルコースが成分の測定結果
に影響を与える場合がある。かかる場合目的成分の定量
に先だってグルコースを分解あるいは当該定量に影響し
ない物質に変換した後定量が行われる。
【０００３】試料中のグルコースの消去方法としては、
(i) イオン交換カラムクロマトグラフィーでグルコース
を分離する方法（特開昭６３−１８５３０７号公報、特
開昭６４−６７５６号公報）、(ii)ヘキソキナーゼ タ
イプＩＶ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを
用いてグルコースを酸化酵素に反応しない物質に変える
方法（特開平１−３２０９９８号公報）および(iii) ヘ
キソキナーゼ タイプＩＶ、ピルベートキナーゼを用い
てグルコースを酸化酵素に反応しない物質に変える方法
（特開平２−１０４２９８号公報）が知られている。し
かし(i) のカラムを用いる方法は操作が煩雑であり、ま
た、(ii)および(iii) に示された方法は精度上、必ずし
も満足されるものではない。
(i) イオン交換カラムクロマトグラフィーでグルコース
を分離する方法（特開昭６３−１８５３０７号公報、特
開昭６４−６７５６号公報）、(ii)ヘキソキナーゼ タ
イプＩＶ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを
用いてグルコースを酸化酵素に反応しない物質に変える
方法（特開平１−３２０９９８号公報）および(iii) ヘ
キソキナーゼ タイプＩＶ、ピルベートキナーゼを用い
てグルコースを酸化酵素に反応しない物質に変える方法
（特開平２−１０４２９８号公報）が知られている。し
かし(i) のカラムを用いる方法は操作が煩雑であり、ま
た、(ii)および(iii) に示された方法は精度上、必ずし
も満足されるものではない。
【０００４】１，５−アンヒドログルシトールは糖尿病
の診断マーカーとして知られている。１，５−アンヒド
ログルシトールの定量法としては該物質に酸化酵素を作
用させた後、酸素の消費量、過酸化水素の生成量または
電子受容体の還元体の生成量を測定する方法が知られて
いる（特公平３−２４２００号公報）。しかし、１，５
−アンヒドログルシトールを基質とする酸化酵素はいず
れも基質特異性が弱く、試料中に共存するグルコースと
も反応するため、多量のグルコースが共存する試料での
該方法の使用には問題がある。
の診断マーカーとして知られている。１，５−アンヒド
ログルシトールの定量法としては該物質に酸化酵素を作
用させた後、酸素の消費量、過酸化水素の生成量または
電子受容体の還元体の生成量を測定する方法が知られて
いる（特公平３−２４２００号公報）。しかし、１，５
−アンヒドログルシトールを基質とする酸化酵素はいず
れも基質特異性が弱く、試料中に共存するグルコースと
も反応するため、多量のグルコースが共存する試料での
該方法の使用には問題がある。
【０００５】
【 発明が解決しようとする課題】試料中のグルコース
を目的の成分の分析に影響を与えない物質に効率よく変
換することによって目的の成分を正確に定量する方法の
開発が求められている。
を目的の成分の分析に影響を与えない物質に効率よく変
換することによって目的の成分を正確に定量する方法の
開発が求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は試料中のグルコ
ースにアデノシン三リン酸の存在下、ヘキソキナーゼ、
ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラク
トキナーゼを作用させてグルコースをフラクトース−
１，６−二リン酸に変換し、ついで目的の成分を酵素反
応を利用して定量する方法に関する。
ースにアデノシン三リン酸の存在下、ヘキソキナーゼ、
ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラク
トキナーゼを作用させてグルコースをフラクトース−
１，６−二リン酸に変換し、ついで目的の成分を酵素反
応を利用して定量する方法に関する。
【０００７】この方法を１，５−アンヒドログルシトー
ルの定量に適用することによって１，５−アンヒドログ
ルシトールを正確に定量することができる。グルコース
消去はグルコースを下記反応に従ってフラクトース−
１，６−二リン酸に変えることにより行われる。
ルの定量に適用することによって１，５−アンヒドログ
ルシトールを正確に定量することができる。グルコース
消去はグルコースを下記反応に従ってフラクトース−
１，６−二リン酸に変えることにより行われる。
【０００８】
【化１】
【０００９】この反応においてグルコースをグルコース
−６−リン酸に変換しただけではグルコース−６−リン
酸がグルコースに変換される（反応が可逆反応である）
