JPH0698035B2 - 体液中のカルシウム測定方法 - Google Patents
体液中のカルシウム測定方法Info
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- JPH0698035B2 JPH0698035B2 JP29698088A JP29698088A JPH0698035B2 JP H0698035 B2 JPH0698035 B2 JP H0698035B2 JP 29698088 A JP29698088 A JP 29698088A JP 29698088 A JP29698088 A JP 29698088A JP H0698035 B2 JPH0698035 B2 JP H0698035B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は体液中のカルシウム測定方法に関する。さらに
詳しくは、ピルビン酸キナーゼがカルシウムによって阻
害されることを利用した体液中のカルシウム量の測定方
法に関する。
詳しくは、ピルビン酸キナーゼがカルシウムによって阻
害されることを利用した体液中のカルシウム量の測定方
法に関する。
発明の背景 現在、病院の検査室において、種々の体液（血清、尿
等）中のカルシウム量が測定され、疾患の診断に用いら
れている。
等）中のカルシウム量が測定され、疾患の診断に用いら
れている。
カルシウムは生体内での細胞機能や、血液の凝固機能に
重要な役割を果しているが、ヒト血漿中の量は非常に厳
密に調節されていると言われており、異常低値および高
値を知ることでの診断価値が高い。
重要な役割を果しているが、ヒト血漿中の量は非常に厳
密に調節されていると言われており、異常低値および高
値を知ることでの診断価値が高い。
例えば、低カルシウム血症としては、低タンパク血症、
低リン血症、腎炎、ネフローゼ、クル病等の疾患、高カ
ルシウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫等
の疾患の可能性があり、これらの診断に用いることがで
きる。
低リン血症、腎炎、ネフローゼ、クル病等の疾患、高カ
ルシウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫等
の疾患の可能性があり、これらの診断に用いることがで
きる。
しかしながら、従来の方法では正確かつ簡便にカルシウ
ム量を測定することができなかった。
ム量を測定することができなかった。
従来の技術およびその問題点 体液中のカルシウム測定法としては、以下の方法が知ら
れている。
れている。
（１）滴定法 （２）比色法 （３）原子吸光法 （４）炎光分析法 （５）電極法 （６）酵素法 （１）の滴定法は、シュウ酸塩やキレートを用いて、化
学的に滴定する方法であるが煩雑であることと、実施者
により測定値に差異が出るという欠点を有する。
学的に滴定する方法であるが煩雑であることと、実施者
により測定値に差異が出るという欠点を有する。
（２）の比色法のうち、発色剤にｏ−CPC（オルトーク
レゾールフタレインコンプレクソン）を用いる方法は、
８−ヒドロキシキノリンを添加し、Mg2+イオンの影響を
排除するもので、現在、病院検査室で最も汎用されてい
る。
レゾールフタレインコンプレクソン）を用いる方法は、
８−ヒドロキシキノリンを添加し、Mg2+イオンの影響を
排除するもので、現在、病院検査室で最も汎用されてい
る。
しかしながら、 1.8−ヒドロキシキノリンを加えてもなお数％程度のMg
2+イオンの影響があること、 2.温度、時間により吸光度が変化すること、 3.発色に至適pH範囲があること、 4.低濃度（Ca2+）で、測定値がマイナスになる領域があ
ること、 等の欠点を有しており、特に用手法で実施する場合に問
題が多い。
2+イオンの影響があること、 2.温度、時間により吸光度が変化すること、 3.発色に至適pH範囲があること、 4.低濃度（Ca2+）で、測定値がマイナスになる領域があ
ること、 等の欠点を有しており、特に用手法で実施する場合に問
題が多い。
（３）の原子吸光法は、機器が高価であり、熟練を要す
るとともに、検体を希釈する必要がある。
るとともに、検体を希釈する必要がある。
（４）の炎色分析法も、検体の希釈が必要であるととも
