JPH0642839B2 - 体液中のカリウムイオンを測定する方法及びそのための組成物 - Google Patents
体液中のカリウムイオンを測定する方法及びそのための組成物Info
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- JPH0642839B2 JPH0642839B2 JP63503316A JP50331688A JPH0642839B2 JP H0642839 B2 JPH0642839 B2 JP H0642839B2 JP 63503316 A JP63503316 A JP 63503316A JP 50331688 A JP50331688 A JP 50331688A JP H0642839 B2 JPH0642839 B2 JP H0642839B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的及び非生物学的液体中のイオン（以
後これを分析質とも称する）を測定する方法及び試薬に
関する。
後これを分析質とも称する）を測定する方法及び試薬に
関する。
本発明は、多くの分析質(Analyte)が感受性酵素の活性
を促進又は阻害する能力に基づく。この分析質は、カチ
オン、アニオン、金属又は非金属の元素又は化合物であ
つてもよい。実際に、この分析質は、関連分析インジケ
ータ酵素の感受性の範囲の外の濃度で、又は、酵素が敏
感である他のイオンの存在で干渉(interference)が惹起
される濃度で試料中に存在することが屡々認められてい
る。本発明は、これらの問題を、種々の方法で対応しか
つ解決する。
を促進又は阻害する能力に基づく。この分析質は、カチ
オン、アニオン、金属又は非金属の元素又は化合物であ
つてもよい。実際に、この分析質は、関連分析インジケ
ータ酵素の感受性の範囲の外の濃度で、又は、酵素が敏
感である他のイオンの存在で干渉(interference)が惹起
される濃度で試料中に存在することが屡々認められてい
る。本発明は、これらの問題を、種々の方法で対応しか
つ解決する。
臨床生化学の実際において、血清電解質の測定は、病院
で実施されている最も一般的な分析試験である。これら
の測定は、通常の研究のためのみならず屡々、分析の速
度が重要である緊急及び救急処理のためにも必要であ
る。病院での遅延の主要原因は、病室から診断研究室ま
での検体の移送であり、病床近くで容易に実施しうる方
法は、緊急時には特に有効である。
で実施されている最も一般的な分析試験である。これら
の測定は、通常の研究のためのみならず屡々、分析の速
度が重要である緊急及び救急処理のためにも必要であ
る。病院での遅延の主要原因は、病室から診断研究室ま
での検体の移送であり、病床近くで容易に実施しうる方
法は、緊急時には特に有効である。
臨床生化学の実際におけるカリウムおよびナトリウムを
分析する一般的方法は、炎光光度法である。この方法
は、特定の原子に熱エネルギーを与えると、これが励起
され、基底状態に戻る際に特徴的な光を発する原理に基
づく。炎内での原子により生せしめられる放射エネルギ
ーの特性波長の強度は、炎内で励起される原子の数に正
比例し、これは、試料中の当該物質の濃度に正比例す
る。必要な装置は複雑であり、かなり高価であり、可燃
性ガスの使用を必要とする。
分析する一般的方法は、炎光光度法である。この方法
は、特定の原子に熱エネルギーを与えると、これが励起
され、基底状態に戻る際に特徴的な光を発する原理に基
づく。炎内での原子により生せしめられる放射エネルギ
ーの特性波長の強度は、炎内で励起される原子の数に正
比例し、これは、試料中の当該物質の濃度に正比例す
る。必要な装置は複雑であり、かなり高価であり、可燃
性ガスの使用を必要とする。
殊に、ナトリウム、カリウム及び塩素に関する択一的方
法は、イオン選択性電極を使用させる。理想的には、各
電極は、１種のイオンに対してのみ感応する特異的なイ
オン選択性を有すべきである。実際には、このような場
合はなく、すべてのイオン選択性電極に対して干渉イオ
ンが存在する。更に、イオン特異性電極は、一般に補正
は可能であるが、絶対的に特異的ではない。電極は、特
殊イオンの存在時に生ぜしめられる電圧を測定する。こ
の装置はかなり高価である。従つて、分光光度法で実施
することもできず、イオン測定用の臨床的要求も、市場
で入手しうる臨床アナライザー（その大抵は、分光光度
分析のために設計されている）の複雑さを実質的に増
す。双方の方法は、その実施の成巧のためにかなりの程
度の熟練と知識を要求する。
法は、イオン選択性電極を使用させる。理想的には、各
電極は、１種のイオンに対してのみ感応する特異的なイ
オン選択性を有すべきである。実際には、このような場
合はなく、すべてのイオン選択性電極に対して干渉イオ
ンが存在する。更に、イオン特異性電極は、一般に補正
は可能であるが、絶対的に特異的ではない。電極は、特
殊イオンの存在時に生ぜしめられる電圧を測定する。こ
の装置はかなり高価である。従つて、分光光度法で実施
することもできず、イオン測定用の臨床的要求も、市場
で入手しうる臨床アナライザー（その大抵は、分光光度
分析のために設計されている）の複雑さを実質的に増
す。双方の方法は、その実施の成巧のためにかなりの程
度の熟練と知識を要求する。
同様に、熱量測定法によるクロリドの慣用測定も、特殊
な装置を必要とする。この滴定法の終点は、不溶の塩化
銀生成物の形成の完結に基づく電気流動率の増大により
探知される。電圧測定法も使用でき、これは非常に時間
もかかり、付加的な装置を包含する。
な装置を必要とする。この滴定法の終点は、不溶の塩化
銀生成物の形成の完結に基づく電気流動率の増大により
探知される。電圧測定法も使用でき、これは非常に時間
もかかり、付加的な装置を包含する。
更に、クロリドに関しては、多くの光電法及び滴定法が
あり、例えばそれには次のものが包含される： −ジフエニルカルバゾル錯体を経る遊離Ｈｇ２＋イオン
の滴定 −水銀錯体の解離後にＨｇＣ２の沈殿により形成され
る鉄のローダニド錯体の比色測定（Skeggs.Clin.Chem.
１０，１９６４，９１８ｆ；Schmidt,Zentralblatt pha
rm１２４（９），１９８５．５２７ｆ） −相応する水銀塩からのクロラニル酸の比色測定(Rensc
hler) −無色水銀塩からのジエチルジチオカルバミン酸の着色
Cu2+錯体の測定（西ドイツ特許出願公開第２１３７１４
６号） −同様に、水銀錯体の解離による着色金属錯体の形成に
基づく、より一般的なＴＰＴＺ−法（トリピリジル−ｓ
−トリアジン；R.Fried.Zeitschr.Klin.Chem.Klin.Bioc
h.１０，１９７２，２８０ｆ；西ドイツ特許出願公開第
２１５３３８７号）。
あり、例えばそれには次のものが包含される： −ジフエニルカルバゾル錯体を経る遊離Ｈｇ２＋イオン
の滴定 −水銀錯体の解離後にＨｇＣ２の沈殿により形成され
る鉄のローダニド錯体の比色測定（Skeggs.Clin.Chem.
１０，１９６４，９１８ｆ；Schmidt,Zentralblatt pha
rm１２４（９），１９８５．５２７ｆ） −相応する水銀塩からのクロラニル酸の比色測定(Rensc
hler) −無色水銀塩からのジエチルジチオカルバミン酸の着色
Cu2+錯体の測定（西ドイツ特許出願公開第２１３７１４
６号） −同様に、水銀錯体の解離による着色金属錯体の形成に
基づく、より一般的なＴＰＴＺ−法（トリピリジル−ｓ
−トリアジン；R.Fried.Zeitschr.Klin.Chem.Klin.Bioc
h.１０，１９７２，２８０ｆ；西ドイツ特許出願公開第
２１５３３８７号）。
これら方法の主要欠点は、高い毒性の物質を含有する溶
液の使用である。これら方法のいくつかは、煩雑であ
り、かつ不正確である（例えば滴定法）。多くの試薬は
不安定であり、較正曲線は非直線性である（例えばロー
ダニド法）。更に、これらの方法のいくつかは、試料の
蛋白質含分による干渉を除くために、前処理が必要であ
る。
液の使用である。これら方法のいくつかは、煩雑であ
り、かつ不正確である（例えば滴定法）。多くの試薬は
不安定であり、較正曲線は非直線性である（例えばロー
ダニド法）。更に、これらの方法のいくつかは、試料の
蛋白質含分による干渉を除くために、前処理が必要であ
る。
改良ＴＰＴＺ法は、世界知的所有権機構（ＷＯ）８３／
００２６７０号明細書中に記載されているが、毒性水銀
化合物の使用がなお欠点である。水銀イオンを使用しな
い比色法のみが、過塩素酸溶液中のＦｅ(III)のヘキサ
クロロ錯体を測定する（F.Hoppe,Ther.Ggw.１１０
（４），１９７１，５５４ｆ；H.Mahner,Zeitschr.Kli
n.Chem.Klin.Biochem.１１（１１），１９７３，４５１
ｆ；W.T.Law,Clin.Chem.２６（１３），１９８０，１８
７４ｆ；US−４２７８４４０）。この方法のかなりの限
定は、腐蝕性であり、機械的ピペツト系とは許容し得な
い強酸性試薬の使用である。もう１つの欠点は、試料中
のビリルビンによる干渉である。
００２６７０号明細書中に記載されているが、毒性水銀
化合物の使用がなお欠点である。水銀イオンを使用しな
い比色法のみが、過塩素酸溶液中のＦｅ(III)のヘキサ
クロロ錯体を測定する（F.Hoppe,Ther.Ggw.１１０
（４），１９７１，５５４ｆ；H.Mahner,Zeitschr.Kli
n.Chem.Klin.Biochem.１１（１１），１９７３，４５１
ｆ；W.T.Law,Clin.Chem.２６（１３），１９８０，１８
７４ｆ；US−４２７８４４０）。この方法のかなりの限
定は、腐蝕性であり、機械的ピペツト系とは許容し得な
い強酸性試薬の使用である。もう１つの欠点は、試料中
のビリルビンによる干渉である。
カルシウムは、臨床研究室で通例測定されるもう１つの
例である。体液中のこの金属イオンの濃度は、狭い範囲
で調節される。病理学的に高い又は低い濃度は腎不全、
膵炎、テタニー及びうつ血性心不全等の疾患の長期間処
置疾病をもたらすことができる。
例である。体液中のこの金属イオンの濃度は、狭い範囲
で調節される。病理学的に高い又は低い濃度は腎不全、
膵炎、テタニー及びうつ血性心不全等の疾患の長期間処
置疾病をもたらすことができる。
カルシウム測定の最も初期の方法の１つは、テイスダル
（Tisdall；J.Biol.Chem.６３，４６１〜４６５，１９
２５）により文献に記載されており、ここでは、カルシ
ウムを蓚酸（それ自体は比色法で評価される）で沈殿さ
せている。この方法は、遠心分離工程を包含し、従つ
て、非常に時間を要し、カルシウムに対して特異的では
なく、試料の注意深い取扱いに依存する。この方法は、
滴定による及び直接の比色法により多くの研究室で成巧
している。前者は、複雑かつ煩雑な方法の欠点をも有
し、多大の試料量を必要とする。後者の方法では、カル
シウムは色素例えば光度計中で測定できるオルトクレゾ
ールフタレイン・コンプレキソンの色に悪影響を及ぼ
す。この方法の簡単性に基づき、これ自体、臨床研究室
での自動化をもたらす。しかしながら、この方法は、攻
撃的な高アルカリ性溶液及び毒性物質の使用を包含して
いる。これは、特に多くの血清成分例えば脂質、蛋白
質、燐酸塩及びビリルビンにより干渉される傾向があ
り、結果として原子吸収及び炎比色法とは良好に適合し
ない。この比色法のもう１つの欠点は、較正曲線が非直
線性であり、色がかなり温度に依存することである。
（Tisdall；J.Biol.Chem.６３，４６１〜４６５，１９
２５）により文献に記載されており、ここでは、カルシ
ウムを蓚酸（それ自体は比色法で評価される）で沈殿さ
せている。この方法は、遠心分離工程を包含し、従つ
て、非常に時間を要し、カルシウムに対して特異的では
なく、試料の注意深い取扱いに依存する。この方法は、
滴定による及び直接の比色法により多くの研究室で成巧
している。前者は、複雑かつ煩雑な方法の欠点をも有
し、多大の試料量を必要とする。後者の方法では、カル
シウムは色素例えば光度計中で測定できるオルトクレゾ
ールフタレイン・コンプレキソンの色に悪影響を及ぼ
す。この方法の簡単性に基づき、これ自体、臨床研究室
での自動化をもたらす。しかしながら、この方法は、攻
撃的な高アルカリ性溶液及び毒性物質の使用を包含して
いる。これは、特に多くの血清成分例えば脂質、蛋白
質、燐酸塩及びビリルビンにより干渉される傾向があ
り、結果として原子吸収及び炎比色法とは良好に適合し
ない。この比色法のもう１つの欠点は、較正曲線が非直
線性であり、色がかなり温度に依存することである。
Ｗ．Ｈ．アウトロウ(Outlaw)及びＯ．Ｈ．ローリイ(Low
ry)によるアナリテイカル・ビオケミストリイ(Analytic
al Biochemistry)９２，３７０〜３７４（１９７９）に
は、植物組織中のカリウムイオンを測定するための酵素
介在検定が記載されている。この方法では、カリウムイ
オン及びナトリウムイオンにより活性化される（前者は
４０倍以上も有効）ウサギ筋肉からのビルベートキナー
ゼを使用する。この非特異性に基づき、この方法は、カ
リウムが主要カチオンである植物物質には好適である
が、３０倍過剰のナトリウムイオンを含有する血清のよ
うな体液中での測定には不適当である。従つて、ナトリ
ウムイオンは、ローリイ(Lowry)等による酵素的比色法
を血漿又は血清中のカリウムを測定するために使用する
際には、認容できない干渉を起こさせる。もう１つの問
題は、アンモニウムイオンがカリウムイオンに類似の活
性化を与えることである。前記文献は、生物学的液体例
えば血清中のカリウムイオンの分析に関連するこれらの
臨床的問題を処理又は解決をせず、ナトリウムイオンの
測定のための何の方法も提供しない。
ry)によるアナリテイカル・ビオケミストリイ(Analytic
al Biochemistry)９２，３７０〜３７４（１９７９）に
は、植物組織中のカリウムイオンを測定するための酵素
介在検定が記載されている。この方法では、カリウムイ
オン及びナトリウムイオンにより活性化される（前者は
４０倍以上も有効）ウサギ筋肉からのビルベートキナー
ゼを使用する。この非特異性に基づき、この方法は、カ
リウムが主要カチオンである植物物質には好適である
が、３０倍過剰のナトリウムイオンを含有する血清のよ
うな体液中での測定には不適当である。従つて、ナトリ
ウムイオンは、ローリイ(Lowry)等による酵素的比色法
を血漿又は血清中のカリウムを測定するために使用する
際には、認容できない干渉を起こさせる。もう１つの問
題は、アンモニウムイオンがカリウムイオンに類似の活
性化を与えることである。前記文献は、生物学的液体例
えば血清中のカリウムイオンの分析に関連するこれらの
臨床的問題を処理又は解決をせず、ナトリウムイオンの
測定のための何の方法も提供しない。
Ｍ．Ｃ．Wimmer等のClin.Chem.３２巻、NO.４（１９８
６）には、マグネシウムの測定法が記載されている。し
かしながら、この方法では他のイオンによる妨害をさけ
ることはできない。西ドイツ特許出願（ＤＥ）第３６１
４４７０号明細書中には、他のイオン例えばナトリウム
イオンによる重大な妨害なしに血清中のカリウムを測定
する方法に関する記載は欠けている。Ｉ．Ｆ．Dalmonov
a及びN.N.UgarovaによるＪ．Anal.Chem.of USSR（１９
８０）３５巻、NO.８、第２部１０４２〜１０８１に
は、ベリリウム、亜鉛及び水銀等のいくつかのイオンの
酵素に対する一般的記載が包含されているが、これらの
どの方法も、実際に作動したかは明示されてはいない。
６）には、マグネシウムの測定法が記載されている。し
かしながら、この方法では他のイオンによる妨害をさけ
ることはできない。西ドイツ特許出願（ＤＥ）第３６１
４４７０号明細書中には、他のイオン例えばナトリウム
イオンによる重大な妨害なしに血清中のカリウムを測定
する方法に関する記載は欠けている。Ｉ．Ｆ．Dalmonov
a及びN.N.UgarovaによるＪ．Anal.Chem.of USSR（１９
８０）３５巻、NO.８、第２部１０４２〜１０８１に
は、ベリリウム、亜鉛及び水銀等のいくつかのイオンの
酵素に対する一般的記載が包含されているが、これらの
どの方法も、実際に作動したかは明示されてはいない。
従つて、本発明の課題は、前記の問題をさける方法及び
試薬を提供することである。本発明は、酵素の活性への
イオンの影響を測定する方法による液体中のイオン（分
析質）の測定法によりこの問題を解決している。
試薬を提供することである。本発明は、酵素の活性への
イオンの影響を測定する方法による液体中のイオン（分
析質）の測定法によりこの問題を解決している。
この発明の主要態様は、特に液体の稀釈が実施不能な場
合に分析質の自由濃度を分析酵素にとつて至適の範囲に
する選択的結合剤を使用することである。本発明の付加
的要素は、分析酵素の分析質に対する感度を低めて、高
濃度での分析質の測定を許容するようにするために、当