のでさらにグルコース−６−リン酸をフラクトース−６
−リン酸を経由してフラクトース−１，６−二リン酸に
変換することによりグルコースへの変換反応が進行しな
いということが見出された。本発明はこの発見に基づい
て完成された。
−６−リン酸に変換しただけではグルコース−６−リン
酸がグルコースに変換される（反応が可逆反応である）
のでさらにグルコース−６−リン酸をフラクトース−６
−リン酸を経由してフラクトース−１，６−二リン酸に
変換することによりグルコースへの変換反応が進行しな
いということが見出された。本発明はこの発見に基づい
て完成された。
【００１０】本発明は目的の成分の分析において、試料
中に存在するグルコースが目的の分析を阻害する場合に
適用することによって大きな効果を期待することができ
る。本発明は目的の成分を分析する際に用いられる酵素
がグルコースにも作用する場合のみならず、目的の成分
をグルコースを経由して定量する際にも適用できる。た
とえばグルコースと類似構造を有する１，５−アンヒド
ログルシトールの定量、あるいはグルコースを経由して
定量するアミラーゼの定量等に適用すると効果が著し
い。
中に存在するグルコースが目的の分析を阻害する場合に
適用することによって大きな効果を期待することができ
る。本発明は目的の成分を分析する際に用いられる酵素
がグルコースにも作用する場合のみならず、目的の成分
をグルコースを経由して定量する際にも適用できる。た
とえばグルコースと類似構造を有する１，５−アンヒド
ログルシトールの定量、あるいはグルコースを経由して
定量するアミラーゼの定量等に適用すると効果が著し
い。
【００１１】本発明を実施するに際しては、グルコース
が共存する試料にアデノシン三リン酸、ヘキソキナー
ゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフ
ラクトキナーゼを加え、要すればマグネシウム塩の存在
下に、１５−５０℃で１分−３０分、好ましくは３分−
１０分反応させる。
が共存する試料にアデノシン三リン酸、ヘキソキナー
ゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフ
ラクトキナーゼを加え、要すればマグネシウム塩の存在
下に、１５−５０℃で１分−３０分、好ましくは３分−
１０分反応させる。
【００１２】本反応における酵素およびその使用量は、
ヘキソキナーゼとして、ヘキソキナーゼ（ＥＣ．２．
７．１．１）またはヘキソキナーゼ タイプＩＶ〔グル
コキナーゼ（ＥＣ．２．７．１．２）〕を０．５−５０
Ｕ／ｍｌ、ホスホヘキソースイソメラーゼとしてはＤ−
グルコース−６−ホスフェイトケトールイソメーラゼ
（ＥＣ．５．３．１．９）を１−１００Ｕ／ｍｌ、６−
ホスホフラクトキナーゼとして、ホスホヘキソキナーゼ
（ＥＣ．２．７．１．１１）を１−１００Ｕ／ｍｌが用
いられ、各酵素とも市販品が容易に入手可能である。
ヘキソキナーゼとして、ヘキソキナーゼ（ＥＣ．２．
７．１．１）またはヘキソキナーゼ タイプＩＶ〔グル
コキナーゼ（ＥＣ．２．７．１．２）〕を０．５−５０
Ｕ／ｍｌ、ホスホヘキソースイソメラーゼとしてはＤ−
グルコース−６−ホスフェイトケトールイソメーラゼ
（ＥＣ．５．３．１．９）を１−１００Ｕ／ｍｌ、６−
ホスホフラクトキナーゼとして、ホスホヘキソキナーゼ
（ＥＣ．２．７．１．１１）を１−１００Ｕ／ｍｌが用
いられ、各酵素とも市販品が容易に入手可能である。
【００１３】アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は０．１−
１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられる。ＡＴＰの代わりに
ピルベートキナーゼ（０．５−５０Ｕ／ｍｌ）とホスホ
エノールピルベート（０．１−１０ｍｇ／ｍｌ）〔特開
平２−１０４２９８号公報〕またはクレアチンキナーゼ
（１−１００Ｕ／ｍｌ）とクレアチンホスフェート
（０．１−１０ｍｇ／ｍｌ）等アデノシン三リン酸の生
成系を用いて反応液中にＡＴＰを生成させることができ
る。マグネシウム塩としては例えば、硫酸マグネシウ
ム、塩化マグネシウム等があげられる。反応により生成
したフラクトース−１，６−二リン酸は安定で逆反応に
よりグルコースに変換されない。
１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられる。ＡＴＰの代わりに
ピルベートキナーゼ（０．５−５０Ｕ／ｍｌ）とホスホ
エノールピルベート（０．１−１０ｍｇ／ｍｌ）〔特開
平２−１０４２９８号公報〕またはクレアチンキナーゼ
（１−１００Ｕ／ｍｌ）とクレアチンホスフェート
（０．１−１０ｍｇ／ｍｌ）等アデノシン三リン酸の生
成系を用いて反応液中にＡＴＰを生成させることができ
る。マグネシウム塩としては例えば、硫酸マグネシウ
ム、塩化マグネシウム等があげられる。反応により生成
したフラクトース−１，６−二リン酸は安定で逆反応に
よりグルコースに変換されない。
【００１４】該反応によりグルコースを消去した後、試
料中の定量すべき成分の定量に必要な試薬を加えて、生
成した成分を定量するか、反応前試料中に存在した成分
の変化を定量することによって目的の成分を定量でき
る。
料中の定量すべき成分の定量に必要な試薬を加えて、生
成した成分を定量するか、反応前試料中に存在した成分
の変化を定量することによって目的の成分を定量でき
る。
【００１５】つぎに試料中の１，５−アンヒドログルシ
トールの定量について説明する。１，５−アンヒドログ
ルシトールの定量はそれ自体公知の方法が何れも適用で
きる。例えば１，５−アンヒドログルシトールに酸化酵
素を作用させて生成する過酸化水素と色源体とをペルオ
キシダーゼの存在下に反応させ、生成する色素により呈
色する反応液の可視部の吸収を測定することにより、
１，５−アンヒドログルシトールを定量することができ
る。
トールの定量について説明する。１，５−アンヒドログ
ルシトールの定量はそれ自体公知の方法が何れも適用で
きる。例えば１，５−アンヒドログルシトールに酸化酵
素を作用させて生成する過酸化水素と色源体とをペルオ
キシダーゼの存在下に反応させ、生成する色素により呈
色する反応液の可視部の吸収を測定することにより、
１，５−アンヒドログルシトールを定量することができ
る。
【００１６】本反応において用いられる酸化酵素（その
使用量）としては、例えばソルボースオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ．１．１．３．１１）（１０−１０００Ｕ／ｍｌ）、
ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ．１．１．３．１０）
（１−１００Ｕ／ｍｌ）が用いられる。ペルオキシダー
ゼ（ＥＣ．１．１１．１．７）は１−１００Ｕ／ｍｌの
濃度で用いられる。
使用量）としては、例えばソルボースオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ．１．１．３．１１）（１０−１０００Ｕ／ｍｌ）、
ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ．１．１．３．１０）
（１−１００Ｕ／ｍｌ）が用いられる。ペルオキシダー
ゼ（ＥＣ．１．１１．１．７）は１−１００Ｕ／ｍｌの
濃度で用いられる。
【００１７】色源体はペルオキシダーゼの存在下に酸化
されて発色する化合物であれば何れも用いることができ
る。例えば、４−アミノアンチピリンまたは３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとフェノールもし
くはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体のカ
ップリング系が使用できる。好ましくは生成する色素の
感度の高いものが良く、例えば２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ビ
ス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメ
チルアミノフェニル〕アミン（以下ＢＣＭＡと略す）
〔特開昭５９−１８２３６１号公報〕、ビス〔３−ビス
（４−クロロフェニル）メチル−４−カルボキシエチル
アミノフェニル〕アミン〔特開昭５９−１８２３６１号
公報〕、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメ
チルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＭＣＤＰと
略す）〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕、１０−Ｎ
−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジメチルア
ミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＣＣＡＰと略す）
〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕が使用できる。使
用する色源体の量は過酸化水素と等モル量−１０００倍
モル量を用いる。
されて発色する化合物であれば何れも用いることができ
る。例えば、４−アミノアンチピリンまたは３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとフェノールもし
くはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体のカ
ップリング系が使用できる。好ましくは生成する色素の
感度の高いものが良く、例えば２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ビ
ス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメ
チルアミノフェニル〕アミン（以下ＢＣＭＡと略す）
〔特開昭５９−１８２３６１号公報〕、ビス〔３−ビス
（４−クロロフェニル）メチル−４−カルボキシエチル
アミノフェニル〕アミン〔特開昭５９−１８２３６１号
公報〕、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメ
チルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＭＣＤＰと
略す）〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕、１０−Ｎ
−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジメチルア
ミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＣＣＡＰと略す）
〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕が使用できる。使
用する色源体の量は過酸化水素と等モル量−１０００倍
モル量を用いる。
【００１８】反応温度は１５−５０℃で、反応時間は３
−３０分、好ましくは５−１０分である。以下に具体的
な実施例を挙げる。
−３０分、好ましくは５−１０分である。以下に具体的
な実施例を挙げる。
【００１９】
実施例１．１，５−アンヒドログルシトールの測定に必
要な以下のような組成の試薬１および２を調製した。 試薬１ リン酸緩衝液（PH7.5 ） 25 mM 塩化ナトリウム 50 mM ヘキソキナーゼ タイプＩＶ 3.2 U/ml アデノシン三リン酸 5 mg/ml ホスホヘキソースイソメラーゼ 20 U/ml ６−ホスホフラクトキナーゼ 20 U/ml 塩化マグネシウム 4.9 mM ペルオキシダーゼ 10 U/ml 試薬２ リン酸緩衝液（PH6.0 ） 200 mM フェノール 0.1 mg/ml ピラノースオキシダーゼ 100 U/ml ＢＣＭＡ 0.1 mg/ml
要な以下のような組成の試薬１および２を調製した。 試薬１ リン酸緩衝液（PH7.5 ） 25 mM 塩化ナトリウム 50 mM ヘキソキナーゼ タイプＩＶ 3.2 U/ml アデノシン三リン酸 5 mg/ml ホスホヘキソースイソメラーゼ 20 U/ml ６−ホスホフラクトキナーゼ 20 U/ml 塩化マグネシウム 4.9 mM ペルオキシダーゼ 10 U/ml 試薬２ リン酸緩衝液（PH6.0 ） 200 mM フェノール 0.1 mg/ml ピラノースオキシダーゼ 100 U/ml ＢＣＭＡ 0.1 mg/ml
【００２０】１，５−アンヒドログルシトール５ｍｇ／
ｄｌの標準液を５段階（各５、２、１、０．５、０．２
５ｍｇ／ｄｌ）に希釈して作成した試料または精製水
０．０５ｍｌに試薬１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で１
０分間加温し、その後、試薬２を０．７５ｍｌ添加して
さらに５分間反応させ、７５５ｎｍでの吸光度を測定し
た。得られた吸光度は１，５−アンヒドログルシトール
の添加時の濃度に比例していて、その検量線が図１に示
される。
ｄｌの標準液を５段階（各５、２、１、０．５、０．２
５ｍｇ／ｄｌ）に希釈して作成した試料または精製水
０．０５ｍｌに試薬１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で１
０分間加温し、その後、試薬２を０．７５ｍｌ添加して
さらに５分間反応させ、７５５ｎｍでの吸光度を測定し
た。得られた吸光度は１，５−アンヒドログルシトール
の添加時の濃度に比例していて、その検量線が図１に示
される。
【００２１】実施例２．１，５−アンヒドログルシトー
ル２．６９ｍｇ／ｄｌ（カラム法により定量）を含むヒ
ト血清を試料として、実施例１の方法に従い試料中の
１，５−アンヒドログルシトール量を測定したところ
２．７１ｍｇ／ｄｌであった。
ル２．６９ｍｇ／ｄｌ（カラム法により定量）を含むヒ
ト血清を試料として、実施例１の方法に従い試料中の
１，５−アンヒドログルシトール量を測定したところ
２．７１ｍｇ／ｄｌであった。
【００２２】実施例３．実施例２に用いた１，５−アン
ヒドログルシトール２．６９ｍｇ／ｄｌを含むヒト血清
を試料として、ＢＣＭＡの代わりにＭＣＤＰを用いる以
外は、実施例２と同様の方法に従い試料中の１，５−ア
ンヒドログルシトール量を測定したところ２．６８ｍｇ
／ｄｌであった。
ヒドログルシトール２．６９ｍｇ／ｄｌを含むヒト血清
を試料として、ＢＣＭＡの代わりにＭＣＤＰを用いる以
外は、実施例２と同様の方法に従い試料中の１，５−ア
ンヒドログルシトール量を測定したところ２．６８ｍｇ
／ｄｌであった。
【００２３】実施例４．ＢＣＭＡの代わりにＣＣＡＰを
用いる以外は、実施例２の方法を繰り返した結果試料中
の１，５−アンヒドログルシトール量は２．７１ｍｇ／
ｄｌであった。
用いる以外は、実施例２の方法を繰り返した結果試料中
の１，５−アンヒドログルシトール量は２．７１ｍｇ／
ｄｌであった。
【００２４】実施例５．ヘキソキナーゼ タイプＩＶの
変わりにヘキソキナーゼを用いる以外は実施例２の方法
を繰り返した結果、試料中の１，５−アンヒドログルシ
トール量は２．７０ｍｇ／ｄｌであった。
変わりにヘキソキナーゼを用いる以外は実施例２の方法
を繰り返した結果、試料中の１，５−アンヒドログルシ
トール量は２．７０ｍｇ／ｄｌであった。
【００２５】実施例６．アデノシン三リン酸を０．２ｍ
ｇ／ｍｌに減らし、クレアチンキナーゼ１０Ｕ／ｍｌお
よびクレアチンホスフェート５ｍｇ／ｍｌを加える以外
は実施例２の方法を繰り返した結果、試料中の１，５−
アンヒドログルシトール量は２．６９ｍｇ／ｄｌであっ
た。
ｇ／ｍｌに減らし、クレアチンキナーゼ１０Ｕ／ｍｌお
よびクレアチンホスフェート５ｍｇ／ｍｌを加える以外
は実施例２の方法を繰り返した結果、試料中の１，５−
アンヒドログルシトール量は２．６９ｍｇ／ｄｌであっ
た。
【００２６】実施例７．クレアチンキナーゼおよびクレ
アチンホスフェートの代わりにピルべートキナーゼ５Ｕ
／ｍｌおよびホスホエノールホスフェイト１ｍｇ／ｍｌ
を用いる以外は実施例２の方法を繰り返した結果、試料
中の１，５−アンヒドログルシトール量は２．７０ｍｇ
／ｄｌであった。
アチンホスフェートの代わりにピルべートキナーゼ５Ｕ
／ｍｌおよびホスホエノールホスフェイト１ｍｇ／ｍｌ
を用いる以外は実施例２の方法を繰り返した結果、試料
中の１，５−アンヒドログルシトール量は２．７０ｍｇ
／ｄｌであった。
【００２７】実施例８．１，５−アンヒドログルシトー
ル５ｍｇ／ｄｌおよびグルコース２００ｍｇ／ｄｌの共
存する試料において、実施例１の方法により試料中の
１，５−アンヒドログルシトール量を測定したとろ５ｍ
ｇ／ｄｌであった。
ル５ｍｇ／ｄｌおよびグルコース２００ｍｇ／ｄｌの共
存する試料において、実施例１の方法により試料中の
１，５−アンヒドログルシトール量を測定したとろ５ｍ
ｇ／ｄｌであった。
【００２８】実施例９．１，５−アンヒドログルシトー
ル５ｍｇ／ｄｌおよびグルコース２００ｍｇ／ｄｌの共
存する試料において、実施例６の方法により試料中の
１，５−アンヒドログルシトール量を測定したとろ５ｍ
ｇ／ｄｌであった。
ル５ｍｇ／ｄｌおよびグルコース２００ｍｇ／ｄｌの共
存する試料において、実施例６の方法により試料中の
１，５−アンヒドログルシトール量を測定したとろ５ｍ
ｇ／ｄｌであった。
【００２９】比較例１．実施例８において、ホスホヘキ
ソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナーゼ
を加えずに実施例８を繰り返した結果、試料中の１，５
−アンヒドログルシトール量は９．４ｍｇ／ｄｌであっ
た。
ソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナーゼ
を加えずに実施例８を繰り返した結果、試料中の１，５
−アンヒドログルシトール量は９．４ｍｇ／ｄｌであっ
た。
【００３０】比較例２．実施例８において、６−ホスホ
フラクトキナーゼを加えずに実施例８を繰り返した結
果、試料中の１，５−アンヒドログルシトール量は９．
３ｍｇ／ｄｌであった。
フラクトキナーゼを加えずに実施例８を繰り返した結
果、試料中の１，５−アンヒドログルシトール量は９．
３ｍｇ／ｄｌであった。
【００３１】比較例３．特開平１−３２０９９８号公報
の方法に準じて、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび
６−ホスホフラクトキナーゼの代わりにグルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼ５Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤＰからの
水素受容体としてのフェナジンメゾサルフェート０．２
ｍｇ／ｍｌおよびＮＡＤＰ０．２ｍｇ／ｍｌを用いる以
外は、実施例８と同様の方法を繰り返した結果、１，５
−アンヒドログルシトール量は６．２０ｍｇ／ｄｌであ
った。
の方法に準じて、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび
６−ホスホフラクトキナーゼの代わりにグルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼ５Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤＰからの
水素受容体としてのフェナジンメゾサルフェート０．２
ｍｇ／ｍｌおよびＮＡＤＰ０．２ｍｇ／ｍｌを用いる以
外は、実施例８と同様の方法を繰り返した結果、１，５
−アンヒドログルシトール量は６．２０ｍｇ／ｄｌであ
った。
【００３２】比較例４．特開平２−１０４２９８号公報
の方法に準じてホスホヘキソースイソメラーゼおよび６
−ホスホフラクトキナーゼの代わりにピルベートキナー
ゼ３Ｕ／ｍｌおよびホスホエノールピルビン酸０．１ｍ
ｇ／ｍｌを用いる以外は、実施例８と同様の方法を繰り
返した結果、１，５−アンヒドログルシトール量は５．
９０ｍｇ／ｄｌであった。
の方法に準じてホスホヘキソースイソメラーゼおよび６
−ホスホフラクトキナーゼの代わりにピルベートキナー
ゼ３Ｕ／ｍｌおよびホスホエノールピルビン酸０．１ｍ
ｇ／ｍｌを用いる以外は、実施例８と同様の方法を繰り
返した結果、１，５−アンヒドログルシトール量は５．
９０ｍｇ／ｄｌであった。
【００３３】以上、実施例８および９、比較例１〜４で
得られた１，５−アンヒドログルシトール量の測定値お
よび添加した１，５−アンヒドログルシトール量と測定
値との誤差を第１表に示す。
得られた１，５−アンヒドログルシトール量の測定値お
よび添加した１，５−アンヒドログルシトール量と測定
値との誤差を第１表に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】第１表によれば、実施例８および９は、添
加した１，５−アンヒドログルシトール量５ｍｇ／ｄｌ
を誤差無く定量した。
加した１，５−アンヒドログルシトール量５ｍｇ／ｄｌ
を誤差無く定量した。
【００３６】
【発明の効果】本発明によれば、煩雑なカラム操作の不
用で簡便でありかつ正確な１，５−アンヒドログルシト
ールの測定法が提供される。
用で簡便でありかつ正確な１，５−アンヒドログルシト
ールの測定法が提供される。
【図１】 １，５−アンヒドログルシトールの検量線。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 3/00
Claims (9)
- 【請求項１】 試料中のグルコースにアデノシン三リン
酸の存在下、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメ
ラーゼおよび６−ホスホフラクトキナーゼを作用させて
グルコースをフラクトース−１，６−二リン酸に変換し
た後、試料中の１，５−アンヒドログルシトールを酵素
反応を利用して定量する方法。 - 【請求項２】 ヘキソキナーゼが、０．５−５０Ｕ／ｍ
ｌ のヘキソキナーゼ（ＥＣ．２．７．１．１）または
ヘキソキナーゼ タイプＩＶ（ＥＣ．２．７．１．２）
であり、ホスホヘキソースイソメラーゼが１−１００Ｕ
／ｍｌのＤ−グルコース−６−ホスフェイトケトールイ
ソメラーゼ（ＥＣ．５．３．１．９）であり、６−ホス
ホフラクトキナーゼが１−１００Ｕ／ｍｌのホスホヘキ
ソキナーゼ（ＥＣ．２．７．１．１１）である請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 ピルベートキナーゼとホスホエノールピ
ルベートとを用いたアデノシン三リン酸の生成系または
クレアチンキナーゼとクレアチンホスフェートとを用い
たアデノシン三リン酸の生成系の存在下、試料中のグル
コースに、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラ
ーゼおよび６−ホスホフラクトキナーゼを作用させてグ
ルコースをフラクトース−１，６−二リン酸に変換した
後、試料中の１，５−アンヒドログルシトールを酵素反
応を利用して定量する方法 - 【請求項４】 １，５−アンヒドログルシトールの定量
が１，５−アンヒドログルシトールに酸化酵素を作用さ
せて生成する物資の変化を定量することによって行われ
る請求項１−３記載の方法。 - 【請求項５】 試料中の１，５−アンヒドログルシトー
ルを酵素反応を利用して定量する試薬において、アデノ
シン三リン酸、ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソ
メラーゼおよび６−ホスホフラクトキナーゼを含むこと
を特徴とする試薬。 - 【請求項６】 ヘキソキナーゼが、０．５−５０Ｕ／ｍ