に、特異性、再現性にも問題がある。
に、特異性、再現性にも問題がある。
（５）の電極法は、機器が高価であるとともに、pHの影
響を受け、また機器の保守が煩雑である。
響を受け、また機器の保守が煩雑である。
（６）の酵素法には、ｉ）カルモジュリンを利用する方
法［特開昭62−36199号参照］、ii）ホスホリパーゼ
Ｄ、コリンオキシターゼを利用する方法がある［特開昭
62−195297号参照］。
法［特開昭62−36199号参照］、ii）ホスホリパーゼ
Ｄ、コリンオキシターゼを利用する方法がある［特開昭
62−195297号参照］。
ｉ）カルモジュリンを用いる方法は、特異性にはすぐれ
ているが、感度が良過ぎるため、検体の希釈（100〜100
0倍）が必要となる。
ているが、感度が良過ぎるため、検体の希釈（100〜100
0倍）が必要となる。
ii）ホスホリパーゼＤ、コリンオキシターゼを用いる方
法は、特異性にすぐれ、また検体の希釈も不要である
が、反応に時間がかかるため、連続して測定できないと
いう欠点を有している。
法は、特異性にすぐれ、また検体の希釈も不要である
が、反応に時間がかかるため、連続して測定できないと
いう欠点を有している。
以上のように、いずれの測定法も欠点を有しており、満
足のゆく測定法というものはなかった。
足のゆく測定法というものはなかった。
問題を解決するための手段 本発明者らは、酵素を用いるカルシウムの定量法を見出
すべく鋭意検討を重ねた結果、ピルビン酸キナーゼの活
性が、カルシウムの量に比例して阻害されることを見出
し、本発明を完成した。
すべく鋭意検討を重ねた結果、ピルビン酸キナーゼの活
性が、カルシウムの量に比例して阻害されることを見出
し、本発明を完成した。
カルシウムがピルビン酸キナーゼの活性を阻害すること
は、すでに知られている［J.F.Kachman,P.D.Boyer,J.Bi
ol.chem.,200 669（1953）］。
は、すでに知られている［J.F.Kachman,P.D.Boyer,J.Bi
ol.chem.,200 669（1953）］。
しかしながら、その阻害が、 （１）０〜20mg/dlの範囲で （２）定量的に起こることは 知られておらず、これを利用し、体液中のカルシウムが
測定できることは、今回本発明者らにより初めて見出さ
れたことである。
測定できることは、今回本発明者らにより初めて見出さ
れたことである。
通常のヒト体液中のカルシウム量は血漿中で10mg/dl、
尿中で４〜12mg/dlであり、希釈を要する測定法では希
釈の操作が煩雑であるのみならず、測定値に誤差が出る
原因ともなり、診断自体が左右されることになりうるの
であるが、本発明の測定法によれば、検体を希釈するこ
となく測定を行なうことができる。
尿中で４〜12mg/dlであり、希釈を要する測定法では希
釈の操作が煩雑であるのみならず、測定値に誤差が出る
原因ともなり、診断自体が左右されることになりうるの
であるが、本発明の測定法によれば、検体を希釈するこ
となく測定を行なうことができる。
また、本発明測定法の反応系では、マグネシウムの存在
が必須であるため（過剰量加えるため、マスクされ
る。）、キレート剤等を用いた場合に問題となる体液中
のマグネシウムの影響を無視することができる。
が必須であるため（過剰量加えるため、マスクされ
る。）、キレート剤等を用いた場合に問題となる体液中
のマグネシウムの影響を無視することができる。
発明の構成 本発明は、（１）ホスホエノール ピルビート、（２）
ADP（アデノシン ジホスフェート）、（３）ピルビン
酸キナーゼおよび（４）マグネシウムイオンを必須成分
とする試薬を用いる体液中のカルシウム測定法である。
ADP（アデノシン ジホスフェート）、（３）ピルビン
酸キナーゼおよび（４）マグネシウムイオンを必須成分
とする試薬を用いる体液中のカルシウム測定法である。
この測定法の原理を第１図に従って説明する。
第１図中の各略号は下記の意味を表わす。
ADF−アデノシン ジホスフェート ATP−アデノシン トリホスフェート PEP−ホスホエノール ピルベート PA −ピルビン酸 PK −ピルビン酸キナーゼ ピルビン酸キナーゼ（PK）は、ホスホエノール ピルベ
ート（PEP）を脱リン酸し、ピルビン酸（PA）に変換す
る酵素であり、この時、アデノシン ジホスフエート
（ADP）はリン酸化され、アデノシン トリホスフエー
