JPH0220297A - コリンエステラーゼ活性の定量法及び定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、コリンエステラーゼ活性の定量法および該
定量法に使用するのに好適な試薬に関する。

この発明は、主として肝臓疾患の診断等のために、コリ
ンエステラーゼ活性を定量する方法において、 コリンエステルを基質として使用し、コリンエステラー
ゼの作用によって生成するコリンを、コリンキナーゼを
用いて定量することによって、基質として使用するコリ
ンエステルの種類に左右されることなく、コリンエステ
ラーゼ活性を精度よく定量できるようにし、これによっ
て例えば肝臓疾患の正確で簡易迅速な診断を可能にする
ようにしたものである。

（従来の技術） 従来から、疾病の診断法として、生体内酵素の活性を測
定する方法が利用されているが、これは、疾病と生体内
酵素の活性との間に有意な相関性が存在するという知見
に基づくものである。

例えば、最近の死亡原因の」二位を占めるようになって
いる肝臓疾Φとコリンエステラーゼ活性との間には密接
な関係があることが知られている。

このため、コリンエステラーゼ活性の定量による肝臓疾
患の診断法が広く利用されるようになっている。

現在のところ、臨床検査室等において利用されているコ
リンエステラーゼ活性の定量法としては、例えば以下の
ような方法が知られている（１）アセデルコリンを基質
とする酵素反応系のｐＨの変化を測定する方法、 （２）ヂオコリンエステルを基質とする酵素反応におい
て遊離するＳ　Ｉ−Ｉ基を測定する方法、（３）ベンゾ
イルコリン等を基質とする酵素反応において遊離するコ
リンにコリンオギノグーゼを作用させ、生成する過酸化
水素を測定する方法、 （４）ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを基質とする酵
素反応において生成するｐ−ヒドロキシ安息香酸に溶存
酸素の存在下でｐ−ヒドロギシ安息香酸水素化酵素を作
用させ、消費されるニコヂンアミドアデニンンヌクレオ
チド燐酸（還元型）の３４．　Ｏｎｍにおける吸収の減
少速度を測定する方法、および（５）アセチルコリンを
基質とする酵素反応において生成する酢酸を酢酸キナー
ゼを用いて定量する方法［「臨床化学Ｊ、第４巻、第２
（発明が解決しようとする課題） この発明は、従来の上記問題点を解消し、基質として使
用するコリンエステルの種類に左右されることなく、コ
リンエステラーゼ活性を高精度で定量できる方法及び試
薬を提供するためになされたものである。

（課題を解決するための手段） すなわち本発明は、コリンエステルとコリンエステラー
ゼとの酵素反応によって生成するコリンを、コリンキナ
ーゼを用いて定量することを特徴とする、コリンエステ
ラーゼ活性の定量法およびコリンエステル、コリンキナ
ーゼ及びアデノシン５−三燐酸を含有するコリンエステ
ラーゼ活性の定量用試薬を要旨とするものである。

本発明で使用するコリンエステルとしては、従来からコ
リンエステラーゼの基質として知られている種々の化合
物、例えばアセチルコリン、ベンゾイルコリン、ブチリ
ルコリンおよびこれらの各種の誘導体が挙げられる。

また、コリンキナーゼとしては例えば微生物山号、第１
８６頁〜第１８９頁（１９７５年）および特開昭５８−
１５５０９９号公報参照］。

しかしながら、（１）の方法においては、至ｉｐＨの紺
持が困難で、ｐＴ−１の変化ら必ずしも指示薬の変色の
度合と平行しないために測定精度が悪く、（２）の方法
においては、共存するＳ　Ｉ−［化合物の影響で誤差を
生じ、（３）おにび（４）の方法においては、高η１位
のコリンエステラーゼの測定て溶存酸素が不足して誤差
を生じ、また、（５）の方法においては、共役酵素とし
て使用する酢酸キナーゼは極めて大きなミバエリス定数
（１２０〜１５０ｍＭ）を有するので多量の酢酸キナー
ゼを必要とする、等の難点がある。

即ち、従来のコリンエステラーゼ活性の定量法において
は、使用する基質が特定のものに限定され、基質の種類
によって測定原理が１・９違するので一般的ではなく、
しかも各測定原理には固有の欠点が内在するために高精
度の定量は困難であるという問題点がある。

来のものおよび動物組織由来のもの等各種のコリンキナ
ーゼが使用できるが、特にコリンに対する親和力が極め
て強い酵母由来のコリンキナーゼ（コリンに対ずろミバ
エリス定数　１，５ＸＩＯ−５Ｍ）が最も好適である［
コリンキナーゼの正式名称はアデノシン５゛−三燐酸、
コリンコリンホランスフェラーゼ（ＥＣ２，７，１，３
２）である］。

本発明によるコリンエステラーゼ活性の定量法の特徴は
、コリンエステルとコリンエステラーゼとの反応によっ
て生成するコリンに、コリンに対する特異性が極めて良
好なコリンキナーゼを共役酵素として作用させ、生成物
を定量することである。

この場合、コリンキナーゼの特異的な作用によって生成
する生成物の定量法は特に限定的ではないが、通常は、
上記の酵素反応によって生成するコリン？こ、アデノシ
ン５゛−三燐酸（以下、ＡＴＰという）の存在下でコリ
ンキナーゼを作用させ、生成するコリン燐酸とアデノン
ンニ燐酸（以下、ＡＤＰという）のいずれかを定量する
。

コリン燐酸は、例えば、適当な色源体と反応させ、可視
部の比色法によって定量することができ、また、ＡＤＰ
は、例えば、ピルビン酸キナーゼと乳酸脱水素酵素との
共役酵素系を使用することによって定量可能である（次
式参照）。

（式中、ＮＡＤＨは還元型β−ニコチンアミドアデニン
・ジヌクレオドを示し、ＮＡＤ＋は酸化型β−ニコチン
アミド−アデニン・ジヌクレオドを示す） 特に後者の定量法は、全反応系を酵素系として行なうの
で、共存物質の影響を受けにくく、極めて有利な方法で
ある。この場合、ＮＡＤＨの紫外部（３４０ｎｍ）の吸
光度を測定することにより、高精度の定量を容易に行な
うことができるだけでなく、ピルビン酸キナーゼの作用
によって、ＡＤＰからＡＴＰを再生することができるの
で、コリンに対するコリンキナーゼの作用が増強され、
高感度の測定が可能となる。

ピルビン酸キナーゼと乳酸脱水素酵素としては、各種の
微生物由来のものや動物組織由来のもの等を適宜使用す
ればよいが、特に兎や豚の筋肉組織由来のものが好適で
ある。

また、ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素、ホスホエ
ノールピルピン酸およびＮＡＤＨの使用量は特に限定的
ではないが、通常はそれぞれ３〜３０ｕ／ｍ（１、ｌ〜
２０　ｕ／　ｍ（１，０，１〜２ｍＭおよび０．１−１
ｍＭである。

上記の本発明による定量法においては、コリンエステル
、コリンキナーゼおよびＡＴＰを含有する溶液を定量試
薬として使用するのが有効である。

コリンエステル、コリンキナーゼおよびＡＴＰの配合量
は通常、それぞれ０．１〜５０ｍＭ（好ましくは０．１
−３１−３Ｏ、Ｏ、ｌ〜５０　ｕ／ｉ（！（好ましくは
０５〜２０ｕ／靜）および０．５〜５０ｍＭ（好ましく
は１〜３０ｍＭ）である。

この場合、該定量用試薬は、コリンキナーゼとＡＴＰを
主成分とする第一試薬とコリンエステルを主成分とする
第二試薬とに別々に調製してもよい。この態様の場合に
は、例えば、第一試薬と試料を所定の測定温度（例えば
、２５°Ｃ１３０℃または３７℃）に所定時間（例えば
、３分間）保持した後、測定温度に調温した恒温セル内
に入れ、これに第二試薬を添加し、該セル内の溶液の３
４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定すればよい。

本発明方法に係わる反応温度は特に限定的ではなく、従
来から臨床化学検査において常用されている温度、例え
ば２５℃、３０℃または３７℃等を適宜採用すればよい
。

また、本発明方法に係わる反応系には前記の定量用試薬
のほかに、常套の添加剤、例えば安定化剤（例えば、硫
酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなど
の無機塩類、ゲルタデオン、Ｎ−アセチルシスティンな
どのスルフヒドリル等）、防腐剤（例えば、アジ化ナト
リウム、エヂレンジアミン四酢酸等）および賦形剤（例
えば、糖類、アミノ酸、アルコール類等）等を適宜存在
させてもよい。

上記の本発明方法の基本的原理の一例を以下の反応式に
よって示す。

コリンエステラーセゝ アセチルコリン」〜ｎ、ｏ−−ＮＴ［＋コリン（実施例
） 以下、本発明を実施例によってさらに説明する。

実施例１ 酵母由来のコリンキナーゼとピルビン酸キナーゼおよび
乳酸脱水素酵素（いずれもベーリンガー・マンハイム山
之内株式会社の市販品）をそれぞれＩｕ／ｉρ、５ｕ／
１１ｆ２および５ｕ／ｚρ、ＡＴＰ５ｍＭ、ホスホエノ
ールピルビン酸１ｍＭ、ＮＡＤＨ０，２ｍＭ、塩化マグ
ネシウム３０ｍＭおよびトリス緩衝液（ｐＨ７，５）１
００ｍＭから成る第−試薬並びにベンゾイルコリン２　
、５　ｍＭおよび燐酸緩衝液（ｐＨ６，０）５０ｍＭか
ら成る第二試薬を調製した。

一方、被測定試料として、ヒト血漿由来のブチリルコリ
ンエステラーゼ（ベーリンガー・マンハイム山之内株式
会社の市販品）を適度な濃度に希釈した原液をさらに希
釈倍率１１５〜５１５に希釈した溶液を調製した。

第一試薬２．４１と試料０．０１ｍσから成る混合液を
３０°Ｃに約３分間保った後、第二試薬０，６ｍＱを混
和し、これをキュベツト（光路長・ｌ　ｃｍ）内に入れ
、分光光度計を用いて３４０ｎｍにおζ〕る吸光度の減
少速度を測定した。

ＮＡＤＨのモル吸光係数、試薬による試料の希釈倍率お
よび１分間あたりの吸光度の変化量からコリンエステラ
ーゼの活性を算出した。

コリンエステラーゼの活性値（Ｕ／Ｌ）と試料の希釈倍
率との関係を第１図に示す。

第１図から明らかなように、本発明方法の極めて良好な
定量性が認められる。

実施例２および３ コリンエステルとしてブヂリルコリン（実施例２）また
はアセチルコリン（実施例３）を使用するる。

特許出願人　ユニチカ株式会社　ほか１名代　理　人　
弁理士　青　山　葆　ばか２名以外は実施例１と同様に
してコリンエステラーゼの活性を求めた。

コリンエステラーゼの活性値と試料の希釈倍率との関係
を第２図（実施例２）または第３図（実施例３）に示す
が、いずれの場合も極めて良好な定量性が認められる。

（発明の効果） 本発明によれば、コリンに対して極めて良好な特異性を
示すコリンキナーゼを共役酵素として使用することによ
り、基質として使用するコリンエステルの種類に左右さ
れることなく、コリンエステラーゼ活性を高精度で定量
することができ、従って、例えば、肝臓疾患の正確で簡
易迅速な診断が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第３図はそれぞれコリンエステル
としてベンゾイルコリン、ブヂリルコリンまたはアセデ
ルコリンを使用して本発明方法を実施した場合のコリン
エステラーゼ活性（縦軸）と試料の希釈倍率（横軸）と
の関係を示すグラフであ第１図 １１５　２１５　　Ｂ１５　　４１５　５１５４ｒＪ釈
梓年 第２図 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、コリンエステルとコリンエステラーゼとの酵素反応
   によって生成するコリンを、コリンキナーゼを用いて定
   量することを特徴とする、コリンエステラーゼ活性の定
   量法。 ２、コリンエステル、コリンキナーゼおよびアデノシン
   ５’−三燐酸を含有する、コリンエステラーゼ活性の定
   量用試薬。