ｌ のヘキソキナーゼ（ＥＣ．２．７．１．１）または
ヘキソキナーゼ タイプＩＶ（ＥＣ．２．７．１．２）
であり、ホスホヘキソースイソメラーゼが１−１００Ｕ
／ｍｌのＤ−グルコース−６−ホスフェイトケトールイ
ソメーラゼ（ＥＣ．５．３．１．９）であり、６−ホス
ホフラクトキナーゼが１−１００Ｕ／ｍｌのホスホヘキ
ソキナ ーゼ（ＥＣ．２．７．１．１１）である請求項５
記載の試薬。 - 【請求項７】 試料中の１，５−アンヒドログルシトー
ルを酵素反応を利用して定量する試薬において、ピルベ
ートキナーゼ、ホスホエノールピルベート、ヘキソキナ
ーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホ
フラクトキナーゼを含むことを特徴とする試薬。 - 【請求項８】 試料中の１，５−アンヒドログルシトー
ルを酵素反応を利用して定量する試薬において、クレア
チンキナーゼ、クレアチンホスフェート、ヘキソキナー
ゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフ
ラクトキナーゼを含むことを特徴とする試薬。 - 【請求項９】 酵素反応が酸化酵素である請求項５−８
記載の試薬。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP23963791A JP3170320B2 (ja) | 1991-09-19 | 1991-09-19 | 物質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23963791A JP3170320B2 (ja) | 1991-09-19 | 1991-09-19 | 物質の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576397A JPH0576397A (ja) | 1993-03-30 |
| JP3170320B2 true JP3170320B2 (ja) | 2001-05-28 |
Family
ID=17047679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23963791A Expired - Fee Related JP3170320B2 (ja) | 1991-09-19 | 1991-09-19 | 物質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3170320B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006134870A1 (ja) | 2005-06-13 | 2006-12-21 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | 全血を用いる血液成分測定方法及び測定キット |
| WO2008072702A1 (ja) | 2006-12-14 | 2008-06-19 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | 全血中の１，５－アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
| WO2010010881A1 (ja) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | 日本化薬株式会社 | 溶血させた全血を用いる血中成分の測定方法及びそのキット |
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-
1991
- 1991-09-19 JP JP23963791A patent/JP3170320B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| WO2008072702A1 (ja) | 2006-12-14 | 2008-06-19 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | 全血中の１，５－アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
| JPWO2008072702A1 (ja) * | 2006-12-14 | 2010-04-02 | 日本化薬株式会社 | 全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0576397A (ja) | 1993-03-30 |
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