ト（ATP）に変換される。この変換はマグネシウムイオ
ンを必要とする。
ート（PEP）を脱リン酸し、ピルビン酸（PA）に変換す
る酵素であり、この時、アデノシン ジホスフエート
（ADP）はリン酸化され、アデノシン トリホスフエー
ト（ATP）に変換される。この変換はマグネシウムイオ
ンを必要とする。
この系にカルシウムイオンを添加すると、定量的にPKを
阻害し、反応が進行しなくなるため、PK阻害の程度によ
り、カルシウム量を知ることができる。
阻害し、反応が進行しなくなるため、PK阻害の程度によ
り、カルシウム量を知ることができる。
阻害の程度は、この系のうち出発原料（ADP、PEP）、生
成物（ATP、PA）のいずれか１つの量を測定することに
より知ることができる。いずれの測定もよく知られてお
り、 （ａ）ピルビン酸を測定するには、例えば以下の方法が
用いられる。
成物（ATP、PA）のいずれか１つの量を測定することに
より知ることができる。いずれの測定もよく知られてお
り、 （ａ）ピルビン酸を測定するには、例えば以下の方法が
用いられる。
・ピルビン酸オキシターゼを用いて、用量的に発生する
過酸化水素を公知の過酸化水素測定系にかける方法、 ・2,4−ジニトロフェニルヒドラジンがピルビン酸によ
りヒドラゾンに変換されることを利用し、その吸光度の
変化により測定する方法、 ・乳酸脱水素酵素を作用させ、ピルビン酸が乳酸に変換
される際、同時にニコチンアミドアデニンヌクレオチド
（NADH）が酸化型（NAD）に変換されることを利用し、
その吸光度の減少を測定する方法。
過酸化水素を公知の過酸化水素測定系にかける方法、 ・2,4−ジニトロフェニルヒドラジンがピルビン酸によ
りヒドラゾンに変換されることを利用し、その吸光度の
変化により測定する方法、 ・乳酸脱水素酵素を作用させ、ピルビン酸が乳酸に変換
される際、同時にニコチンアミドアデニンヌクレオチド
（NADH）が酸化型（NAD）に変換されることを利用し、
その吸光度の減少を測定する方法。
（ｂ）ATPを測定するには、例えば、以下の方法が用い
られる。
られる。
・ヘキソキナーゼを用いてグルコースをグルコース６−
リン酸に変換し、さらにグルコース６−リン酸脱水素酵
素を反応させ、酸化型ニコチンアミドアデニンヌクレオ
チドリン酸（NADP）を還元型（NADPH）に変換すること
による吸光度の増加を測定する方法、 ・ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセロアルデヒド、
３−リン酸脱水素酵素を用いる方法。
リン酸に変換し、さらにグルコース６−リン酸脱水素酵
素を反応させ、酸化型ニコチンアミドアデニンヌクレオ
チドリン酸（NADP）を還元型（NADPH）に変換すること
による吸光度の増加を測定する方法、 ・ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセロアルデヒド、
３−リン酸脱水素酵素を用いる方法。
上記のような方法により、ピルビン酸キナーゼの活性を
カルシウムの含有量を変えた水溶液を用いて、あらかじ
め検量線を作成しておき、その検量線よりカルシウム量
を定量することができる。
カルシウムの含有量を変えた水溶液を用いて、あらかじ
め検量線を作成しておき、その検量線よりカルシウム量
を定量することができる。
本発明の各構成成分の濃度としては、以下の範囲で使用
することが好ましい。
することが好ましい。
PEP 0.1〜10mmol/ PK 2〜200u/ ADP 0.1〜10mmol/ Mg2+ 0.1〜10mmol/ 本発明方法による測定には、通常用いられるような緩衝
液（トリス塩酸バッファ、Hepesバッファ等）を加えて
もよく、また安定化剤（EDTA等のキレート剤、BSA等の
アルブミン等）を加えてもよい。また、さらに出発原料
および生成物の量を測定するのに必要な試薬を同時に加
えてもよい。
液（トリス塩酸バッファ、Hepesバッファ等）を加えて
もよく、また安定化剤（EDTA等のキレート剤、BSA等の
アルブミン等）を加えてもよい。また、さらに出発原料
および生成物の量を測定するのに必要な試薬を同時に加
えてもよい。
また、本発明方法は、用手法はもちろんのこと、通常の
生化学検査自動分析機器によっても実施することができ
る。
生化学検査自動分析機器によっても実施することができ
