CN108607237B - 一种adp配基层析介质的保护方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于亲和层析技术领域，提供一种ADP配基层析介质的保护方法。向硫氧还蛋白还原酶TrxR粗酶液中加入螯合剂，螯合粗酶液中的Mg2+，抑制DNase活性，保护ADP配基。用TE缓冲液平衡2’5’ADP Sepharose亲和层析柱，将含有螯合剂的TrxR粗酶液加入柱子中使TrxR与ADP配基结合，采用TE缓冲液清洗非特异性结合在柱子上的杂蛋白，再采用TE+0.5M NaCl洗脱与ADP配基结合的TrxR，用再生缓冲液处理对柱子进行再生后，立即用TE缓冲液平衡再生后的柱子。本发明操作方法简单、螯合剂廉价易得，经济成本低；对ADP配基保护作用显著，实用性强。

Description

一种ADP配基层析介质的保护方法
技术领域
本发明属于亲和层析技术领域，涉及一种ADP配基层析介质的保护方法。
背景技术
Sepharose用途广泛且具有高机械稳定性，是一种优质的基质，适用于亲和层析、离子交换层析和其它分离模式的高性能层析程序。基于琼脂糖的Sepharose层析介质家族可以实现配体的稳定结合，用于不同酶、抗体和其它蛋白以及多肽的纯化，大幅扩展了潜在应用的范围，广泛用于实验室和工业应用。
2’5’ADP是通过溴化氰活化法固定在Sepharose 4B上的NADP结构类似物，它亲和需要NADP辅因子的酶，所以2’5’ADP Sepharose 4B主要用于纯化需要NADP作为辅因子的酶。2’5’ADP Sepharose 4B与NADP依赖型脱氢酶作用强烈，可以使用2’5’ADP Sepharose4B分离脱氢酶多种同功酶的混合物，用含有NAD+或NADP+的洗脱液进行梯度洗脱可以得到高分辨率的分离效果。
可以使用2’5’ADP Sepharose 4B亲和层析纯化硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase,TrxR)等黄素蛋白。在TrxR的纯化实验中发现，2’5’ADP Sepharose 4B亲和层析柱在正常使用情况下，出现分离效率下降较大，不能维持高收率的重现性等问题。根据实验室前期工作可知是脱氧核糖核酸酶DNase影响与基质偶联的ADP配基，从而造成分离效率下降甚至层析柱损坏。
发明内容
本发明针对现有技术中使用2’5’ADP Sepharose亲和层析纯化硫氧还蛋白还原酶TrxR过程中出现的ADP配基损坏，导致分离效率下降，不能维持高收率的重现性等问题，提供一种ADP配基层析介质的保护方法，提升2’5’ADP Sepharose亲和层析柱纯化表现，延长其使用寿命。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种ADP配基层析介质的保护方法，包括以下步骤：
(1)待纯化样品的预处理
向硫氧还蛋白还原酶TrxR粗酶液中加入螯合剂，使粗酶液中螯合剂的终浓度为10-50mM，螯合粗酶液中的Mg2+，抑制DNase活性，保护ADP配基。所述的螯合剂能与Mg2+结合，包括乙二胺四乙酸EDTA、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸EGTA。
(2)按照2’5’ADP Sepharose亲和层析柱使用说明操作，用TE缓冲液平衡柱子，将步骤(1)得到的含有螯合剂的TrxR粗酶液加入柱子中使TrxR与ADP配基结合，采用TE缓冲液清洗非特异性结合在柱子上的杂蛋白，再采用TE+0.5M NaCl洗脱与ADP配基结合的TrxR，用再生缓冲液处理对柱子进行再生后，立即用TE缓冲液平衡再生后的柱子，柱子不用时于4℃贮存在20％乙醇中。
所述步骤(1)中向TrxR粗酶液中补充加入螯合剂，螯合剂的终浓度优选为20mM，此时螯合剂对ADP配基的保护作用最好，这体现在此时TrxR的2’5’ADP Sepharose亲和层析收率最高，为85％。
所述步骤(2)中2’5’ADP Sepharose亲和层析柱的最佳载量为每毫升2’5’ADPSepharose填料结合2mg TrxR。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)螯合剂能与Mg2+结合，由于多数核酸酶类发挥作用需要Mg2+，故常用做核酸酶的抑制剂。
(2)螯合剂DNase的抑制剂廉价易得，经济成本低；对ADP配基保护作用显著，实用性强。
(3)操作方法简单，包括但不限于向样品中加入螯合剂溶液、固体螯合剂药品等处理方式。
附图说明
图1是以TrxR的2’5’ADP Sepharose亲和层析收率表示，TrxR粗酶液中不同的螯合剂EDTA浓度对ADP配基的保护作用。
具体实施方式
结合实施例详细阐述本发明的具体实施方式如下：
对比例1
取10ml TrxR粗酶液，不补充EDTA。用15mlTE缓冲液平衡柱子，接着把TrxR粗酶液加入柱体积为5ml的2’5’ADP Sepharose亲和层析柱中，然后用100ml TE缓冲液清洗柱子，接着用15ml TE+0.5M NaCl洗脱与ADP配基特异结合的TrxR，然后用15ml再生缓冲液1(0.1MTris-HCl，0.5M NaCl，pH 8.5)和15ml再生缓冲液2(0.1M乙酸钠，0.5M NaCl，pH 4.5)交替再生柱子三次，接着用15ml TE缓冲液平衡柱子。使用DTNB法测定亲和层析前后TrxR的总活力，得到亲和层析收率为51％。
实施例2
取10ml TrxR粗酶液，补充200μl 0.5M EDTA至粗酶液中EDTA浓度为10mM。用15mlTE缓冲液平衡柱子，接着把TrxR粗酶液加入柱体积为5ml的2’5’ADP Sepharose亲和层析柱中，然后用100ml TE缓冲液清洗柱子，接着用15ml TE+0.5M NaCl洗脱与2’5’ADP配基特异结合的TrxR，然后用15ml再生缓冲液1(0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 8.5)和15ml再生缓冲液2(0.1M乙酸钠，0.5M NaCl，pH 4.5)交替再生柱子三次，接着用15ml TE缓冲液平衡柱子。使用DTNB法测定亲和层析前后TrxR的总活力，得到亲和层析收率为66％。
分析对比例1和实施例2。对比例1中的硫氧还蛋白还原酶TrxR粗酶液中没有补充螯合剂，TrxR的2’5’ADP Sepharose亲和层析收率为51％；实施例2中的TrxR粗酶液中补充了终浓度为20mM的螯合剂，TrxR的2’5’ADP Sepharose亲和层析收率为85％。对比可知，向粗酶液中补充螯合剂进行样品预处理可以有效保护ADP配基，提升2’5’ADP Sepharose亲和层析柱纯化表现，延长其使用寿命。
实施例3
取10ml TrxR粗酶液，补充400μl 0.5M EDTA至粗酶液中EDTA浓度为20mM。用15mlTE缓冲液平衡柱子，接着把TrxR粗酶液加入柱体积为5ml的2’5’ADP Sepharose亲和层析柱中，然后用100ml TE缓冲液清洗柱子，接着用15ml TE+0.5M NaCl洗脱与ADP配基特异结合的TrxR，然后用15ml再生缓冲液1(0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 8.5)和15ml再生缓冲液2(0.1M乙酸钠，0.5M NaCl，pH 4.5)交替再生柱子三次，接着用15ml TE缓冲液平衡柱子。使用DTNB法测定亲和层析前后TrxR的总活力，得到亲和层析收率为85％。
实施例4
取10ml TrxR粗酶液，补充1ml 0.5M EDTA至粗酶液中EDTA浓度为50mM。用15mlTE缓冲液平衡柱子，接着把TrxR粗酶液加入柱体积为5ml的2’5’ADP Sepharose亲和层析柱中，然后用100ml TE缓冲液清洗柱子，接着用15ml TE+0.5M NaCl洗脱与ADP配基特异结合的TrxR，然后用15ml再生缓冲液1(0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 8.5)和15ml再生缓冲液2(0.1M乙酸钠，0.5M NaCl，pH 4.5)交替再生柱子三次，接着用15ml TE缓冲液平衡柱子。使用DTNB法测定亲和层析前后TrxR的总活力，得到亲和层析收率为69％。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种ADP配基层析介质的保护方法，其特征在于以下步骤：
(1)待纯化样品的预处理
向硫氧还蛋白还原酶TrxR粗酶液中加入螯合剂，使粗酶液中螯合剂的终浓度为10-50mM，螯合粗酶液中的Mg2+，抑制DNase活性，保护ADP配基；所述的螯合剂能与Mg2+结合；
(2)按照2’5’ADP Sepharose亲和层析柱使用说明操作，用TE缓冲液平衡柱子，将步骤(1)得到的含有螯合剂的TrxR粗酶液加入柱子中使TrxR与ADP配基结合，采用TE缓冲液清洗非特异性结合在柱子上的杂蛋白，再采用TE+0.5M NaCl洗脱与ADP配基结合的TrxR，用再生缓冲液处理对柱子进行再生后，立即用TE缓冲液平衡再生后的柱子。
2.根据权利要求1所述的一种ADP配基层析介质的保护方法，其特征在于，所述步骤(1)中螯合剂包括乙二胺四乙酸EDTA、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸EGTA。
3.根据权利要求1或2所述的一种ADP配基层析介质的保护方法，其特征在于，所述步骤(1)中螯合剂的终浓度优选为20mM。
4.根据权利要求1或2所述的一种ADP配基层析介质的保护方法，其特征在于，所述步骤(2)中2’5’ADP Sepharose亲和层析柱的最优载量为每毫升2’5’ADP Sepharose填料结合2mg TrxR。
5.根据权利要求3所述的一种ADP配基层析介质的保护方法，其特征在于，所述步骤(2)中2’5’ADP Sepharose亲和层析柱的最优载量为每毫升2’5’ADP Sepharose填料结合2mgTrxR。
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