該分析酵素の競争的阻害剤を使用することである。これ
は、選択的結合剤が容易に利用できないか又は認容でき
ない程度に高価である場合に殊に有用である。
合に分析質の自由濃度を分析酵素にとつて至適の範囲に
する選択的結合剤を使用することである。本発明の付加
的要素は、分析酵素の分析質に対する感度を低めて、高
濃度での分析質の測定を許容するようにするために、当
該分析酵素の競争的阻害剤を使用することである。これ
は、選択的結合剤が容易に利用できないか又は認容でき
ない程度に高価である場合に殊に有用である。
本発明のもう１つの態様は、干渉イオンの自由濃度を、
もはや干渉が問題でない程度まで低下させるために、選
択的結合剤を使用することである。競争的阻害剤は、分
析質とよりも干渉イオンとより有効に競争し、この際、
干渉イオンに関連して分析質への酵素の感度を増大する
事実も使用される。
もはや干渉が問題でない程度まで低下させるために、選
択的結合剤を使用することである。競争的阻害剤は、分
析質とよりも干渉イオンとより有効に競争し、この際、
干渉イオンに関連して分析質への酵素の感度を増大する
事実も使用される。
重要な要素は、適当な補酵素の選択を包含する至適条件
を、分析質の促進性又は阻害性作用が実質的に干渉イオ
ンのそれより実質的に大きいように選ぶことである。更
に、分析酵素の活性への分析質及び干渉イオンの作用が
付加的であり、従つて干渉イオンの濃度が公知の場合に
は、分析質の濃度が差によつて容易に測定できる。干渉
イオンが分析液体中に相対的に一定の濃度で生じる場合
には、標準（較正）液中の干渉イオンの適当な濃度を包
含することにより、これは酌量できる。このような分析
質を検定するために他の方法は、分析質が結合剤からの
他のイオンを置換し適当な酵素の活性への放出イオンの
作用が測定される所での競争的結合剤の使用である。
を、分析質の促進性又は阻害性作用が実質的に干渉イオ
ンのそれより実質的に大きいように選ぶことである。更
に、分析酵素の活性への分析質及び干渉イオンの作用が
付加的であり、従つて干渉イオンの濃度が公知の場合に
は、分析質の濃度が差によつて容易に測定できる。干渉
イオンが分析液体中に相対的に一定の濃度で生じる場合
には、標準（較正）液中の干渉イオンの適当な濃度を包
含することにより、これは酌量できる。このような分析
質を検定するために他の方法は、分析質が結合剤からの
他のイオンを置換し適当な酵素の活性への放出イオンの
作用が測定される所での競争的結合剤の使用である。
これらの一般的原理は、血漿又は血清中のカリウム、ナ
トリウム、カルシウム、クロリド及び重炭酸イオンの測
定への適用を示すことにより最も良好に説明することが
できる。しかしながら、これらは広い種類のイオン例え
ばカチオン例えばマグネシウム、マンガン、リチウム、
鉛、亜鉛、銅、鉄又は他の重金属に適用可能である。測
定可能な非金属イオンの例は、プロトン又はアンモニウ
ムである。アンモニウムを生じさせる尿素等の物質も測
定されうる。
トリウム、カルシウム、クロリド及び重炭酸イオンの測
定への適用を示すことにより最も良好に説明することが
できる。しかしながら、これらは広い種類のイオン例え
ばカチオン例えばマグネシウム、マンガン、リチウム、
鉛、亜鉛、銅、鉄又は他の重金属に適用可能である。測
定可能な非金属イオンの例は、プロトン又はアンモニウ
ムである。アンモニウムを生じさせる尿素等の物質も測
定されうる。
好適な酵素 使用できる酵素は、例えば次のものであつてよい（H.J.
Evans et al.Ann.Rev.Plant Pnysiol.１７，４７，１９
６６）： トランスフエラーゼ、例えば燐含有基移送性トランスフ
エラーゼ。このようなトランスフエラーゼは、ピルベー
トキナーゼであつてよい。ピルベートキナーゼの代り
に、他のキナーゼ例えばマグネシウムイオン又はマンガ
ンイオンに対して敏感であるアデニレートキナーゼ又は
ヘキソキナーゼを使用することができる。他のトランス
フエラーゼはアセテートキナーゼである（Ｅ，コリーか
らの）。他の例は、亜鉛イオンに対して敏感な脳からの
ピリドキサールキナーゼである。
Evans et al.Ann.Rev.Plant Pnysiol.１７，４７，１９
６６）： トランスフエラーゼ、例えば燐含有基移送性トランスフ
エラーゼ。このようなトランスフエラーゼは、ピルベー
トキナーゼであつてよい。ピルベートキナーゼの代り
に、他のキナーゼ例えばマグネシウムイオン又はマンガ
ンイオンに対して敏感であるアデニレートキナーゼ又は
ヘキソキナーゼを使用することができる。他のトランス
フエラーゼはアセテートキナーゼである（Ｅ，コリーか
らの）。他の例は、亜鉛イオンに対して敏感な脳からの
ピリドキサールキナーゼである。
ヒドロラーゼ、例えばグリコシダーゼ、例えばα−又は
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｅ．コリーから）、カルボ
キシペプチダーゼＡ（牛膵臓から）、コラゲナーゼ（ク
ロストリジウム・ヒストリクムから）、アミラーゼ（唾
液又は膵液から）又はホスホグリコレートホスフアター
ゼ。
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｅ．コリーから）、カルボ
キシペプチダーゼＡ（牛膵臓から）、コラゲナーゼ（ク
ロストリジウム・ヒストリクムから）、アミラーゼ（唾
液又は膵液から）又はホスホグリコレートホスフアター
ゼ。
ペプチドヒドロラーゼ、例えばシステイン又はチオール
依存性プロテイナーゼ〔その詳細な例は、カルパイン(C
alpain)Ｉ及びII（即ち、カルシウム活性化中性プロテ
アーゼと称される）である〕は、ササキ(Sasaki)等によ
るＪ．Biol.Chem.２５９，１２４８９〜１２４９４（１
９８４）に記載されている。後者の酵素は、種々の動物
組織例えばラツテの肝臓及び腎臓、ヒト及び豚の赤血
球、牛の脳及びウサギの骨格筋から、Ａ．キタハラ(Kit
ahara)等によるJ.Biochem.９５，１７５９〜１７６６
（１９８４）に記載の方法により単離かつ精製すること
ができる。他の例は、ジペプチジルアミノペプチダーゼ
Ｉである（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１，カテプシン；
Ｊ．Ken Mc Donald,Bioch.Biophys.Res.Communication
２４（５），６６，７７１ｆ）。この酵素の他の起源
は、遺伝子組換え技術により得られる。
依存性プロテイナーゼ〔その詳細な例は、カルパイン(C
alpain)Ｉ及びII（即ち、カルシウム活性化中性プロテ
アーゼと称される）である〕は、ササキ(Sasaki)等によ
るＪ．Biol.Chem.２５９，１２４８９〜１２４９４（１
９８４）に記載されている。後者の酵素は、種々の動物
組織例えばラツテの肝臓及び腎臓、ヒト及び豚の赤血
球、牛の脳及びウサギの骨格筋から、Ａ．キタハラ(Kit
ahara)等によるJ.Biochem.９５，１７５９〜１７６６
（１９８４）に記載の方法により単離かつ精製すること
ができる。他の例は、ジペプチジルアミノペプチダーゼ
Ｉである（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１，カテプシン；
Ｊ．Ken Mc Donald,Bioch.Biophys.Res.Communication
２４（５），６６，７７１ｆ）。この酵素の他の起源
は、遺伝子組換え技術により得られる。
オキシドレダクターゼ、例えばグリセロール・デヒドロ
ゲナーゼ（エンテロバクター・アエロゲネスから）アセ
タールデヒドロゲナーゼ（酵母から）又はチロシナーゼ
（カテコール・オキシダーゼ）。
ゲナーゼ（エンテロバクター・アエロゲネスから）アセ
タールデヒドロゲナーゼ（酵母から）又はチロシナーゼ
（カテコール・オキシダーゼ）。
リアーゼ、例えばアルドラーゼ（酵母から）又はカルボ
ニツク・アンヒドラーゼ（牛赤血球から）。
ニツク・アンヒドラーゼ（牛赤血球から）。
他の好適な酵素は、好塩性組織からの種々の酵素であ
る。他の酵素源は、遺伝子組換え技術で得られる。
る。他の酵素源は、遺伝子組換え技術で得られる。
選択的結合剤：広範な種々の結合剤が分析質又は干渉イ
オンの結合のために利用できる。このような結合物質又
はマスキング物質は次のものである：クリプタンド(Cry
ptands)、コロナンド(Coronands)、クラウンエーテル(C
rown ethers)、ポダンド(Podands)、スフエランド(sphe
rands)、ヘミスフエランド(hemispherands)、カリキサ
レン(calixarens)及びこれらの組合せ、天然産のイオノ
フオレ(ionophores)例えば抗生物質、環状ペプチド例え
ばバリノマイシン(valinomycin)、コンプレクソン(Comp
lexones)及びキレート化剤例えばイミノジ酢酸、ＥＤＴ
Ａ、ニトロ三酢酸及びこれらの誘導体。このような化合
物は、次の文献に記載されている：Kontakte(Merck)１
９７７，NO.１．１１頁以降及び２９頁以降；Kontakte
(Merck)１９７７，NO.２，１６頁以降；Kontakte(Merc
k)、１９７７，NO.３，３６頁以降；Phase Transfer Ca
talysts,Properties and Applications(Merck-Schucha
rdt)１９８７，Thermodynamic and Kinetic Data for C
ation Macrocycle Interaction；Ｒ．Ｍ．Izatt etal.C
hemical Reviews８５，２７１〜３９９（１９８５）；D
ata for Biochemical Research,１９８６，Ｒ．Ｍ．
Ｃ．Dawson etal.第３１版、３９９〜４１５頁(Clarend
on Press)Oxford；Ｆ．Ｖｇｔｅ等によるChem.Macroc
ycles,Springer Verlag,New York,１９８５；G.W.Gokel
等によるEds.,Macrocyclic Polyether Synthesis,Sprin
ger Verlag,New York１９８２；Ｊ．Ｍ．Lehn等による
Ｊ．Am.Chem.Soc.９７，６７００〜６７０７（１９７
５）；Ｇ．Schwarzenbach等によるHelv.Chim.Acta.２
８，８２８（１９４５）；Ｓ．Ｆ．Ａ．Kettle,Koordin
ationsverbindungen,Taschentext3,Verlag Chemie,Wein
heim/Bergstr.１９７２；Ａ．Ｅ，Martell等によるDie
Chemie der Metallchelatverbindungen,Verlag Chemie,
Weinheim/Bergstr.１９５８；Ｍ．Becke-Goehring等に
よるKomplexchemie,Springer Verlag,１９７０；F.Kobe
r,Grundlagen der Komplexchemie,Otto Salle Verlag,F
rankfurt/Main１９７９；G.Schwarzenbach etal.Helv.C
him.Acta３１，１０２９（１９４８）；Ｒ．Ｇ．Pearso
n等によるScience１５１，１７２（１９６６）。
オンの結合のために利用できる。このような結合物質又
はマスキング物質は次のものである：クリプタンド(Cry
ptands)、コロナンド(Coronands)、クラウンエーテル(C
rown ethers)、ポダンド(Podands)、スフエランド(sphe
rands)、ヘミスフエランド(hemispherands)、カリキサ
レン(calixarens)及びこれらの組合せ、天然産のイオノ
フオレ(ionophores)例えば抗生物質、環状ペプチド例え
ばバリノマイシン(valinomycin)、コンプレクソン(Comp
lexones)及びキレート化剤例えばイミノジ酢酸、ＥＤＴ
Ａ、ニトロ三酢酸及びこれらの誘導体。このような化合
物は、次の文献に記載されている：Kontakte(Merck)１
９７７，NO.１．１１頁以降及び２９頁以降；Kontakte
(Merck)１９７７，NO.２，１６頁以降；Kontakte(Merc
k)、１９７７，NO.３，３６頁以降；Phase Transfer Ca
talysts,Properties and Applications(Merck-Schucha
rdt)１９８７，Thermodynamic and Kinetic Data for C
ation Macrocycle Interaction；Ｒ．Ｍ．Izatt etal.C
hemical Reviews８５，２７１〜３９９（１９８５）；D
ata for Biochemical Research,１９８６，Ｒ．Ｍ．
Ｃ．Dawson etal.第３１版、３９９〜４１５頁(Clarend
on Press)Oxford；Ｆ．Ｖｇｔｅ等によるChem.Macroc
ycles,Springer Verlag,New York,１９８５；G.W.Gokel
等によるEds.,Macrocyclic Polyether Synthesis,Sprin
ger Verlag,New York１９８２；Ｊ．Ｍ．Lehn等による
Ｊ．Am.Chem.Soc.９７，６７００〜６７０７（１９７
５）；Ｇ．Schwarzenbach等によるHelv.Chim.Acta.２
８，８２８（１９４５）；Ｓ．Ｆ．Ａ．Kettle,Koordin
ationsverbindungen,Taschentext3,Verlag Chemie,Wein
heim/Bergstr.１９７２；Ａ．Ｅ，Martell等によるDie
Chemie der Metallchelatverbindungen,Verlag Chemie,
Weinheim/Bergstr.１９５８；Ｍ．Becke-Goehring等に
よるKomplexchemie,Springer Verlag,１９７０；F.Kobe
r,Grundlagen der Komplexchemie,Otto Salle Verlag,F
rankfurt/Main１９７９；G.Schwarzenbach etal.Helv.C
him.Acta３１，１０２９（１９４８）；Ｒ．Ｇ．Pearso
n等によるScience１５１，１７２（１９６６）。
多価イオン殊に２価カチオンを結合することのできるキ
レート化剤の例は、エチレングリコール−ビス−（２−
アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ
酢酸(EGTA)及び（エチレンジニトリロ）テトラ酢酸(EDT
A)である。
レート化剤の例は、エチレングリコール−ビス−（２−
アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ
酢酸(EGTA)及び（エチレンジニトリロ）テトラ酢酸(EDT
A)である。
多価イオンと結合することのできる多くの試薬、例えば
ＥＤＴＡ及びその誘導体が存在するが、１価イオンと結
合する試薬は、あまり一般的でない。テトラフエニルボ
ロンはカリウムイオンと結合する。しかしながら、広い
可能性を有する化合物群は、水溶液中の１価のカチオン
と選択的に結合することのできる試薬の例であるクリプ
タンドである（Ｒ．Ｍ．Jzatt等によるChem.Reviews８
５，２７１〜３３９）。グリプタンドの詳細な例は、メ
ルク・シユーハルト(Merck-Schuchardt)のクリプトフイ
ツクス（Kryptofix ）化合物、例えば４，７，１３，
１６，２１−ペンタオキサ−１，１０−ジアザビシクロ
〔８．８．１５〕−トリコサン〔Kryptofix ２２１、M
erck-Schuchardtカタログ（１９８９／８８）４３８
頁、NO.８１０６４６（Ｋ２２１）〕、４，７，１３，
１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビ
シクロ〔８．８．５〕−ヘキサコサン〔Kryptofix ２
２２、Merck-Schuchardtカタログ（１９８７／８８）４
３８頁、NO.８１０６４７（Ｋ２２２）〕である。
ＥＤＴＡ及びその誘導体が存在するが、１価イオンと結
合する試薬は、あまり一般的でない。テトラフエニルボ
ロンはカリウムイオンと結合する。しかしながら、広い
可能性を有する化合物群は、水溶液中の１価のカチオン
と選択的に結合することのできる試薬の例であるクリプ
タンドである（Ｒ．Ｍ．Jzatt等によるChem.Reviews８
５，２７１〜３３９）。グリプタンドの詳細な例は、メ
ルク・シユーハルト(Merck-Schuchardt)のクリプトフイ
ツクス（Kryptofix ）化合物、例えば４，７，１３，
１６，２１−ペンタオキサ−１，１０−ジアザビシクロ
〔８．８．１５〕−トリコサン〔Kryptofix ２２１、M
erck-Schuchardtカタログ（１９８９／８８）４３８
頁、NO.８１０６４６（Ｋ２２１）〕、４，７，１３，
１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビ
シクロ〔８．８．５〕−ヘキサコサン〔Kryptofix ２
２２、Merck-Schuchardtカタログ（１９８７／８８）４
３８頁、NO.８１０６４７（Ｋ２２２）〕である。
干渉アニオンを除去するためのマスキング剤として次の
群の化合物も使用することができる：アニオンクリプタ
ンド(anioncryptands)、ヘテロサイクロフアン(heteroc
yclophanes)、カタピナンド(catapinends)及び無機金属
錯体又は不溶性塩。アニオン錯形成性化合物の詳細な例
は、文献中に記載されており、例えばアザモノー(azamo
no-)又はアザポリサイクル類(azapolycyles)、マクロサ
イクル性４級テトラヘドロン化合物、マクロサイクル性
ビス−金属−錯体、共有結合したルイス酸中心を有する
マクロサイクル類(macrocycles)、プロトン化又はアル
キル化された４級クリプタンタンド類又はカタピナンド
類(F.P.Schmidtchen,Nachrichten Chem.Tech.lab.３６
（１），１９８８，Ｓ，８ｆ；E.Graf,J.Amer.Chem.So
c.９８（２０），１９７６，６４０３ｆ；C.H.Park J.A
mer.Chem.Soc.９０（９），１９６８，２４３１ｆ）並
びに例えばＦｅ(III)のヘキサクロロ錯体又は硝酸銀で
ある。
群の化合物も使用することができる：アニオンクリプタ
ンド(anioncryptands)、ヘテロサイクロフアン(heteroc
yclophanes)、カタピナンド(catapinends)及び無機金属
錯体又は不溶性塩。アニオン錯形成性化合物の詳細な例
は、文献中に記載されており、例えばアザモノー(azamo
no-)又はアザポリサイクル類(azapolycyles)、マクロサ
イクル性４級テトラヘドロン化合物、マクロサイクル性
ビス−金属−錯体、共有結合したルイス酸中心を有する
マクロサイクル類(macrocycles)、プロトン化又はアル
キル化された４級クリプタンタンド類又はカタピナンド
類(F.P.Schmidtchen,Nachrichten Chem.Tech.lab.３６
（１），１９８８，Ｓ，８ｆ；E.Graf,J.Amer.Chem.So
c.９８（２０），１９７６，６４０３ｆ；C.H.Park J.A
mer.Chem.Soc.９０（９），１９６８，２４３１ｆ）並
びに例えばＦｅ(III)のヘキサクロロ錯体又は硝酸銀で
ある。
結合剤の機能：これら結合剤は次の目的のために使用さ
れる： １．干渉イオンの選択的結合 ２．試料の稀釈が不可能な場合、分析質の濃度を最適測
定レベルまで低下させる。
れる： １．干渉イオンの選択的結合 ２．試料の稀釈が不可能な場合、分析質の濃度を最適測
定レベルまで低下させる。
３．本発明の態様は、結合剤が存在し、インジケータイ
オン(indicator ions)と錯体を形成し（この錯体からイ
ンジケータイオンは化学量論的に分析質イオンで換えら
れる）、酵素活性へのこの換えられたインジケータイオ
ンの影響を検定し、この際、分析質イオンの濃度の直接
測定法が得られる。例えば、このような方法において、
酵素はピルベートキナーゼであり、インジケータイオン
はカリウムであり、結合剤はクリプトフイクス（krypto
fix ）２２１であり、被測定イオンはナトリウムであ
るか又は酵素はキナーゼでありインジケータイオンはＭ
ｇ２＋であり、結合剤はキレート化剤例えばＥＤＴＡで
あり、イオンは金属であるか又は酵素はピリドキサルキ
ナーゼであり、インジケータイオンはＺｎ２＋であり、
結合剤はクリプトフイクス ２２１であり、イオンは重
金属であるか又は酵素はα−アミラーゼであり、結合剤
はＡｇ又はＨｇであり、被測定イオンはクロリドである
か又は酵素はコラゲナーゼ、結合剤はキレート化剤例え
ばＥＤＴＡであり被測定イオンはカルシウムである。
オン(indicator ions)と錯体を形成し（この錯体からイ
ンジケータイオンは化学量論的に分析質イオンで換えら
れる）、酵素活性へのこの換えられたインジケータイオ
ンの影響を検定し、この際、分析質イオンの濃度の直接
測定法が得られる。例えば、このような方法において、
酵素はピルベートキナーゼであり、インジケータイオン
はカリウムであり、結合剤はクリプトフイクス（krypto
fix ）２２１であり、被測定イオンはナトリウムであ
るか又は酵素はキナーゼでありインジケータイオンはＭ
ｇ２＋であり、結合剤はキレート化剤例えばＥＤＴＡで
あり、イオンは金属であるか又は酵素はピリドキサルキ
ナーゼであり、インジケータイオンはＺｎ２＋であり、
結合剤はクリプトフイクス ２２１であり、イオンは重
金属であるか又は酵素はα−アミラーゼであり、結合剤
はＡｇ又はＨｇであり、被測定イオンはクロリドである
か又は酵素はコラゲナーゼ、結合剤はキレート化剤例え
ばＥＤＴＡであり被測定イオンはカルシウムである。
分析用液体：分析質の測定が行なわれる生物学的液体の
例は、血液、血清、血漿、汗、滲出液又は浸出液又は尿
である。他の液体の例は水道水又は食料品又は果物の抽
出物又は醗酵液例えばワインである。
例は、血液、血清、血漿、汗、滲出液又は浸出液又は尿
である。他の液体の例は水道水又は食料品又は果物の抽
出物又は醗酵液例えばワインである。
カリウム及びナトリウムイオンの測定のための一般的原
理の適用 カリウムイオンに対するピルベートキナーゼの敏感性に
基づく血清又は血漿中のカリウムイオンの満足しうる測
定を得るための重要要件は、ナトリウム及びアンモニウ
ムイオンによる干渉の克服である。本発明に包含される
一般的原理によれば、これは次の１以上の方法で達成さ
れる： １．ナトリウムイオンと適当な結合剤例えばクリプトフ
イツクス ２２１との選択的結合 ２．ピルベートキナーゼ原としてのウサギ筋肉よりもバ
シルス・ステアロテルモフイルス(Bacillus stearother
mophilus)を選択する。それというのも、この細菌酵素
は、ナトリウムイオンとの関連でカリウムイオンに対す
る敏感度が筋肉酵素よりも２倍大きいからである。
理の適用 カリウムイオンに対するピルベートキナーゼの敏感性に
基づく血清又は血漿中のカリウムイオンの満足しうる測
定を得るための重要要件は、ナトリウム及びアンモニウ
ムイオンによる干渉の克服である。本発明に包含される
一般的原理によれば、これは次の１以上の方法で達成さ
れる： １．ナトリウムイオンと適当な結合剤例えばクリプトフ
イツクス ２２１との選択的結合 ２．ピルベートキナーゼ原としてのウサギ筋肉よりもバ
シルス・ステアロテルモフイルス(Bacillus stearother
mophilus)を選択する。それというのも、この細菌酵素
は、ナトリウムイオンとの関連でカリウムイオンに対す
る敏感度が筋肉酵素よりも２倍大きいからである。
３．検定における敏感なインジケータ酵素の競争的阻害
剤であるイオンの包含、例えばリチウムイオンをナトリ
ウムイオン及びカリウムイオンと競争するために使用す
る。
剤であるイオンの包含、例えばリチウムイオンをナトリ
ウムイオン及びカリウムイオンと競争するために使用す
る。
４．アンモニウムイオンの酵素的除去。
リチウムイオンは、カリウムイオンに対する競争体(com
petitor)として有効性が低いので、真の効果は、カリウ
ムイオンに対するピルベートキナーゼの相対的敏感度が
ナトリウムに比べて更に５０％増大することである。更
に、リチウムイオンの存在で、ピルベートキナーゼの作
用へのカリウム及びナトリウムイオンの作用効果は、共
同性というよりも相加的になる。他のイオンの濃度が公
知であることを前提として、カリウム又はナトリウムイ
オンの濃度測定が可能となる。
petitor)として有効性が低いので、真の効果は、カリウ
ムイオンに対するピルベートキナーゼの相対的敏感度が
ナトリウムに比べて更に５０％増大することである。更
に、リチウムイオンの存在で、ピルベートキナーゼの作
用へのカリウム及びナトリウムイオンの作用効果は、共
同性というよりも相加的になる。他のイオンの濃度が公
知であることを前提として、カリウム又はナトリウムイ
オンの濃度測定が可能となる。
結合剤の不存在下での方法２及び３の使用により、ピル
ベートキナーゼのカリウムイオン対ナトリウムイオンの
相対的敏感度１００：１を得ることができる。このこと
は、極めて異常な１１０又は１７０ｍモル／のナトリ
ウムイオン濃度でも、測定されるカリウムイオン濃度の
誤差が正常血漿ナトリウムイオン濃度１４０ｍモル／
（例Ａ）に比べて0.3ｍモル／を越えないことを意味
する。これは、多くの臨床目的のために充分な正確性で
あるとは見なされない。しかしながら、血漿中のナトリ
ウムイオンの真の濃度が公知であるなら、±0.05ｍモル
／までの正確なカリウムイオンの測定は実施できる
（例Ｂ）。方法１〜３を一緒にし、結合剤例えばクリプ
トフイツクス ２２１包含する場合は、ナトリウムイオ
ンに対するカリウムイオンへのピルベートキナーゼの相
対的敏感度は＞５００：１まで高めることができる。こ
のような状況下では、0.05ｍモル／までの血漿カリウ
ムイオンを測定するために、ナトリウムイオン濃度を知
る必要はない（例Ｃ）。
ベートキナーゼのカリウムイオン対ナトリウムイオンの
相対的敏感度１００：１を得ることができる。このこと
は、極めて異常な１１０又は１７０ｍモル／のナトリ
ウムイオン濃度でも、測定されるカリウムイオン濃度の
誤差が正常血漿ナトリウムイオン濃度１４０ｍモル／
（例Ａ）に比べて0.3ｍモル／を越えないことを意味
する。これは、多くの臨床目的のために充分な正確性で
あるとは見なされない。しかしながら、血漿中のナトリ
ウムイオンの真の濃度が公知であるなら、±0.05ｍモル
／までの正確なカリウムイオンの測定は実施できる
（例Ｂ）。方法１〜３を一緒にし、結合剤例えばクリプ
トフイツクス ２２１包含する場合は、ナトリウムイオ
ンに対するカリウムイオンへのピルベートキナーゼの相
対的敏感度は＞５００：１まで高めることができる。こ
のような状況下では、0.05ｍモル／までの血漿カリウ
ムイオンを測定するために、ナトリウムイオン濃度を知
る必要はない（例Ｃ）。
カリウムイオン測定のためのこれら方法は、干渉の低減
を考慮して本発明に包含される一般的原理の適用性を示
している。他方、血清又は血漿中のナトリウムイオンの
測定は、有効な分析質濃度の調整へのこの原理の適用を
最良に説明している。本発明に包含されるようなナトリ
ウムイオン測定の１手段は、ナトリウムイオンに対して
敏感である活性を有する酵素を使用することである。こ
のような酵素の例は、β−ガラクトシダーゼである（ku
by等によるJ.Am.Chem.Soc.７５，８９０，１９５３）。
しかしながら、この酵素が最も敏感であるナトリウムイ
オン濃度の範囲は、通例血漿試料中で、稀釈工程なしに
得られるよりも低い。
を考慮して本発明に包含される一般的原理の適用性を示
している。他方、血清又は血漿中のナトリウムイオンの
測定は、有効な分析質濃度の調整へのこの原理の適用を
最良に説明している。本発明に包含されるようなナトリ
ウムイオン測定の１手段は、ナトリウムイオンに対して
敏感である活性を有する酵素を使用することである。こ
のような酵素の例は、β−ガラクトシダーゼである（ku
by等によるJ.Am.Chem.Soc.７５，８９０，１９５３）。
しかしながら、この酵素が最も敏感であるナトリウムイ
オン濃度の範囲は、通例血漿試料中で、稀釈工程なしに
得られるよりも低い。
試料の稀釈が不可能な場合に、本発明に包含される原理
を保持して、次の方法を有効なナトリウムイオン濃度を
最適レベルまで低めるために使用する。
を保持して、次の方法を有効なナトリウムイオン濃度を
最適レベルまで低めるために使用する。
１．ナトリウムイオン結合剤例えばクリプトフイツクス
２２１の使用 ２．β−ガラクトシダーゼの競争的阻害剤としてのリチ
ウムイオンの使用（この際、ナトリウムイオンに対する
この酵素の敏感度は低下）。
２２１の使用 ２．β−ガラクトシダーゼの競争的阻害剤としてのリチ
ウムイオンの使用（この際、ナトリウムイオンに対する
この酵素の敏感度は低下）。
方法１及び２の組み合せは、容易にβ−ガラクトシダー
ゼを用いる血漿又は血清中のナトリウムイオンの測定を
許容し、結合剤の量は、１１０ｍモル／を下まわるナ
トリウムイオン濃度に関する信号を最低にするために使
用することができ、他方通常の分析範囲（１１０〜１７
０ｍモル／）の信号を高める（例Ｄ）。
ゼを用いる血漿又は血清中のナトリウムイオンの測定を
許容し、結合剤の量は、１１０ｍモル／を下まわるナ
トリウムイオン濃度に関する信号を最低にするために使
用することができ、他方通常の分析範囲（１１０〜１７
０ｍモル／）の信号を高める（例Ｄ）。
カリウムイオンによる酵素活性の刺激が低下され、カリ
ウムイオン結合剤例えばクリプトフイクス ２２２が反
応混合物中に包含されるような条件を選択することを前
提として、ピルベートキナーゼを用いてナトリウムイオ
ンを測定することもできる（例Ｅ）。
ウムイオン結合剤例えばクリプトフイクス ２２２が反
応混合物中に包含されるような条件を選択することを前
提として、ピルベートキナーゼを用いてナトリウムイオ
ンを測定することもできる（例Ｅ）。
血漿ナトリウムイオン濃度を測定するもう１つの方法で
は、ナトリウムイオンをクリプトフイクス ２２１から
のカリウムイオンに換えることができ、放出されるカリ
ウムは、血漿ナトリウムイオン濃度に比例してピルベー
トキナーゼの活性を刺激する（例Ｆ）。
は、ナトリウムイオンをクリプトフイクス ２２１から
のカリウムイオンに換えることができ、放出されるカリ
ウムは、血漿ナトリウムイオン濃度に比例してピルベー
トキナーゼの活性を刺激する（例Ｆ）。
本発明の他の態様は、生物学的及び非生物学的液体中の
イオン測定用の組成物及び試薬である。
イオン測定用の組成物及び試薬である。
本発明による試薬は、溶解された形又は乾燥形で存在し
うる。これは、適当な担持材上に含浸されて存在しても
よい。試験片の形の診断剤は、担持材有利に濾紙、セル
ロース又は合成繊維フリースに、易揮発性浴剤例えばア
セトン中の試験片の製造に有利に使用するのに必要な溶
液で含浸することにより製造することができる。これ
は、１以上の含浸工程で行なうことができる。仕上げら
れた試験紙は、そのもの自体として又は公知方法で把手
に押込んで又は合成樹脂と微細メツシユとの間でシール
して使用することができる。
うる。これは、適当な担持材上に含浸されて存在しても
よい。試験片の形の診断剤は、担持材有利に濾紙、セル
ロース又は合成繊維フリースに、易揮発性浴剤例えばア
セトン中の試験片の製造に有利に使用するのに必要な溶
液で含浸することにより製造することができる。これ
は、１以上の含浸工程で行なうことができる。仕上げら
れた試験紙は、そのもの自体として又は公知方法で把手
に押込んで又は合成樹脂と微細メツシユとの間でシール
して使用することができる。
次に、本発明の実施態様を詳細に記載するが、本発明
は、記載の詳細の１つ又は組合せに限定されるものでは
なく、特にこれら態様に記載のほかにも機械的又は化学
的変更法を使用することができる。
は、記載の詳細の１つ又は組合せに限定されるものでは
なく、特にこれら態様に記載のほかにも機械的又は化学
的変更法を使用することができる。
カリウムイオンの分析法の詳細な記載 ここでは、本発明に記載の原理を包含するカリウムイオ
ン測定法をより詳細に記載する。カリウムイオンの測定
のために、液体例えば血漿をアデノシン二燐酸(ADP)、
ホスホエノールピルベート(PEP)、還元ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド(NADH)、ピルベートキナーゼ(P
K)及びラクテートデヒドロゲナーゼ(LDH)を含有する緩
衝された混合物と共に恒温保持する。反応時にこの混合
物中のＰＫ及びＬＤＨにより触媒作用をうけるピルビベ
ート及び引続くラクテートの形成は、まつたく、適当な
カチオンの存在に依存し、その不在時には、ＰＫはまつ
たく不活性である。ＮＡＤＨは、３４０ｎｍで強く吸収
し、ＮＡＤは吸収しない。
ン測定法をより詳細に記載する。カリウムイオンの測定
のために、液体例えば血漿をアデノシン二燐酸(ADP)、
ホスホエノールピルベート(PEP)、還元ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド(NADH)、ピルベートキナーゼ(P
K)及びラクテートデヒドロゲナーゼ(LDH)を含有する緩
衝された混合物と共に恒温保持する。反応時にこの混合
物中のＰＫ及びＬＤＨにより触媒作用をうけるピルビベ
ート及び引続くラクテートの形成は、まつたく、適当な
カチオンの存在に依存し、その不在時には、ＰＫはまつ
たく不活性である。ＮＡＤＨは、３４０ｎｍで強く吸収
し、ＮＡＤは吸収しない。
細菌ＰＫにより要求されるマンガンイオンの存在を包含
する分析のために選ばれた条件下で、ＮＡＤＨ酸化の速
度は、カリウムイオンの濃度に比例する（例Ａ〜Ｃ参
照）。
する分析のために選ばれた条件下で、ＮＡＤＨ酸化の速
度は、カリウムイオンの濃度に比例する（例Ａ〜Ｃ参
照）。
このような条件下では次の反応が起る： 反応（１）の速度は、系中のカリウムイオン濃度により
測定され、これは反応（２）の速度も制限する。これら
の反応の速度を測定することのできる方法はいくつもあ
る。標準的な方法は、反応（２）におけるＮＡＤＨの消
失速度の分光光度測定である。ＮＡＤＨは３４０ｎｍで
強く吸収し、ＮＡＤは吸収しない。従つて、３４０ｎｍ
（又は代りの波長）での反応混合物の吸収の低落は、反
応の速度の直接測定を提供し、これから混合物中に存在
するカリウムイオンの濃度を引き出すことができる。双
方の反応（１）及び（２）はＨ＋を消費し、従つて、反
応混合物のプロトン濃度を低下する事実も採用できる。
プロトン濃度の低下速度はpHメーターを用いて又は、滴
定法を用いて測定することができる。後者の場合に、使
用緩衝液の濃度は、分光光度法におけるよりも低い。他
の装置例えば蛍光光度計又は発光光度計も、ピルベート
キナーゼの活性を検査するために使用することができ
る。
測定され、これは反応（２）の速度も制限する。これら
の反応の速度を測定することのできる方法はいくつもあ
る。標準的な方法は、反応（２）におけるＮＡＤＨの消
失速度の分光光度測定である。ＮＡＤＨは３４０ｎｍで
強く吸収し、ＮＡＤは吸収しない。従つて、３４０ｎｍ
（又は代りの波長）での反応混合物の吸収の低落は、反
応の速度の直接測定を提供し、これから混合物中に存在
するカリウムイオンの濃度を引き出すことができる。双
方の反応（１）及び（２）はＨ＋を消費し、従つて、反
応混合物のプロトン濃度を低下する事実も採用できる。
プロトン濃度の低下速度はpHメーターを用いて又は、滴
定法を用いて測定することができる。後者の場合に、使
用緩衝液の濃度は、分光光度法におけるよりも低い。他
の装置例えば蛍光光度計又は発光光度計も、ピルベート
キナーゼの活性を検査するために使用することができ
る。
ＰＫ活性と関連しているピルベートの蓄積を測定する他
の多くの方法が存在する。これには、無機燐酸塩又は消
費された酸素又は過酸化水素；燐酸アセチル又はピルベ
ートオキシダーゼの酵素作用により発生する二酸化炭素
を測定する方法、２，４−ジニトロフエニルヒドラジン
でのヒドラゾンの形成；ピルベートカルボキシラーゼ、
ピルベートデカルボキシラーゼ又はピルベートデヒドロ
ゲナーゼの酵素作用の反応成分又は生成物の測定、フラ
ビン結合系の使用及び基質の微小な濃度を測定するため
のアイソトープ的方法〔M.N.Berry等によるAnalytical
Biochem.１１８，３４４〜３５２（１９８１）〕が包含
される。
の多くの方法が存在する。これには、無機燐酸塩又は消
費された酸素又は過酸化水素；燐酸アセチル又はピルベ
ートオキシダーゼの酵素作用により発生する二酸化炭素
を測定する方法、２，４−ジニトロフエニルヒドラジン
でのヒドラゾンの形成；ピルベートカルボキシラーゼ、
ピルベートデカルボキシラーゼ又はピルベートデヒドロ
ゲナーゼの酵素作用の反応成分又は生成物の測定、フラ
ビン結合系の使用及び基質の微小な濃度を測定するため
のアイソトープ的方法〔M.N.Berry等によるAnalytical
Biochem.１１８，３４４〜３５２（１９８１）〕が包含
される。
他の方法例えば炎光光度測定又はイオン選択性電極測定
法を用いても、血清試料２００の検査で良好な一致が得
られた。この方法での重大な干渉は、血清中に一般に存
在するか又は放置時に蓄積するアンモニウムイオンであ
る。アンモニウムイオン干渉の可能性は、反応混合物中
のα−ケトグルタレート(KG)及びグルタメートデヒドロ
ゲナーゼ(GDH)の包含により完全にさけることができ
る。アンモニウムイオンは、前インキユベーシヨン(pre
incubation)で、次の反応式により除かれる： NH4 ++KG+NADH→グルタメート＋NAD+ 溶液中、例えばアンモニウムイオン含分が高い尿中で
は、連結された反応を使用することができる： NH4 ++KG+NADP→グルタメート＋NADP グルコース−６−Ｐ＋ＮＡＤＰ→６−ホスホグルコネー
ト＋ＮＡＤＰＨ この連結された方法は、グルコース−６−ホスフエート
デヒドロゲナーゼを使用する。添加されたグルコース−
６−Ｐ及び−ＫＧを、任意のアンモニウムイオンの過剰
の中に存在させると、すべてのアンモニウムイオンは除
かれ、他方試薬中にＮＡＤＨを保持する。
法を用いても、血清試料２００の検査で良好な一致が得
られた。この方法での重大な干渉は、血清中に一般に存
在するか又は放置時に蓄積するアンモニウムイオンであ
る。アンモニウムイオン干渉の可能性は、反応混合物中
のα−ケトグルタレート(KG)及びグルタメートデヒドロ
ゲナーゼ(GDH)の包含により完全にさけることができ
る。アンモニウムイオンは、前インキユベーシヨン(pre
incubation)で、次の反応式により除かれる： NH4 ++KG+NADH→グルタメート＋NAD+ 溶液中、例えばアンモニウムイオン含分が高い尿中で
は、連結された反応を使用することができる： NH4 ++KG+NADP→グルタメート＋NADP グルコース−６−Ｐ＋ＮＡＤＰ→６−ホスホグルコネー
ト＋ＮＡＤＰＨ この連結された方法は、グルコース−６−ホスフエート
デヒドロゲナーゼを使用する。添加されたグルコース−
６−Ｐ及び−ＫＧを、任意のアンモニウムイオンの過剰
の中に存在させると、すべてのアンモニウムイオンは除
かれ、他方試薬中にＮＡＤＨを保持する。
血漿又は血清試料１０μを用いて、３７℃でカリウム
イオンを酵素的に測定する主試薬の典型的濃度範囲は、
次のとおりである： ＰＫ（Ｂ．ステアロテルモフイルス） ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜３０ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.01ｍモル／〜0.8ｍモル／ 緩衝剤pH７〜８ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ Ｍｎ２＋又はＭｇ２＋ １ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬｉＣ ２ｍモル／〜１００ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 0.5ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で検定）５０００Ｕ／〜１０００００
Ｕ／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定）２５００Ｕ／〜２００００Ｕ
／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ カリウムイオンに対して敏感な他の例は、グリセロール
デヒドロゲナーゼ（E.C.C.Lin等によるＢ．２３５、１
８２０、１９６０）である。グリセロールデヒドロゲナ
ーゼを用いる３７℃でのカリウムイオンの酵素的測定の
ための主試薬の典型的濃度範囲は次のとおりである： グリセロールデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／〜１０００
Ｕ／ グリセロール 0.3モル／〜３モル／ クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜３０ｍモル
／ ＮＡＤ 0.1ｍモル／〜5.0ｍモル／ 緩衝剤、pH９ ２０ｍモル／〜５００ｍモル／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ カリウムイオンに対して敏感な他の酵素はアセトアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼである（S.Black,Arch.Biochem.B
iophys.３４，８６，１９５１）。アセトアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼを用いて３７℃でカリウムイオンを酵素
的に測定するための主試薬の典型的な濃度範囲は次のと
おりである： アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ グリコールアルデヒド 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／
クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜３０ｍモル
／ ＮＡＤ 0.05ｍモル／〜2.0ｍモル／ 緩衝剤、pH７〜８ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ ジチオスレイトール 0.1ｍモル／〜２ｍモル／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ アセトアルデヒド（0.02ｍモル／〜１ｍモル／）を
グリコールアルデヒドに換えることもできる。
イオンを酵素的に測定する主試薬の典型的濃度範囲は、
次のとおりである： ＰＫ（Ｂ．ステアロテルモフイルス） ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜３０ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.01ｍモル／〜0.8ｍモル／ 緩衝剤pH７〜８ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ Ｍｎ２＋又はＭｇ２＋ １ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬｉＣ ２ｍモル／〜１００ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 0.5ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で検定）５０００Ｕ／〜１０００００
Ｕ／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定）２５００Ｕ／〜２００００Ｕ
／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ カリウムイオンに対して敏感な他の例は、グリセロール
デヒドロゲナーゼ（E.C.C.Lin等によるＢ．２３５、１
８２０、１９６０）である。グリセロールデヒドロゲナ
ーゼを用いる３７℃でのカリウムイオンの酵素的測定の
ための主試薬の典型的濃度範囲は次のとおりである： グリセロールデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／〜１０００
Ｕ／ グリセロール 0.3モル／〜３モル／ クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜３０ｍモル
／ ＮＡＤ 0.1ｍモル／〜5.0ｍモル／ 緩衝剤、pH９ ２０ｍモル／〜５００ｍモル／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ カリウムイオンに対して敏感な他の酵素はアセトアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼである（S.Black,Arch.Biochem.B
iophys.３４，８６，１９５１）。アセトアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼを用いて３７℃でカリウムイオンを酵素
的に測定するための主試薬の典型的な濃度範囲は次のと
おりである： アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ グリコールアルデヒド 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／
クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜３０ｍモル
／ ＮＡＤ 0.05ｍモル／〜2.0ｍモル／ 緩衝剤、pH７〜８ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ ジチオスレイトール 0.1ｍモル／〜２ｍモル／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ アセトアルデヒド（0.02ｍモル／〜１ｍモル／）を
グリコールアルデヒドに換えることもできる。
アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、エステラーゼ活
性をも示し、従つてカリウムイオン濃度は、酢酸４−ニ
トロフエニルからの４−ニトロフエノールの放出をモニ
ターすることにより測定できる。アセトアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼのエステラーゼ活性に基づく３７℃でのカ
リウムイオンの酵素的測定のための主試薬の典型的濃度
範囲は次のとおりである： アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ ４−ニトロフエニルアセテート 0.1ｍモル／〜２ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜３
０ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.001ｍモル／〜0.1ｍモル／ 緩衝剤、pH７〜８ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ ナトリウムイオンの測定（参考） 原理的に、ＰＫを用いるナトリウムイオンの測定は、カ
リウムイオンのそれと同じであるが、特定の重要な差異
が存在する。第１に、ＰＫは、前記のようなインキユベ
ーシヨン条件に応じて、ナトリウムイオンに対するより
もカリウムイオンに対して４０〜１００倍も敏感であ
る。ナトリウムイオンは、血漿中でカリウムイオンの濃
度の約３０倍の濃度で生じるが、後者は、ナトリウムイ
オン測定と干渉することができる。
性をも示し、従つてカリウムイオン濃度は、酢酸４−ニ
トロフエニルからの４−ニトロフエノールの放出をモニ
ターすることにより測定できる。アセトアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼのエステラーゼ活性に基づく３７℃でのカ
リウムイオンの酵素的測定のための主試薬の典型的濃度
範囲は次のとおりである： アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ ４−ニトロフエニルアセテート 0.1ｍモル／〜２ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜３
０ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.001ｍモル／〜0.1ｍモル／ 緩衝剤、pH７〜８ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ ナトリウムイオンの測定（参考） 原理的に、ＰＫを用いるナトリウムイオンの測定は、カ
リウムイオンのそれと同じであるが、特定の重要な差異
が存在する。第１に、ＰＫは、前記のようなインキユベ
ーシヨン条件に応じて、ナトリウムイオンに対するより
もカリウムイオンに対して４０〜１００倍も敏感であ
る。ナトリウムイオンは、血漿中でカリウムイオンの濃
度の約３０倍の濃度で生じるが、後者は、ナトリウムイ
オン測定と干渉することができる。
本発明で採用されている一般的な原理によれば、リチウ
ムイオンは無視され、ウサギ筋肉からのＰＫが細菌酵素
よりも優れており、マグネシウムイオンは、マンガンの
代りになりうる。１方法では、カリウムイオンを殊にク
リプトフイクス ２２２と結合させＰＫ活性上へのナト
リウムイオンの効果を直接測定する（例Ｅ）。
ムイオンは無視され、ウサギ筋肉からのＰＫが細菌酵素
よりも優れており、マグネシウムイオンは、マンガンの
代りになりうる。１方法では、カリウムイオンを殊にク
リプトフイクス ２２２と結合させＰＫ活性上へのナト
リウムイオンの効果を直接測定する（例Ｅ）。
ピルベートキナーゼを用いる３７℃でのナトリウムイオ
ンの酵素的測定のための主試薬の典型的な濃度範囲は次
のとおりである： ＰＫ（ウサギ筋肉） ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／ クリプトフイクス ２２２ ０．４ｍモル／〜４ｍモ
ル／ ＮＡＤＨ 0.01ｍモル／〜0.8ｍモル／ 緩衝剤、pH７〜９ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ Ｍｇ２＋ １ｍモル／〜１０ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 0.5ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で検定） ５０００Ｕ／〜１００００
０Ｕ／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ もう１つの方法では、ナトリウムイオンはクリプトフイ
クス ２２１からのカリウムイオンで換えられ、放出カ
リウムイオンは、ＰＫの活性を、ナトリウムイオン濃度
に依存する程度に刺激する（例Ｆ）。
ンの酵素的測定のための主試薬の典型的な濃度範囲は次
のとおりである： ＰＫ（ウサギ筋肉） ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／ クリプトフイクス ２２２ ０．４ｍモル／〜４ｍモ
ル／ ＮＡＤＨ 0.01ｍモル／〜0.8ｍモル／ 緩衝剤、pH７〜９ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ Ｍｇ２＋ １ｍモル／〜１０ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 0.5ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で検定） ５０００Ｕ／〜１００００
０Ｕ／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ もう１つの方法では、ナトリウムイオンはクリプトフイ
クス ２２１からのカリウムイオンで換えられ、放出カ
リウムイオンは、ＰＫの活性を、ナトリウムイオン濃度
に依存する程度に刺激する（例Ｆ）。
クリプトフイクス ２２１からのカリウムイオンの交換
を測定するための、ピルベートキナーゼを用いる３７℃
でのナトリウムイオンの酵素的測定のための主試薬の典
型的な濃度範囲は次のとおりである： ＰＫ（ウサギ筋肉） ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ １ｍモル／〜１０ｍモル
／ ＮＡＤＨ 0.01ｍモル／〜0.8ｍモル／ 緩衝剤、pH９〜１０ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／
Ｍｇ２＋ １ｍモル／〜１０ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 0.5ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で測定） ５０００Ｕ／〜１００００
０Ｕ／ ＫＣ ２ｍモル／〜１０ｍモル／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ 測定のためのさらに正確で精密な態様は、ナトリウムイ
オン依存性酵素例えばβ−ガラクトシダーゼの使用であ
る（例Ｄ）。
を測定するための、ピルベートキナーゼを用いる３７℃
でのナトリウムイオンの酵素的測定のための主試薬の典
型的な濃度範囲は次のとおりである： ＰＫ（ウサギ筋肉） ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ １ｍモル／〜１０ｍモル
／ ＮＡＤＨ 0.01ｍモル／〜0.8ｍモル／ 緩衝剤、pH９〜１０ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／
Ｍｇ２＋ １ｍモル／〜１０ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 0.5ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で測定） ５０００Ｕ／〜１００００
０Ｕ／ ＫＣ ２ｍモル／〜１０ｍモル／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ 測定のためのさらに正確で精密な態様は、ナトリウムイ
オン依存性酵素例えばβ−ガラクトシダーゼの使用であ
る（例Ｄ）。
血漿を、２−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド(NPG)と酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含有する
緩衝混合物と共にインキユベートする。β−Ｄ−ガラク
トシダーゼによつて触媒作用を受ける反応は、ナトリウ
ムイオンの存在に依存し、活性率は、ナトリウムイオン
濃度の尺度である。この方法の主要特徴は、ナトリウム
イオン濃度が１００ｍモル／を越える血清または他の
生物学的液体中の測定のために、ナトリウムイオン濃度
を減少させ、酵素は通常の分析範囲（１１０〜１７０ｍ
モル／）にあるナトリウムイオン濃度での小さい変化
に対して最も敏感になるように適当量のナトリウムイオ
ン選択性結合剤（例えばクリプトフイクス ２２１）を
使用することである。適度に高い濃度のマグネシウムお
よびリチウムイオンの存在を包含する分析のために選択
された条件下で、２−ニトロフエノールおよびガラクト
ースの形成率は、実質的に測定されるナトリウムイオン
の濃度に比例する。最適β−ガラクトシダーゼ活性を得
るためにマグネシウムイオンが要求される。リチウムイ
オンは、ナトリウムイオンと競争的であり、それゆえに
ナトリウムイオンに関する酵素のＫｍを高める。
シド(NPG)と酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼを含有する
緩衝混合物と共にインキユベートする。β−Ｄ−ガラク
トシダーゼによつて触媒作用を受ける反応は、ナトリウ
ムイオンの存在に依存し、活性率は、ナトリウムイオン
濃度の尺度である。この方法の主要特徴は、ナトリウム
イオン濃度が１００ｍモル／を越える血清または他の
生物学的液体中の測定のために、ナトリウムイオン濃度
を減少させ、酵素は通常の分析範囲（１１０〜１７０ｍ
モル／）にあるナトリウムイオン濃度での小さい変化
に対して最も敏感になるように適当量のナトリウムイオ
ン選択性結合剤（例えばクリプトフイクス ２２１）を
使用することである。適度に高い濃度のマグネシウムお
よびリチウムイオンの存在を包含する分析のために選択
された条件下で、２−ニトロフエノールおよびガラクト
ースの形成率は、実質的に測定されるナトリウムイオン
の濃度に比例する。最適β−ガラクトシダーゼ活性を得
るためにマグネシウムイオンが要求される。リチウムイ
オンは、ナトリウムイオンと競争的であり、それゆえに
ナトリウムイオンに関する酵素のＫｍを高める。
β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対する基質としては、多く
の他の化合物が好適である。全く一般には、ガラクトシ
ダーゼ含有試料を適当なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質
と混合し、この基質を酵素によつて切断し、次いで分裂
生成物のひとつを適当な方法で検出する。酵素の作用に
より遊離されたグリコンまたはアグリコンは測定可能で
ある。大抵、後者を測定する。基質として、天然の基質
ラクトースを使用できるが、色原性ガラクトシドの使用
が特に有利である。このように、Biochem．２．，３３
３，２０９（１９６０）にはフエニル−β−Ｄ−ガラク
トシド、同様に、芳香環上で置換されたさらに別の誘導
体、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としての２
−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＮＰＧ）お
よび３−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシドが記載
されている。加水分解によつて遊離されるフエノール
を、ＵＶ範囲で、またはニトロフエノールの場合には短
波可視波長範囲で測光法で測定する。アミノアンチピリ
ンとの酸化的結合も、指示反応として続けることができ
る （Analytical Biochem.４０，２８１（１９７１）参
照）。他の基質は、西ドイツ特許出願公開第３３４５７
５８号明細書及び同第３４１１５７４号明細書に記載さ
れている。
の他の化合物が好適である。全く一般には、ガラクトシ
ダーゼ含有試料を適当なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質
と混合し、この基質を酵素によつて切断し、次いで分裂
生成物のひとつを適当な方法で検出する。酵素の作用に
より遊離されたグリコンまたはアグリコンは測定可能で
ある。大抵、後者を測定する。基質として、天然の基質
ラクトースを使用できるが、色原性ガラクトシドの使用
が特に有利である。このように、Biochem．２．，３３
３，２０９（１９６０）にはフエニル−β−Ｄ−ガラク
トシド、同様に、芳香環上で置換されたさらに別の誘導
体、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としての２
−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＮＰＧ）お
よび３−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシドが記載
されている。加水分解によつて遊離されるフエノール
を、ＵＶ範囲で、またはニトロフエノールの場合には短
波可視波長範囲で測光法で測定する。アミノアンチピリ
ンとの酸化的結合も、指示反応として続けることができ
る （Analytical Biochem.４０，２８１（１９７１）参
照）。他の基質は、西ドイツ特許出願公開第３３４５７
５８号明細書及び同第３４１１５７４号明細書に記載さ
れている。
血漿または血清の試料１０μを使用し、３７℃におけ
るナトリウムイオンを酵素的に測定するための主試薬の
典型的な濃度範囲は次のとおりである： β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ２５Ｕ／〜７５００Ｕ／
ＮＰＧ 0.25ｍモル／〜５ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜１０ｍモル
／ 緩衝剤、pH７〜9.5 ２００ｍモル／〜５００ｍモ
ル／ Ｍｇ２＋ 0.01ｍモル／〜１０ｍモル／ ＥＧＴＡ（リチウム塩） ０ｍモル／〜２０ｍモル／
血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＥＧＴＡは、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）
−四酢酸を意味する。従つて、ナトリウムとカリウムイ
オンの分析を、酵素的に同じキユベツト中で対試験(twi
n test)の形で実施することも可能である（例Ｇ参
照）。
るナトリウムイオンを酵素的に測定するための主試薬の
典型的な濃度範囲は次のとおりである： β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ２５Ｕ／〜７５００Ｕ／
ＮＰＧ 0.25ｍモル／〜５ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ ０ｍモル／〜１０ｍモル
／ 緩衝剤、pH７〜9.5 ２００ｍモル／〜５００ｍモ
ル／ Ｍｇ２＋ 0.01ｍモル／〜１０ｍモル／ ＥＧＴＡ（リチウム塩） ０ｍモル／〜２０ｍモル／
血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＥＧＴＡは、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）
−四酢酸を意味する。従つて、ナトリウムとカリウムイ
オンの分析を、酵素的に同じキユベツト中で対試験(twi
n test)の形で実施することも可能である（例Ｇ参
照）。
カルシウムイオンの測定（参考） カルシウムイオンの測定のために、血漿試料（または他
の体液）を、ペプチド基質スクシニル−ロイシン−メチ
オニン−ｐ−ニトロアニリドおよび酵素カルパインＩを
含有する緩衝混合物と共にインキユベートする。カルパ
インＩによつて触媒作用を受ける反応は、カルシウムイ
オンの存在に左右され、活性度は、カルシウムイオン濃
度の尺度である。この方法の主要特徴は、カルシウムイ
オンの濃度を酵素が最も敏感である範囲まで低下させる
ために特異的にカルシウムイオンと結合することのでき
るキレート化剤の使用である。Ｌ−システインと２−メ
ルカプトエタノールの存在を包含する分析のために選択
された条件下で、ｐ−ニトロアニリン形成率は、実質的
に測定されるカルシウムの濃度に比例する。
の体液）を、ペプチド基質スクシニル−ロイシン−メチ
オニン−ｐ−ニトロアニリドおよび酵素カルパインＩを
含有する緩衝混合物と共にインキユベートする。カルパ
インＩによつて触媒作用を受ける反応は、カルシウムイ
オンの存在に左右され、活性度は、カルシウムイオン濃
度の尺度である。この方法の主要特徴は、カルシウムイ
オンの濃度を酵素が最も敏感である範囲まで低下させる
ために特異的にカルシウムイオンと結合することのでき
るキレート化剤の使用である。Ｌ−システインと２−メ
ルカプトエタノールの存在を包含する分析のために選択
された条件下で、ｐ−ニトロアニリン形成率は、実質的
に測定されるカルシウムの濃度に比例する。
有利なペプチド基質は、一般式： Ｒ−Ｐｎ−Ｐ２−Ｐ１−Ｘ 〔式中、Ｒはアセチル、ベンゾイル、カルボベンゾキ
シ、スクシニル、ｔ−ブトキシカルボニルまたは３−
（２−フリル）アクリロイルを表わし、Ｐｎ−Ｐ２−Ｐ
１は有利にはＰ１位のＴｙｒ、Ｍｅｔ、ＬｙｓまたはＡ
ｒｇおよびＰ２位のＬｅｕまたはＶａｌ残基を有する少
なくとも２個の残基のペプチド鎖を表わし、Ｘは酵素の
作用で遊離されて、色及び蛍光の検出可能な変化を生じ
る色原性または蛍光原性の基を表わす〕によつて記載で
きる。Ｘはニトロフエニル、ナフチルまたはチオベンジ
ルエステル、同様に芳香族環上にさらに置換基を有する
かまたは有さないニトロアニリン、ナフチルアミンまた
はメチルクマリン基であつてよい。数種の好適なペプチ
ド誘導体は、Ｔ．ササキ(T.Sasaki)等によつて、Ｊ．Bi
ol.Chem.第２５９巻、１２４８９−１２４９４頁に記載
されており、その例はスクシニル−Leu-Met-MCA(MCA＝
４−メチルクマリン−７−アミド）、スクシニル−Leu-
Tyr-MCA、スクシニル−Leu-Leu-Val-Try-MCAおよびｔ−
ブトキシカルボニル−Val-Leu-Lys-MCAである。さらに
合成基質は、ベルグマイヤーHU(Ed)メソード・オブ・エ
ンザイマテイツク・アナリシス(Bergmeyer HU(Ed)Metho
ds of Enzymatic Analysis)第３版、第５巻、８４〜８
５頁（１９８４）に記載されている。
シ、スクシニル、ｔ−ブトキシカルボニルまたは３−
（２−フリル）アクリロイルを表わし、Ｐｎ−Ｐ２−Ｐ
１は有利にはＰ１位のＴｙｒ、Ｍｅｔ、ＬｙｓまたはＡ
ｒｇおよびＰ２位のＬｅｕまたはＶａｌ残基を有する少
なくとも２個の残基のペプチド鎖を表わし、Ｘは酵素の
作用で遊離されて、色及び蛍光の検出可能な変化を生じ
る色原性または蛍光原性の基を表わす〕によつて記載で
きる。Ｘはニトロフエニル、ナフチルまたはチオベンジ
ルエステル、同様に芳香族環上にさらに置換基を有する
かまたは有さないニトロアニリン、ナフチルアミンまた
はメチルクマリン基であつてよい。数種の好適なペプチ
ド誘導体は、Ｔ．ササキ(T.Sasaki)等によつて、Ｊ．Bi
ol.Chem.第２５９巻、１２４８９−１２４９４頁に記載
されており、その例はスクシニル−Leu-Met-MCA(MCA＝
４−メチルクマリン−７−アミド）、スクシニル−Leu-
Tyr-MCA、スクシニル−Leu-Leu-Val-Try-MCAおよびｔ−
ブトキシカルボニル−Val-Leu-Lys-MCAである。さらに
合成基質は、ベルグマイヤーHU(Ed)メソード・オブ・エ
ンザイマテイツク・アナリシス(Bergmeyer HU(Ed)Metho
ds of Enzymatic Analysis)第３版、第５巻、８４〜８
５頁（１９８４）に記載されている。
このような測定法および試薬のための化合物の濃度範囲
は次のとおりである： カルパインＩ １０００Ｕ／〜４０００Ｕ／＊ Suc-Leu-Met-p-ニトロアニリド １ｍモル／〜２０ｍモル／ キレート化剤 0.01ｍモル／〜１ｍモル／ Ｌ−システイン １ｍモル／〜１０ｍモル／ ２−メルカプトエタノール １ｍモル／〜１０ｍモル
／ 緩衝剤イミダゾール−ＨＣ１０ｍモル／〜１００ｍ
モル／ pH ６〜８（有利な範囲７〜7.5） 星印＊は、この単位が基質としてのカゼインと共に３０
℃で３０分間インキユベートした後、７５０ｎｍでの吸
光度を1.0だけ上昇させる酵素量として定義されている
ことを意味する（Ｎ．Yoshimura etal.,J.Biol.Chem.２
５８〜，８８８３〜８８８９，（１９８３）参照）。
は次のとおりである： カルパインＩ １０００Ｕ／〜４０００Ｕ／＊ Suc-Leu-Met-p-ニトロアニリド １ｍモル／〜２０ｍモル／ キレート化剤 0.01ｍモル／〜１ｍモル／ Ｌ−システイン １ｍモル／〜１０ｍモル／ ２−メルカプトエタノール １ｍモル／〜１０ｍモル
／ 緩衝剤イミダゾール−ＨＣ１０ｍモル／〜１００ｍ
モル／ pH ６〜８（有利な範囲７〜7.5） 星印＊は、この単位が基質としてのカゼインと共に３０
℃で３０分間インキユベートした後、７５０ｎｍでの吸
光度を1.0だけ上昇させる酵素量として定義されている
ことを意味する（Ｎ．Yoshimura etal.,J.Biol.Chem.２
５８〜，８８８３〜８８８９，（１９８３）参照）。
カルシウムに対する無視しうる結合能力を有する、要求
されるpH範囲にpkを有する数種の緩衝剤を検定に用いる
ことができる。多くのグツド−タイプ緩衝液（Ｎ．Ｅ．
Good etal.,Biochem.５，４６７〜４７７（１９６
６））例えばトリス(Tris)、ヘペス(HEPES)、モプソ(MO
PSO)、ベス(BES)、テス(TES)およびイミダゾールがこれ
らの要求を満たす（例Ｈ参照）。カルパインＩの代わり
にコラーゲナーゼを使用することができ、pH6.5〜7.5で
Ｌ−イソロイシル−Ｌ−アナリルグリシルエチルエステ
ル0.02ｍモル／〜0.2ｍモル／を用いて蛍光度測定
で検定することができる。
されるpH範囲にpkを有する数種の緩衝剤を検定に用いる
ことができる。多くのグツド−タイプ緩衝液（Ｎ．Ｅ．
Good etal.,Biochem.５，４６７〜４７７（１９６
６））例えばトリス(Tris)、ヘペス(HEPES)、モプソ(MO
PSO)、ベス(BES)、テス(TES)およびイミダゾールがこれ
らの要求を満たす（例Ｈ参照）。カルパインＩの代わり
にコラーゲナーゼを使用することができ、pH6.5〜7.5で
Ｌ−イソロイシル−Ｌ−アナリルグリシルエチルエステ
ル0.02ｍモル／〜0.2ｍモル／を用いて蛍光度測定
で検定することができる。
クロリドイオンの測定（参考） 血中のクロリドを測定するために、血漿をシステアミン
0.01モル／、Gly-Phe−ニトロアニリド４ｍモル／
およびカテプシンＣ0.02Ｕ／ｍを含有する緩衝混合物
と共にインキユベートする。ｐ−ニトロアニリンの形成
は、完全にクロリドアニオンの存在に依存する。さら
に、ブロミドイオンによる干渉を除去するために、また
は酵素の最適範囲にクロリドイオンの濃度を合わせるよ
うにクロリドイオンの活性を低下させるために、選択的
結合剤を添加することができる。分析のために選択され
た条件下（例５参照）で、ｐ−ニトロアニリンの形成
率： は、試料中のクロリドイオンの濃度に比例する。この例
では、反応率を４０５ｎｍにおける吸光度の増加の測定
によつて測定する。
0.01モル／、Gly-Phe−ニトロアニリド４ｍモル／
およびカテプシンＣ0.02Ｕ／ｍを含有する緩衝混合物
と共にインキユベートする。ｐ−ニトロアニリンの形成
は、完全にクロリドアニオンの存在に依存する。さら
に、ブロミドイオンによる干渉を除去するために、また
は酵素の最適範囲にクロリドイオンの濃度を合わせるよ
うにクロリドイオンの活性を低下させるために、選択的
結合剤を添加することができる。分析のために選択され
た条件下（例５参照）で、ｐ−ニトロアニリンの形成
率： は、試料中のクロリドイオンの濃度に比例する。この例
では、反応率を４０５ｎｍにおける吸光度の増加の測定
によつて測定する。
このような測定法の化合物の濃度範囲は次のとおりであ
る： クエン酸緩衝剤 0.01〜0.2モル／ pH ４〜７（有利に5.0〜5.5） システアミン １〜２０ｍモル／ Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド １〜２０ｍモル
／ カテプシンＣ ２〜１００ｍＵ／ｍ 所望pH−範囲内にｐｋを有し、無視しうるクロリド濃度
を有する任意の緩衝剤をこの検定に使用することができ
る。前記記載の全カテゴリーからの酵素の例（トランス
フエラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼおよ
びリアーゼ）は、特にこれらの酵素源が好塩性生物から
である場合、クロリド依存性を有することが文献中に示
されている。ペプチドタイプの酵素のクロリド依存性
は、広く記載されている。例えばジペプチジルペプチダ
ーゼＩ（カテプシンＣ）、ＥＣ３．４．１４．１（Ｊ．
Ken Mc Donald,Bioch.Bioph.Res.Communication,２４
（５）１９６６，７７１ｆ）またはジペプチジルペプチ
ダーゼIIIＥＣ．３．４．１４．３（Ｊ．Ken Mc Donal
d,Journal of Biol.Chem.２４１（７）１９６６，１４
９４ｆ）は、双方とも、アミノ末端位からのオリゴペプ
チド誘導体の加水分解に触媒作用をする。もう一つの例
は、アンギオテンシンを変換させる酵素ＥＣ３．４．１
５．１であり、これは広範囲のオリゴペプチドのカルボ
キシル末端からジペプチドの加水分解的放出に触媒作用
をする（Ｐ．Bunning et al.,Bioch.26,1987,3374f； Ｒ．Shapiro et al.,Bioch.２２，１９８３，３８５０
ｆ）。
る： クエン酸緩衝剤 0.01〜0.2モル／ pH ４〜７（有利に5.0〜5.5） システアミン １〜２０ｍモル／ Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド １〜２０ｍモル
／ カテプシンＣ ２〜１００ｍＵ／ｍ 所望pH−範囲内にｐｋを有し、無視しうるクロリド濃度
を有する任意の緩衝剤をこの検定に使用することができ
る。前記記載の全カテゴリーからの酵素の例（トランス
フエラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼおよ
びリアーゼ）は、特にこれらの酵素源が好塩性生物から
である場合、クロリド依存性を有することが文献中に示
されている。ペプチドタイプの酵素のクロリド依存性
は、広く記載されている。例えばジペプチジルペプチダ
ーゼＩ（カテプシンＣ）、ＥＣ３．４．１４．１（Ｊ．
Ken Mc Donald,Bioch.Bioph.Res.Communication,２４
（５）１９６６，７７１ｆ）またはジペプチジルペプチ
ダーゼIIIＥＣ．３．４．１４．３（Ｊ．Ken Mc Donal
d,Journal of Biol.Chem.２４１（７）１９６６，１４
９４ｆ）は、双方とも、アミノ末端位からのオリゴペプ
チド誘導体の加水分解に触媒作用をする。もう一つの例
は、アンギオテンシンを変換させる酵素ＥＣ３．４．１
５．１であり、これは広範囲のオリゴペプチドのカルボ
キシル末端からジペプチドの加水分解的放出に触媒作用
をする（Ｐ．Bunning et al.,Bioch.26,1987,3374f； Ｒ．Shapiro et al.,Bioch.２２，１９８３，３８５０
ｆ）。
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドの代わりに、異な
る他のジペプチド−またはオリゴペプチド基質を使用す
ることができる。有利なペプチド基質は、一般式： Ｒ−Ｐｎ−Ｐ１−Ｘ 〔式中、ジペプチジルペプチターゼ酵素にはＲ＝Ｈ、お
よびＰｎ−Ｐ１は少なくとも２個の残基のペプチド鎖を
表わす〕で記載される。Ｘは色原性または蛍光原性の基
を表わし、これは色素または蛍光色素での検出可能な変
化をもたらすように酵素の作用によつて遊離される。Ｘ
はニトロフエニル−、ナフチル−またはチオベンジルエ
ステル、同様に芳香族環上にさらに置換基を有するかま
たは有さないニトロアニリン、ナフチルアミンまたはメ
チルクマリン基であつてよい。ジペチジルカルボキシペ
プチダーゼ酵素の場合、Ｘはアミノ末端を表わし、ペプ
チド鎖の場合はＲは色原性または蛍光原性の基であり、
これは酵素の作用によつて遊離される。Ｒは、さらに別
の置換基を有するかまたは有さないＮ−２−フランアク
リロイル−またはベンゾイル−基であつてよい（例１参
照）。
る他のジペプチド−またはオリゴペプチド基質を使用す
ることができる。有利なペプチド基質は、一般式： Ｒ−Ｐｎ−Ｐ１−Ｘ 〔式中、ジペプチジルペプチターゼ酵素にはＲ＝Ｈ、お
よびＰｎ−Ｐ１は少なくとも２個の残基のペプチド鎖を
表わす〕で記載される。Ｘは色原性または蛍光原性の基
を表わし、これは色素または蛍光色素での検出可能な変
化をもたらすように酵素の作用によつて遊離される。Ｘ
はニトロフエニル−、ナフチル−またはチオベンジルエ
ステル、同様に芳香族環上にさらに置換基を有するかま
たは有さないニトロアニリン、ナフチルアミンまたはメ
チルクマリン基であつてよい。ジペチジルカルボキシペ
プチダーゼ酵素の場合、Ｘはアミノ末端を表わし、ペプ
チド鎖の場合はＲは色原性または蛍光原性の基であり、
これは酵素の作用によつて遊離される。Ｒは、さらに別
の置換基を有するかまたは有さないＮ−２−フランアク
リロイル−またはベンゾイル−基であつてよい（例１参
照）。
クロリドイオンの酵素的測定のもう１つの例（例Ｊ）と
して、血漿を４，６−エチリデン（Ｇ７）−ｐ−ニトロ
フエニル（Ｇ１）−、Ｄ−マルトヘプタオシド（４，６
−エチリデン−Ｇ７ＰＮＰ）（５ｍモル／）、α−ア
ミラーゼ（0.60Ｕ／ｍ）およびα−グルコシダーゼ
（＝３０Ｕ／ｍ）を含有する緩衝混合物と共にインキ
ユベートする。ｐ−ニトロフエノールの形成は、完全に
クロリドアニオンの存在に依存し、再び前稀釈、少量の
試料または酵素の最適範囲までクロリドイオン濃度を調
整するための選択的結合剤を使用する。この試験原理を
次にまとめ、反応率は、４０５ｎｍにおける吸光度の上
昇の測定によつて測定する。
して、血漿を４，６−エチリデン（Ｇ７）−ｐ−ニトロ
フエニル（Ｇ１）−、Ｄ−マルトヘプタオシド（４，６
−エチリデン−Ｇ７ＰＮＰ）（５ｍモル／）、α−ア
ミラーゼ（0.60Ｕ／ｍ）およびα−グルコシダーゼ
（＝３０Ｕ／ｍ）を含有する緩衝混合物と共にインキ
ユベートする。ｐ−ニトロフエノールの形成は、完全に
クロリドアニオンの存在に依存し、再び前稀釈、少量の
試料または酵素の最適範囲までクロリドイオン濃度を調
整するための選択的結合剤を使用する。この試験原理を
次にまとめ、反応率は、４０５ｎｍにおける吸光度の上
昇の測定によつて測定する。
このような測定のために使用される化合物の濃度範囲は
次のとおりである。
次のとおりである。
ヘペスまたはクロリド不含緩衝剤 0.01〜0.5ｍモル／ pH 6.5〜7.5 α−アミラーゼ ６０〜６０００Ｕ／ α−グルコシダーゼ ３０００〜３０００００Ｕ
／ ４，６−エチリデン−Ｇ７ＰＮＰ 0.5〜１０ｍモル／
カテプシンＣに関する前記記載の検定変法（例１）を例
Ｊにも適用する。
／ ４，６−エチリデン−Ｇ７ＰＮＰ 0.5〜１０ｍモル／
カテプシンＣに関する前記記載の検定変法（例１）を例
Ｊにも適用する。
重金属イオンの測定（参考） これらの金属は、クリプタンド例えばクリプトフイクス
２２１およびクリプトフイクス ２２２に強く結合す
る。従つてこれらは、より弱く結合されている他の金属
と置換する。容易に置換される金属イオンの一例は亜鉛
である。亜鉛イオンは血漿中に非常に低い濃度で存在す
る。従つて、Ｋ２２１に錯結合した亜鉛イオンを緩衝血
清混合物に添加することは可能である。もし重金属が存
在するならば、亜鉛イオンは遊離され、それらの存在
は、亜鉛イオンに対して高い感受性の酵素ピリドキサー
ルキナーゼ（羊の脳から）の刺激によつて検出できる。
多くの他の同様な競争的な結合検定も可能であり、これ
らを実施例に記載するが、これらのみに限定されるもの
ではない。
２２１およびクリプトフイクス ２２２に強く結合す
る。従つてこれらは、より弱く結合されている他の金属
と置換する。容易に置換される金属イオンの一例は亜鉛
である。亜鉛イオンは血漿中に非常に低い濃度で存在す
る。従つて、Ｋ２２１に錯結合した亜鉛イオンを緩衝血
清混合物に添加することは可能である。もし重金属が存
在するならば、亜鉛イオンは遊離され、それらの存在
は、亜鉛イオンに対して高い感受性の酵素ピリドキサー
ルキナーゼ（羊の脳から）の刺激によつて検出できる。
多くの他の同様な競争的な結合検定も可能であり、これ
らを実施例に記載するが、これらのみに限定されるもの
ではない。
重炭酸イオンの測定（参考） 重炭酸イオンは、本発明に包含される原理の変法を用い
て測定することができる。多くの配位子、例えばクリプ
タンドはpH感受性で、この特性は、重炭酸塩を測定する
のに利用できる。本質的な利点としてプロトンを中和す
る重炭酸塩の能力が挙げられる。塩酸を添加され、非常
に弱く緩衝された血清試料のpHは、重炭酸塩濃度の関数
として変化することが認められる。最終pH値は、pH−感
受性イオン結合剤、例えばクリプトフイクス ２２１の
存在下に存在遊離ナトリウムイオン（β−ガラクトシダ
ーゼで検出されるものとして）の量で検出され、これは
本来の重炭酸塩濃度の関数である。本質的に、全重炭酸
塩をヒドロキシルイオンに変換するために等しい量のＨ
Ｃ（７５ｍモル／）で血清を約pH4.5まで酸性に
し、次いでイオン選択性酵素例えばβ−ガラクトシダー
ゼおよび適当なpH−感受性イオン結合剤を加えた希トリ
ス緩衝液を用いて、pH7.5〜7.8で検定系と反応させる。
試料中のナトリウムイオンの量に応じて補正が必要であ
るので、正確な結果を得るために試料のナトリウムイオ
ン濃度を知るべきである。この方法は、pH検出薬として
の色原体指示薬を用いる方法よりも実質的にさらに敏感
である（例Ｋ）。
て測定することができる。多くの配位子、例えばクリプ
タンドはpH感受性で、この特性は、重炭酸塩を測定する
のに利用できる。本質的な利点としてプロトンを中和す
る重炭酸塩の能力が挙げられる。塩酸を添加され、非常
に弱く緩衝された血清試料のpHは、重炭酸塩濃度の関数
として変化することが認められる。最終pH値は、pH−感
受性イオン結合剤、例えばクリプトフイクス ２２１の
存在下に存在遊離ナトリウムイオン（β−ガラクトシダ
ーゼで検出されるものとして）の量で検出され、これは
本来の重炭酸塩濃度の関数である。本質的に、全重炭酸
塩をヒドロキシルイオンに変換するために等しい量のＨ
Ｃ（７５ｍモル／）で血清を約pH4.5まで酸性に
し、次いでイオン選択性酵素例えばβ−ガラクトシダー
ゼおよび適当なpH−感受性イオン結合剤を加えた希トリ
ス緩衝液を用いて、pH7.5〜7.8で検定系と反応させる。
試料中のナトリウムイオンの量に応じて補正が必要であ
るので、正確な結果を得るために試料のナトリウムイオ
ン濃度を知るべきである。この方法は、pH検出薬として
の色原体指示薬を用いる方法よりも実質的にさらに敏感
である（例Ｋ）。
血漿または血清の試料１０μを用いる、３７℃におけ
る重炭酸塩の酵素的測定のための主試薬の典型的濃度範
囲は次のとおりである： β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ２５０Ｕ／〜７５００Ｕ／ ＮＰＧ ０．２５ｍモル／〜５ｍモル
／ クリプトフイクス ２２１ 0.2ｍモル／〜５ｍモル／ 緩衝剤、pH7.5〜7.8 １ｍモル／〜１０ｍモル／ Ｍｇ２＋ 0.01ｍモル／〜１０ｍモル／ ＥＧＴＡ（Ｌｉ塩） 0.1ｍモル／〜５ｍモル
／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ナトリウムイオン濃度を補正する必要性は、血漿中にマ
イクロモル濃度で通常存在する微量金属（例えば亜鉛イ
オン）に対して敏感な酵素（例えばピリドキサールキナ
ーゼ）の使用によつて避けることができる。微量金属の
結合剤への結合がpH感受性で、クリプトフイクス ２２
１に対するナトリウムイオンと同様の親和性を有する場
合、重炭酸イオンは、血漿中に見い出されえる濃度より
十分に過剰で反応混合物中に亜鉛イオンを包含すること
により測定できる。従つて内在性亜鉛イオンは干渉しな
い。
る重炭酸塩の酵素的測定のための主試薬の典型的濃度範
囲は次のとおりである： β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ２５０Ｕ／〜７５００Ｕ／ ＮＰＧ ０．２５ｍモル／〜５ｍモル
／ クリプトフイクス ２２１ 0.2ｍモル／〜５ｍモル／ 緩衝剤、pH7.5〜7.8 １ｍモル／〜１０ｍモル／ Ｍｇ２＋ 0.01ｍモル／〜１０ｍモル／ ＥＧＴＡ（Ｌｉ塩） 0.1ｍモル／〜５ｍモル
／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ナトリウムイオン濃度を補正する必要性は、血漿中にマ
イクロモル濃度で通常存在する微量金属（例えば亜鉛イ
オン）に対して敏感な酵素（例えばピリドキサールキナ
ーゼ）の使用によつて避けることができる。微量金属の
結合剤への結合がpH感受性で、クリプトフイクス ２２
１に対するナトリウムイオンと同様の親和性を有する場
合、重炭酸イオンは、血漿中に見い出されえる濃度より
十分に過剰で反応混合物中に亜鉛イオンを包含すること
により測定できる。従つて内在性亜鉛イオンは干渉しな
い。
前記記載の方法は、簡単、非常に迅速、正確かつ精密で
あり、高価でない機器を用いて実施できる。引火性ガス
の実験室的危険性は避けられ、イオン選択性電極と関係
する多くの問題も避けることができる。この方法は多角
的分析を実施する大きい装置を使用するように適合させ
ることができるが、なお病床近くでの緊急用の、高価で
ない単独装置と共に使用することもできる。キツトの形
にこの方法をおさめることは簡単である。さらに、カリ
ウムおよびナトリウムイオン濃度の測定を引き続き同一
キユベツト内で実施することができる（例Ｇ）。この方
法が乾燥化学薬品を使用する機械を備えた医院にとつて
有用であることも予期される。これらの方法は自動分光
計を用いて開発されたが、これらは自動または手動の実
験室装置、例えば蛍光光度計、ルミノメーター、同位元
素カウンター等に容易に適合しうる。
あり、高価でない機器を用いて実施できる。引火性ガス
の実験室的危険性は避けられ、イオン選択性電極と関係
する多くの問題も避けることができる。この方法は多角
的分析を実施する大きい装置を使用するように適合させ
ることができるが、なお病床近くでの緊急用の、高価で
ない単独装置と共に使用することもできる。キツトの形
にこの方法をおさめることは簡単である。さらに、カリ
ウムおよびナトリウムイオン濃度の測定を引き続き同一
キユベツト内で実施することができる（例Ｇ）。この方
法が乾燥化学薬品を使用する機械を備えた医院にとつて
有用であることも予期される。これらの方法は自動分光
計を用いて開発されたが、これらは自動または手動の実
験室装置、例えば蛍光光度計、ルミノメーター、同位元
素カウンター等に容易に適合しうる。
次いで、本発明を、血清または血漿試料１０μを基礎
とする次の例によりさらに詳述する。これらの例は説明
のために挙げられているのであり、本発明はこれらのみ
に限定されるものではない。
とする次の例によりさらに詳述する。これらの例は説明
のために挙げられているのであり、本発明はこれらのみ
に限定されるものではない。
次の例で、少量の試料（血清または血漿の場合、特に記
載のない限り１０μ）を緩衝された基質および特定の
共因子を含有する試薬１と混合し、一般に0.1〜５分間
インキユベートする。吸光度の読み取りは、通常、この
インキユベーシヨンの期間中一定の間隔で行なう。次い
で、インジケータ酵素を含有する試薬２を添加し、反応
を監視する。いくつかの例では、試薬１がインジケータ
酵素を含有し、試薬２が適当な基質を含有する。例は、
試料、試薬１および試薬２を混合した後の最終反応混合
物を示している。
載のない限り１０μ）を緩衝された基質および特定の
共因子を含有する試薬１と混合し、一般に0.1〜５分間
インキユベートする。吸光度の読み取りは、通常、この
インキユベーシヨンの期間中一定の間隔で行なう。次い
で、インジケータ酵素を含有する試薬２を添加し、反応
を監視する。いくつかの例では、試薬１がインジケータ
酵素を含有し、試薬２が適当な基質を含有する。例は、
試料、試薬１および試薬２を混合した後の最終反応混合
物を示している。
例Ａ ピルベートキナーゼを用いるカリウムイオン濃度の測定
（ナトリウムイオン結合剤なし、ナトリウムイオン濃度
未知） 最終インキユベーシヨン混合物は次のものを含有する： トリス−ＨＣ緩衝剤、pH7.4 １７５ｍモル／ Ｌｉ＋〔ＬｉＯＨ１７ｍモル／、ＬｉＣ３ｍモル／
〕 ２０ｍモル／
ＭｎＣ２ 3.0ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 2.6ｍモル／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 2.9ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.4ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で検定） １７０００Ｕ／
バチルス・ステアロサーモフイルスからのＰＫ ８９０
Ｕ／ ＫＧ 4.0ｍモル／ ＧＤＨ（グリセチン中：２５℃で検定） ８６００Ｕ／
ヒト血清アルブミン １４０mg／ カリウムイオン標準（較正溶液）は、血漿中に存在する
ナトリウムイオンのピルベートキナーゼ上への刺激的作
用を調整するために、ナトリウムイオン１４０ｍモル／
を含有する。
（ナトリウムイオン結合剤なし、ナトリウムイオン濃度
未知） 最終インキユベーシヨン混合物は次のものを含有する： トリス−ＨＣ緩衝剤、pH7.4 １７５ｍモル／ Ｌｉ＋〔ＬｉＯＨ１７ｍモル／、ＬｉＣ３ｍモル／
〕 ２０ｍモル／
ＭｎＣ２ 3.0ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 2.6ｍモル／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 2.9ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.4ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で検定） １７０００Ｕ／
バチルス・ステアロサーモフイルスからのＰＫ ８９０
Ｕ／ ＫＧ 4.0ｍモル／ ＧＤＨ（グリセチン中：２５℃で検定） ８６００Ｕ／
ヒト血清アルブミン １４０mg／ カリウムイオン標準（較正溶液）は、血漿中に存在する
ナトリウムイオンのピルベートキナーゼ上への刺激的作
用を調整するために、ナトリウムイオン１４０ｍモル／
を含有する。
例Ｂ ピルベートキナーゼを使用するカリウムイオン濃度の測
定（ナトリウムイオン結合剤不含、ナトリウムイオン濃
度既知） インキユベーシヨン混合物および較正溶液は例Ａと同じ
である。
定（ナトリウムイオン結合剤不含、ナトリウムイオン濃
度既知） インキユベーシヨン混合物および較正溶液は例Ａと同じ
である。
ナトリウムイオンが１４０ｍモル／を下まわる（又は
上まわる）場合には、ナトリウムイオン濃度１０ｍモル
／につきカリウム0.1ｍモル／を添加（または減す
る）することによつて混合物のナトリウムイオンに関し
て補正することができる。しかしながら、この補正は既
知のナトリウムおよびカルシウム濃度を含有する水溶液
を分析することによつて変えられるべきである。
上まわる）場合には、ナトリウムイオン濃度１０ｍモル
／につきカリウム0.1ｍモル／を添加（または減す
る）することによつて混合物のナトリウムイオンに関し
て補正することができる。しかしながら、この補正は既
知のナトリウムおよびカルシウム濃度を含有する水溶液
を分析することによつて変えられるべきである。
例Ｃ ナトリウムイオン結合剤の存在下にピルベートキナーゼ
を用いるカリウムイオン濃度を測定 例Ｂと同様であるが、ヒト血清アルブミンを除き、媒体
は、付加的に１回の検定当りクリプトフイクス ２２１
６μモルを含有する。個々の試料のカリウムイオン含
有量の違いによるクリプトフイクス ２２１からのナト
リウムイオンの置換の変動を最小限にするために7.8のp
Hを選択する。
を用いるカリウムイオン濃度を測定 例Ｂと同様であるが、ヒト血清アルブミンを除き、媒体
は、付加的に１回の検定当りクリプトフイクス ２２１
６μモルを含有する。個々の試料のカリウムイオン含
有量の違いによるクリプトフイクス ２２１からのナト
リウムイオンの置換の変動を最小限にするために7.8のp
Hを選択する。
例Ｄ（参考） β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いるナトリウムイオン濃
度の測定 変法ａ：最終インキユベーシヨン混合物は次のものを含
有する： トリスＨＣ、pH8.7（３７℃） ３００ｍモル／ ジチオスレイトール ４ｍモル／ 硫酸マグネシウム 7.5ｍモル／ 塩化リチウム １６ｍモル／ ＥＧＴＡ（リチウム塩） 0.44ｍモル
／ ヒト血清アルブミン ４６０mg／ β−ガラクトシダーゼ ７６０Ｕ／
ＮＰＧ 1.5ｍモル／ クリプトフイスク ２２１ 1.25μモル／検定 反応を波長４２０ｎｍ（またはその付近）で監視遊離２
−ニトロフエノールの形成率および当初試料中のナトリ
ウムイオンの濃度を測定する。
度の測定 変法ａ：最終インキユベーシヨン混合物は次のものを含
有する： トリスＨＣ、pH8.7（３７℃） ３００ｍモル／ ジチオスレイトール ４ｍモル／ 硫酸マグネシウム 7.5ｍモル／ 塩化リチウム １６ｍモル／ ＥＧＴＡ（リチウム塩） 0.44ｍモル
／ ヒト血清アルブミン ４６０mg／ β−ガラクトシダーゼ ７６０Ｕ／
ＮＰＧ 1.5ｍモル／ クリプトフイスク ２２１ 1.25μモル／検定 反応を波長４２０ｎｍ（またはその付近）で監視遊離２
−ニトロフエノールの形成率および当初試料中のナトリ
ウムイオンの濃度を測定する。
変法ｂ：変法ａと比較したもう１つの方法は、前稀釈に
よつて試料濃度を１０倍低下させるか、または少量の試
料を用い、この場合はクリプタンドを除去することがで
きる。
よつて試料濃度を１０倍低下させるか、または少量の試
料を用い、この場合はクリプタンドを除去することがで
きる。
変法ｃ：ナトリウムイオン低含有量（例＜２０ｍモル／
）（この場合にはクリプタンドを排除できる）の体液
での測定。
）（この場合にはクリプタンドを排除できる）の体液
での測定。
例Ｅ（参考） ピルベートキナーゼを用いるナトリウムイオンの測定
（カリウムイオン感受性を低下させる条件下で、ナトリ
ウムイオンによる酵素活性の直接刺激） 変法ａ：血漿試料１０μに対し、インキユベーシヨン
混合物は次のものを含有する： トリスＨＣ、pH8.7（３７℃） ３００ｍモル／ ＭｇＣ２ ５ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 2.6ｍモル／ ＰＥＰ（中和されたトリス酸） 2.9ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.34ｍモル／
ＬＤＨ（２５℃で検定） １７０００Ｕ
／ ＰＫ（ウサギの筋肉から、３７℃で検定） ２０００Ｕ
／ ＫＧ ４ｍモル／ グリセリン中のＧＤＨ（２５℃で検定） ８６０
０Ｕ／ クリプトフイクス ２２２ 1.25μモル／検定 ナトリウムイオン較正溶液は、血清カリウムイオンのピ
ルベートキナーゼへのカリウム活性化作用を補償するた
めに、カリウム４ｍモル／を含有する。
（カリウムイオン感受性を低下させる条件下で、ナトリ
ウムイオンによる酵素活性の直接刺激） 変法ａ：血漿試料１０μに対し、インキユベーシヨン
混合物は次のものを含有する： トリスＨＣ、pH8.7（３７℃） ３００ｍモル／ ＭｇＣ２ ５ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 2.6ｍモル／ ＰＥＰ（中和されたトリス酸） 2.9ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.34ｍモル／
ＬＤＨ（２５℃で検定） １７０００Ｕ
／ ＰＫ（ウサギの筋肉から、３７℃で検定） ２０００Ｕ
／ ＫＧ ４ｍモル／ グリセリン中のＧＤＨ（２５℃で検定） ８６０
０Ｕ／ クリプトフイクス ２２２ 1.25μモル／検定 ナトリウムイオン較正溶液は、血清カリウムイオンのピ
ルベートキナーゼへのカリウム活性化作用を補償するた
めに、カリウム４ｍモル／を含有する。
例Ｆ（参考） ピルベートキナーゼを用いるナトリウムイオンの測定
（競争的結合検定）−カリウムイオン既知 血漿試料１０μに対し、最終インキユベーシヨン混合
物は次のものを含有する： グリシンpH9.8 ３００ｍモル／ ＭｇＣ２ ５ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 2.6ｍモル／ ＰＥＰ（中和されたトリプ塩） 2.9ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.34ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で検定） １７０００Ｕ／ ウサギの筋肉からのＰＫ（３７℃で検定） ８９０Ｕ／ ＫＧ ４ｍモル／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ８５００Ｕ／
ＫＣ ５ｍモル／ クリプトフクス ２２１ 2.5μモル／検定 塩化カリウムをこの試薬に添加し、クリプトフイクス
２２１から化学量論的にナトリウムイオンによつて置換
し、こうして、試料のナトリウムイオン濃度を、定量さ
れるようにする。
（競争的結合検定）−カリウムイオン既知 血漿試料１０μに対し、最終インキユベーシヨン混合
物は次のものを含有する： グリシンpH9.8 ３００ｍモル／ ＭｇＣ２ ５ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 2.6ｍモル／ ＰＥＰ（中和されたトリプ塩） 2.9ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.34ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃で検定） １７０００Ｕ／ ウサギの筋肉からのＰＫ（３７℃で検定） ８９０Ｕ／ ＫＧ ４ｍモル／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ８５００Ｕ／
ＫＣ ５ｍモル／ クリプトフクス ２２１ 2.5μモル／検定 塩化カリウムをこの試薬に添加し、クリプトフイクス
２２１から化学量論的にナトリウムイオンによつて置換
し、こうして、試料のナトリウムイオン濃度を、定量さ
れるようにする。
例Ｇ 同一キユベツト中でのカリウムおよびナトリウムイオン
濃度の測定（対試験） 検定試薬が次のものを含有する以外、まず、ナトリウム
イオン濃度を例Ｄと同様に検定する： ＡＤＰ（遊離酸） 2.6ｍモル／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 2.9ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.4ｍモル／ ＫＧ 4.0ｍモル／ ＧＤＨ ８６００Ｕ／ 反応率の測定によるナトリウムイオンの測定に引続き、
インキユベーシヨン混合物のpHを少量の塩酸でpH7.4に
低下させる。
濃度の測定（対試験） 検定試薬が次のものを含有する以外、まず、ナトリウム
イオン濃度を例Ｄと同様に検定する： ＡＤＰ（遊離酸） 2.6ｍモル／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 2.9ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.4ｍモル／ ＫＧ 4.0ｍモル／ ＧＤＨ ８６００Ｕ／ 反応率の測定によるナトリウムイオンの測定に引続き、
インキユベーシヨン混合物のpHを少量の塩酸でpH7.4に
低下させる。
次いで、指示最終濃度を達成するために次の成分を添加
する： ＬＤＨ １７０００Ｕ／ バチルス・ステアロサーモフイルスからのＰＫ ８９０Ｕ／ ＭｎＣ２ 3.0ｍモル／ ＬｉＣ 20.0ｍモル／ その後、反応率を３４０ｎｍで監視することができる
が、ナトリウムイオン指示反応で遊離される２−ニトロ
フエノールによる可能な干渉を最小にするために少し高
い波長で測定することもできる。
する： ＬＤＨ １７０００Ｕ／ バチルス・ステアロサーモフイルスからのＰＫ ８９０Ｕ／ ＭｎＣ２ 3.0ｍモル／ ＬｉＣ 20.0ｍモル／ その後、反応率を３４０ｎｍで監視することができる
が、ナトリウムイオン指示反応で遊離される２−ニトロ
フエノールによる可能な干渉を最小にするために少し高
い波長で測定することもできる。
例Ｈ（参考） カルパインＩを用いるカルシウムイオン濃度の測定 この実験では、血漿を得るために少量の血液を遠心分離
する。カルシウムイオンの測定のために、試料をイミダ
ゾール−ＨＣ緩衝剤（pH7.3）５０ｍモル／、Ｌ−
システイン５ｍモル／、２−メルカプトエタノール2.
5ｍモル／、ＥＧＴＡ0.1ｍモル／、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ
−Ｍｅｔ−ｐ−ニトロアニリド５ｍモル／を含有する
混合物と共に３０℃でインキユベートする。４０５ｎｍ
での吸光度の増加を、５分間隔で監視した。この率は試
料のカルシウムイオン濃度に比例する。
する。カルシウムイオンの測定のために、試料をイミダ
ゾール−ＨＣ緩衝剤（pH7.3）５０ｍモル／、Ｌ−
システイン５ｍモル／、２−メルカプトエタノール2.
5ｍモル／、ＥＧＴＡ0.1ｍモル／、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ
−Ｍｅｔ−ｐ−ニトロアニリド５ｍモル／を含有する
混合物と共に３０℃でインキユベートする。４０５ｎｍ
での吸光度の増加を、５分間隔で監視した。この率は試
料のカルシウムイオン濃度に比例する。
例Ｉ（参考） カプテシンＣを用いるクロリドイオン濃度の測定 この実験では、血漿（５μ）を得るために少量の血液
試料を遠心分離する。クロリドイオンの測定のために、
インキユベーシヨン混合物はクエン酸緩衝液（pH5.0)0.
05モル／、システアミン１０ｍモル／、Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐ−ニトロアニリド４ｍモル／およびカテプシ
ンＣ0.01Ｕ／ｍを含有する。後者はクロリドイオンを
除去するために、リン酸ナトリウム緩衝剤（pH6.8）１
０ｍモル／および４３％（ｖ／ｖ）のグリセリンに対
して透析されている。この方法で得られた典型的な較正
曲線を第１図に示す。
試料を遠心分離する。クロリドイオンの測定のために、
インキユベーシヨン混合物はクエン酸緩衝液（pH5.0)0.
05モル／、システアミン１０ｍモル／、Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐ−ニトロアニリド４ｍモル／およびカテプシ
ンＣ0.01Ｕ／ｍを含有する。後者はクロリドイオンを
除去するために、リン酸ナトリウム緩衝剤（pH6.8）１
０ｍモル／および４３％（ｖ／ｖ）のグリセリンに対
して透析されている。この方法で得られた典型的な較正
曲線を第１図に示す。
例Ｊ（参考） α−アミラーゼを用いるクロリドイオン濃度の測定 血漿試料５μに対して阻害混合物は次のものを含有す
る： ヘペスまたは択一的クロリド不含緩衝液 １００ｍモル
／ pH 7.1 α−アミラーゼ ６００Ｕ／
α−グリコシダーゼ ３００００Ｕ／ ４，６−エチリデン−Ｇ７ＰＮＰ ５ｍモル／ 反応を波長４０５ｎｍ（またはその付近）で監視し、遊
離４−ニトロフエノールの形成率およびこれに伴う当初
試料中のクロリドイオン濃度を測定する。
る： ヘペスまたは択一的クロリド不含緩衝液 １００ｍモル
／ pH 7.1 α−アミラーゼ ６００Ｕ／
α−グリコシダーゼ ３００００Ｕ／ ４，６−エチリデン−Ｇ７ＰＮＰ ５ｍモル／ 反応を波長４０５ｎｍ（またはその付近）で監視し、遊
離４−ニトロフエノールの形成率およびこれに伴う当初
試料中のクロリドイオン濃度を測定する。
例Ｋ（参考） β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる重炭酸イオン濃度の
測定 変法ａ：最終インキユベーシヨン混合物は次のものを含
有する： トリスＨＣ、pH7.8（３７℃） ５ｍモル／ ジチオスレイトール ４ｍモル／ 硫酸マグネシウム 7.5ｍモル／ 塩化リチウム １６ｍモル／ ＥＧＴＡ（リチウム塩） 0.44ｍモル／ ヒト血清アルブミン ４６０mg／ β−ガラクトシダーゼ １５００Ｕ／ ＮＰＧ 1.5ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ 2.0μモル／検定 ＥＧＴＡはエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四
酢酸を意味する。試料を、そのpH値を4.5に低下するた
めに当量のＨＣ（血漿に対し７５ｍモル／）と共に
予めインキユベートする。その後、反応を波長４２０ｎ
ｍ（またはその付近）で監視し、遊離２−ニトロフエノ
ールの形成率、およびそれに伴う当初試料中の重炭酸イ
オン濃度を測定する。当初試料中のナトリウムイオン濃
度に関して補正を行なつた。
測定 変法ａ：最終インキユベーシヨン混合物は次のものを含
有する： トリスＨＣ、pH7.8（３７℃） ５ｍモル／ ジチオスレイトール ４ｍモル／ 硫酸マグネシウム 7.5ｍモル／ 塩化リチウム １６ｍモル／ ＥＧＴＡ（リチウム塩） 0.44ｍモル／ ヒト血清アルブミン ４６０mg／ β−ガラクトシダーゼ １５００Ｕ／ ＮＰＧ 1.5ｍモル／ クリプトフイクス ２２１ 2.0μモル／検定 ＥＧＴＡはエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四
酢酸を意味する。試料を、そのpH値を4.5に低下するた
めに当量のＨＣ（血漿に対し７５ｍモル／）と共に
予めインキユベートする。その後、反応を波長４２０ｎ
ｍ（またはその付近）で監視し、遊離２−ニトロフエノ
ールの形成率、およびそれに伴う当初試料中の重炭酸イ
オン濃度を測定する。当初試料中のナトリウムイオン濃
度に関して補正を行なつた。
変法ｂ：ピリドキサールキナーゼ、ピリドキサールおよ
び亜鉛イオンをβ−ガラクトシダーゼおよびＮＧＰに換
える。
び亜鉛イオンをβ−ガラクトシダーゼおよびＮＧＰに換
える。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ベリー，マイクル ナサニール オーストラリア国 エス．エイ．5050，エ デン ヒルズ，ウイーローラ ロード 30 (72)発明者 タウン，マイクル‐ハロルド ドイツ連邦共和国 Ｄ‐8125 オーベルハ ウゼン ヴアルトシユトラーセ 45 (72)発明者 クレツセ，ゲーオルク‐ブルクハルト ドイツ連邦共和国 Ｄ‐8122 ペンツベル ク アルプスピツツシユトラーセ ６ (72)発明者 ヘルマン，ウーヴエ ドイツ連邦共和国 Ｄ‐8139 ベルンリー ト ヴエターシユタインシユトラーセ ４ (56)参考文献 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ，92，Ｐ．370−374（1979)
Claims (18)
- 【請求項１】体液中のカリウムイオンを測定する方法に
おいて、微生物トランスフェラーゼ又は微生物オキシド
レダクターゼへのカリウムイオンの影響を測定すること
を特徴とする、体液中のカリウムイオンの測定法。 - 【請求項２】微生物トランスフェラーゼは、バシルス・
ステアロテルモフィルスからのピルベートキナーゼ（Ｐ
Ｋ）であり、微生物オキシドレダクターゼは、グリセロ
ールデヒドロゲナーゼ又はアセトアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼである、請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】干渉イオンを結合剤でマスキングする、請
求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 - 【請求項４】試料の希釈が可能でないか又は、酵素のカ
リウムに対する親和性が低下されるべき場合には、被測
定イオンを結合剤を用いて測定に最適のレベルまで濃度
を低下させる、請求の範囲第１項から第３項までのいず
れか１項記載の方法。 - 【請求項５】干渉イオンをクリプタンド、コロナンド、
ポタンド、クラウンエーテル、スフエランド、ヘミスフ
ェランド、カリキサレンおよびこれらの組合せ物、天然
産イオノフォレ、環状ペプチド、コンプレクソンおよび
キレート化剤およびそれらの誘導体と結合させる、請求
の範囲第３項又は第４項に記載の方法。 - 【請求項６】干渉ナトリウムイオンをクリプトフィクス
２２１（登録商標）と結合させる、請求の範囲第１項か
ら第５項までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】結合剤はクリプトフィクス２２２（登録商
標）である、請求の範囲第４項又は第５項記載の方法。 - 【請求項８】インジケータイオンと錯体を形成し、この
錯体からインジケータイオンをカリウムイオンにより化
学量論的に換え、ここで酵素活性に対する換えられたイ
ンジケータイオンの影響を検定し、この際、カリウムイ
オンの濃度を間接的に測定する、請求の範囲第１項から
第７項までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】酵素のカリウムに対する親和性を低めるべ
き場合には、インジケータ酵素の競争的阻害剤であるイ
オンをこの検定に包含させる、請求の範囲第１項から第
８項までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】競争的阻害剤はリチウムイオンである、
請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１１】その活性がカリウムイオンによって影響
される微生物トランスフェラーゼ又は微生物オキシドレ
ダクターゼよりなる、体液中のカリウムイオンを測定す
るための組成物。 - 【請求項１２】微生物トランスフェラーゼ又は微生物オ
キシドレダクターゼ及び液体中の干渉イオンを結合する
か又は、カリウムイオンの濃度を測定に最適のレベルま
で低め、かつ／又は微生物トランスフェラーゼ又は微生
物オキシドレダクターゼのカリウムイオンに対する親和
性を低める結合剤より成る、請求の範囲第１１項記載の
体液中のカリウムイオンを測定するための組成物。 - 【請求項１３】結合剤はクリプタンドである、請求の範
囲第１２項記載の組成物。 - 【請求項１４】クリプタンドは、干渉イオンに結合する
ためのクリプトフィクス２２１（登録商標）、カリウム
イオンの濃度を低めかつ／又は微生物トランスフェラー
ゼ又は微生物オキシドレダクターゼの親和性を低めるた
めのクリプトフィクス２２２（登録商標）である、請求
の範囲第１２項記載の組成物。 - 【請求項１５】ピルベートキナーゼＰＫ（Ｂ． ステアロテルモフィルス） ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ ＰＥＰ（中和されたトリス塩） 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／ クリプトフィクス２２１（登録商標） ０ｍモル／〜３０ｍモル／ ＮＡＤＨ 0.01ｍモル／〜0.8ｍモル／ 緩衝剤、pH７−８ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／
Ｍｎ２＋又はＭｇ２＋ １ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬｉＣ ２ｍモル／〜１００ｍモル／ ＡＤＰ（遊離酸） 0.5ｍモル／〜１０ｍモル／ ＬＤＨ（２５℃検定）５０００Ｕ／〜１０００００Ｕ
／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定）２５００Ｕ／〜２００００Ｕ
／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ より成る、有利に３７℃で使用される、体液中のカリウ
ムイオンを測定するための組成物。 - 【請求項１６】グリセロールデヒドロゲナーゼ （エンテロバクター・アエロゲネス） ５０Ｕ／〜１００００Ｕ／ グリセロール 0.3モル／〜３モル／ クリプトフィクス２２１（登録商標） ０ｍモル／〜３０ｍモル／ ＮＡＤ 0.1ｍモル／〜5.0ｍモル／ 緩衝剤、pH９ ２０ｍモル／〜５００ｍモル／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ より成る、有利に３７℃で使用される、体液中のカリウ
ムイオンを測定するための組成物。 - 【請求項１７】アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ （酵母） ５０Ｕ／／〜１００００Ｕ／ グリコールアルデヒド 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／
クリプトフィクス２２１（登録商標） ０ｍモル／〜３０ｍモル／ ＮＡＤ 0.05ｍモル／〜2.0ｍモル／ 緩衝剤、pH７−８ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ ジチオスレイトール 0.1ｍモル／〜２ｍモル／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ より成る、有利に３７℃で使用される、体液中のカリウ
ムイオンを測定するための組成物。 - 【請求項１８】アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ （酵母） ５０Ｕ／／〜１００００Ｕ／ ４−ニトロフェニルアセテート 0.3ｍモル／〜３０ｍモル／ クリプトフィクス２２１（登録商標） ０ｍモル／〜３０ｍモル／ ＮＡＤ 0.001ｍモル／〜0.1ｍモル／ 緩衝剤、pH７−８ ５０ｍモル／〜５００ｍモル／ ジチオスレイトール 0.1ｍモル／〜２ｍモル／ 血清アルブミン ０ｇ／〜５ｇ／ ＧＤＨ（２５℃で検定） ２５００Ｕ／〜２００００
Ｕ／ ＫＧ（遊離酸） １ｍモル／〜１０ｍモル／ より成る、有利に３７℃で使用される、体液中のカリウ
ムイオンを測定するための組成物。
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