る。
実施例 以下の実施例により、本発明を詳述するが、本発明はこ
れらの実施例により限定されるものではない。
れらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ カルシウム定量のとき、ピルビン酸キナーゼの活性を乳
酸脱水素酵素を用いて測定する方法。
酸脱水素酵素を用いて測定する方法。
試薬溶液として以下の試薬を混合した。
還元型ニコチンアミドヌクレオチド（NADH）2.5mmol/
×100μ 乳酸脱水素酵素 5.5u/ml×100μピルビン酸キナーゼ
（PK） 0.2u/ml×100μ ホスホエノール ピルベート（PEP） 10mmol/×100μ
アデノシン ジホスフェート（ADP） 10mmol/×100μ Hepesバッファ 500mmol/×200μ 塩化カリウム 200mmol/×100μ 塩化マグネシウム 10mmol/×100μ 水 80μ この試薬溶液に０〜5mmol/塩化カルシウム水溶液20μ
を添加し、37℃における340nmでの吸光度減少を経時
的に測定し、おのおのの反応速度を出して、カルシウム
濃度に対し、プロットした検量線を第２図に示す。
×100μ 乳酸脱水素酵素 5.5u/ml×100μピルビン酸キナーゼ
（PK） 0.2u/ml×100μ ホスホエノール ピルベート（PEP） 10mmol/×100μ
アデノシン ジホスフェート（ADP） 10mmol/×100μ Hepesバッファ 500mmol/×200μ 塩化カリウム 200mmol/×100μ 塩化マグネシウム 10mmol/×100μ 水 80μ この試薬溶液に０〜5mmol/塩化カルシウム水溶液20μ
を添加し、37℃における340nmでの吸光度減少を経時
的に測定し、おのおのの反応速度を出して、カルシウム
濃度に対し、プロットした検量線を第２図に示す。
実施例２ カルシウム定量のときピルビン酸キナーゼの活性を生じ
たATP量よりヘキソース、グルコース−６−リン酸脱水
素酵素を用いて測定する方法 以下の試薬を混合して試薬溶液を調製した。
たATP量よりヘキソース、グルコース−６−リン酸脱水
素酵素を用いて測定する方法 以下の試薬を混合して試薬溶液を調製した。
グルコース６−リン酸脱水素酵素 20u/ml×50μ ヘキソキナーゼ 40u/ml×50μ ピルビン酸キナーゼ 0.2u/ml×100μ ADP 10mmol/×100μ ホスホエノール ピルベート 10mmol/×100μ 酸化型ニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸（NA
DP） 5mmol/×100μ トリス塩酸バッファ 1mol/×100μ 塩化マグネシウム 20mmol/×50μ 塩化カリウム 100mmol/×50μ グルコース 1.5mol/×200μ 水 80μ 上記の試験溶液に０〜5mmol/塩化カルシウム水溶液20
μを添加し、37℃における340nmでの吸光度増加を経
済的に測定し、おのおの反応速度を出して、カルシウム
濃度に対しプロットした検量線を第３図に示す。
DP） 5mmol/×100μ トリス塩酸バッファ 1mol/×100μ 塩化マグネシウム 20mmol/×50μ 塩化カリウム 100mmol/×50μ グルコース 1.5mol/×200μ 水 80μ 上記の試験溶液に０〜5mmol/塩化カルシウム水溶液20
μを添加し、37℃における340nmでの吸光度増加を経
済的に測定し、おのおの反応速度を出して、カルシウム
濃度に対しプロットした検量線を第３図に示す。
比較例 本発明とｏ−CPC法との相関 値清検体77例につき、実施例１の方法と、現在汎用され
ているｏ−CPC法との実測値との相関を第４図に示す。
ているｏ−CPC法との実測値との相関を第４図に示す。
ｏ−CPC法は、カルシウム測定用キットであるCalciumII
−HA Tesst wako（和光純薬社製）を用いて、自動分析
器（日立705型）で血清中のカルシウムを測定すること
により実施した。第４図から両者は、よい相関を示し、
本発明方法は日常検査用として十分利用できることがわ
かった。
−HA Tesst wako（和光純薬社製）を用いて、自動分析
器（日立705型）で血清中のカルシウムを測定すること
により実施した。第４図から両者は、よい相関を示し、
本発明方法は日常検査用として十分利用できることがわ
かった。
発明の効果 本発明は、酵素を用いた方法であるため他の方法に比し
特異性が高く、また従来の酵素を用いた方法に比べて、
検体の希釈の必要がなく、長い反応時間も必要としない
カルシウム測定法であり、種々の疾患における判定を適
確に行なうことができる。
特異性が高く、また従来の酵素を用いた方法に比べて、
検体の希釈の必要がなく、長い反応時間も必要としない
カルシウム測定法であり、種々の疾患における判定を適
確に行なうことができる。
第１図は本発明測定法の原理の説明図であり、第２図及
び第３図は本発明におけるカルシウム定量の検量線を示
し、第４図は本発明法とｏ−CPC法との相関を示すグラ
フである。
び第３図は本発明におけるカルシウム定量の検量線を示
し、第４図は本発明法とｏ−CPC法との相関を示すグラ
フである。
Claims (3)
- 【請求項１】ホスホエノール ピルベート、アデノシン
ジホスフェート、ピルビン酸キナーゼおよびマグネシウ
ムイオンを含有する試薬を用いることを特徴とする体液
中のカルシウム測定法。 - 【請求項２】マグネシウムイオン、ピルビン酸キナー
ゼ、ホスホエノール ピルベートおよびアデノシン ジ
ホスフェートを必須反応成分とし、ピルビン酸キナーゼ
によりホスホエノール ピルベートがピルビン酸に変換
され、かつアデノシン ジホスフェートがアデノシン
トリホスフェートに変換される反応系において、カルシ
ウムイオンがピルビン酸キナーゼを阻害する反応を用い
ることを特徴とする体液中のカルシウムイオンの測定方
法。 - 【請求項３】ホスホエノール ピルベート、アデノシン
ジホスフェート、ピルビン酸およびアデノシン トリ
ホスフェートのいずれか一つを測定する請求項２記載の
体液中のカルシウムイオンの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29698088A JPH0698035B2 (ja) | 1988-11-24 | 1988-11-24 | 体液中のカルシウム測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29698088A JPH0698035B2 (ja) | 1988-11-24 | 1988-11-24 | 体液中のカルシウム測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02142498A JPH02142498A (ja) | 1990-05-31 |
| JPH0698035B2 true JPH0698035B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=17840693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29698088A Expired - Fee Related JPH0698035B2 (ja) | 1988-11-24 | 1988-11-24 | 体液中のカルシウム測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0698035B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5925570A (en) * | 1991-12-25 | 1999-07-20 | Iatron Laboratories, Inc. | Method of measuring metals in samples of living body |
| JP5633669B2 (ja) * | 2009-11-19 | 2014-12-03 | 日東紡績株式会社 | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット |
-
1988
- 1988-11-24 JP JP29698088A patent/JPH0698035B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02142498A (ja) | 1990-05-31 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |