RU2036236C1 - Способ очистки щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя - Google Patents
Способ очистки щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя Download PDFInfo
- Publication number
- RU2036236C1 RU2036236C1 RU92014490A RU92014490A RU2036236C1 RU 2036236 C1 RU2036236 C1 RU 2036236C1 RU 92014490 A RU92014490 A RU 92014490A RU 92014490 A RU92014490 A RU 92014490A RU 2036236 C1 RU2036236 C1 RU 2036236C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sorbent
- enzyme
- alkaline phosphatase
- specific activity
- per
- Prior art date
Links
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, препаративная биохимия и области иммуноферментного анализа. Сущность изобретения: очистку щелочной фосфатазы осуществляют нанесением экстракта на хроматографический сорбент, уравновешенный буферным раствором солянокислого триса и магния хлористого, в качестве сорбента используют аминопропилированный кремнезем с диаметром пор 500 - 3000
Description
Изобретение относится к биотехнологии и препаративной биохимии и касается очистки щелочной фосфатазы, которая может быть использована в иммуноферментном анализе.
Известен способ получения очищенной щелочной фосфатазы с помощью биоспецифических сорбентов, содержащих в качестве стационарного лиганда группировки бензилфосфоновой кислоты [1] Сорбция фермента проводится при нейтральных рН, а десорбция осуществляется добавлением в элюент 10-150 мМ Na2HPO4, являющегося конкурентным ингибитором фосфатаз.
Недостатками данного способа являются: сложный и многостадийный синтез самого лиганда, что существенно влияет на стоимость сорбента, низкая емкость сорбента, необходимость удаления из элюата фосфата натрия, что не всегда удается провести полностью.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ очистки щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя с использованием иммобилизованного конканавалина А (Биохимия, т. 53, 1988, с. 974-978). В качестве аффинного сорбента была использована сефароза 6В с иммобилизованным конканавалином А, уравновешенная трис-HCl буфером, содержащим ионы магния, цинка и хлористый натрий. Элюция фермента достигалась ступенчатым градиентом 50 мМ α -метил-Д-маннопиранозидом, растворенным в стартовом буфере. Активные фракции диализовали против трис-HCl буфера с хлористым магнием и хранили в растворе при 4оС. Удельная активность очищенного таким способом фермента достигала 1500 ед, на 1 мг белка.
Однако для данного способа характерны недостаточная химическая и микробиологическая стойкость сефарозной матрицы, высокая стоимость импортной конканавалин А-сефарозы 6В, а также невысокая удельная активность получаемой фосфатазы.
Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса с одновременным повышением степени очистки фермента.
Указанная цель достигается тем, что в качестве сорбента используют аминопропилированный кремнезем с диаметрами пор 500-3000 с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана в количестве 0,5-50 мг на 1 мл сорбента. Исходя из химического строения этого стационарного лиганда, его взаимодействие со щелочной фосфатазой не является очевидным. Возможно, что вклад во взаимодействие вносят близко расположенные кислотные группировки (SO- 3, COO-) модифицированного хитозана. Не исключено также влияние полисахаридной матрицы на взаимодействие, так как щелочная фосфатаза из кишечника гренландского тюленя является гликопротеином. Тем не менее сорбент проявляет неожиданно высокую селективность по отношению к фосфатазе, которую нельзя однозначно ожидать из его химического строения. N-сульфосукцинат хитозана получают сульфатированием предварительно малеилированного хитозана пирсульфатом натрия.
Нижняя граница содержания лиганда N-сульфосукцината хитозана 0,5 мг обусловлена тем, что при более низком содержании лиганда существенную роль начинает играть неспецифическое взаимодействие белков разделяемой смеси с матрицей силикогеля, ввиду чего снижается селективность сорбента. В результате понижается степень очистки фермента и выход по активности (пример 6).
Верхняя граница содержания лиганда 50 мг на мл сорбента обусловлена тем, что при ее превышении наблюдается уменьшение удельной активности и выхода щелочной фосфатазы. Вероятно при слишком большом содержании лиганда между ферментом и группами лиганда возникает многоточечное связывание, что может привести к структурным изменениям и частичной инактивации фермента (пример 7).
Нижняя граница диаметра пор силикагеля обусловлена тем, что при меньшем размере пор носителя доступность молекул фермента в поры сорбента затруднена, из-за чего снижается эффективная поверхность сорбента. В результате этого заметно снижается выход по активности фермента (пример 8).
Верхняя граница диаметра пор 3000 обусловлена отсутствием коммерчески доступных силикагелей с большим размером пор.
Способ осуществляется следующим образом.
Колонку, содержащую 1-10 мл аминопропилированного кремнезема с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана (0,5-50 мг на 1 мл сорбента), уравновешивают 0,05 М трис-HCl буфером, содержащим 5-50 мМ хлористого магния при рН 7,0-8,0. На уравновешанную колонку наносят 15-150 тыс. единиц активности щелочной фосфатазы в том же буфере. После окончания нанесения раствора фосфатазы колонку промывают уравновешивающим буфером до отсутствия поглощения при λ280 нм, затем проводят элюцию либо линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 1 М, либо ступенчатым градиентом 0,2, 0,5 и 1 М. Элюирование щелочной фосфатазы происходит при 0,2 М хлористого натрия.
П р и м е р 1. Стеклянную колонку (10 х 1,2 см) заполняют 10 мл аминопропилированного силохрома с 80 (d пор 500 ) с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана (0,5 мг на 1 мл сорбента). Последовательно промывают 1 М хлористым натрием (50 мл), водой (150 мл) и уравновешивают 0,5 М трис-HCl буфером, содержащим 5 мМ хлористого магния при рН 7,0 со скоростью 50 мл/ч в течение 3 ч. На уравновешанную колонку наносят 150000 единиц активности щелочной фосфатазы с удельной активностью 100 ед/мг в трис-HCl буфере при рН 7,0, содержащего 5 мМ хлористого магния и имеющего электропроводность не выше уравновешивающего буфера. Затем колонку промывают уравновешивающим буфером до отсутствия поглощения при λ280 нм и проводят элюцию линейным градиентом (0-1 М) хлористого натрия. Максимум фосфатазной активности элюируется при 0,2 М хлористого натрия. Фракцию, содержащую около 70% нанесенной фосфатазной активности, контролируют с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Выделенной фосфатазе соответствует белковая зона с молекулярной массой около 70000 Да, удельная активность 5000 единиц на 1 мг белка. За единицу активности принимают количество фермента, катализирующее расщепление 1 мкМ р-нитрофенилфосфата за 1 мин при 37оС в 1 М диэтаноламине, содержащем 10 мМ MgCl2, при рН 9,0.
П р и м е р 2. Аналогичен примеру 1, но было взято 10 мл аминопропилированного силохрома СХ-1 (d пор 3000 ) с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана (50 мг на мл сорбента). Был получен фермент с удельной активностью 4000 ед/мг и выходом 80%
П р и м е р 3. Аналогичен примеру 1, но был взят 1 мл аминопропилированного силикагеля МСА-750 (d пор 750 ), содержащего 25 мл N-сульфосукцината хитозана на 1 мл сорбента. Было нанесено 15000 единиц фермента и получен фермент с удельной активностью 4500 ед/мг и выходом 75%
П р и м е р 4. Аналогичен примеру 1, но было взято 5 мл аминопропилированного силохрома СХ-2 (d пор 1300 ), содержащего 25 мл N-сульфосукцината хитозана на 1 мл сорбента. Нанесено 75000 единиц фермента и был получен фермент 4500 ед/мг с выходом 75%
П р и м е р 5. Аналогичен примеру 1, но было взято 5 мл аминопропилированного силохрома СХ-2 (d пор 1300 ), содержащего 25 мг N-сцльфосукцината хитозана на 1 мл сорбента. Нанесено 75 000 единиц фермента и был получен фермент с удельной активностью 4700 ед/мг с выходом 70%
П р и м е р 6. Аналогичен примеру 1, но уравновешивающий и рабочий буферы имели рН 8,0. Была получена щелочная фосфатаза с удельной активностью 4300 ед/мг с выходом 75%
П р и м е р 7. Аналогичен примеру 1, но количество ковалентно присоединенного N-сульфосукцината хитозана составляет 0,3 мг на мл сорбента. Получен фермент с удельной активностью 2000 ед/мг белка с выходом по активности 40%
П р и м е р 8. Аналогичен примеру 1, но количество ковалентно присоединенного N-сульфосукцината хитозана составляет 55 мг на мл сорбента. Получен препарат фермента с удельной активностью 3800 ед/мг белка с выходом по активности 60%
П р и м е р 9. Аналогичен примеру 1, но диаметр пор силикагеля 3000 . Получен фермент с удельной активностью 4500 ед/мг белка с выходом по активности 40%
Технико-экономический эффект предлагаемого изобретения заключается в получении высокоочищенной (удельная активность 4000-5000 единиц на 1 мг белка) щелочной фосфатазы из тонкого кишечника гренландского тюленя. Фермент с такой активностью пригоден в качестве маркера в высокочувствительном иммуноферментном анализе. Используемые носители намного дешевле конканавалин А-сефарозы 6В. Они могут быть промыты при регенерации щелочами, кислотами, детергентами и органическими растворителями, что затруднительно сделать с аффинными сорбентами на основе сефарозы 6В. Достигаемая высокая селективность при очистке не вытекает из анализа химической структуры используемого сорбента. Жесткая природа исходной матрицы позволяет использовать его в крупномасштабной очистке щелочной фосфатазы.
П р и м е р 3. Аналогичен примеру 1, но был взят 1 мл аминопропилированного силикагеля МСА-750 (d пор 750 ), содержащего 25 мл N-сульфосукцината хитозана на 1 мл сорбента. Было нанесено 15000 единиц фермента и получен фермент с удельной активностью 4500 ед/мг и выходом 75%
П р и м е р 4. Аналогичен примеру 1, но было взято 5 мл аминопропилированного силохрома СХ-2 (d пор 1300 ), содержащего 25 мл N-сульфосукцината хитозана на 1 мл сорбента. Нанесено 75000 единиц фермента и был получен фермент 4500 ед/мг с выходом 75%
П р и м е р 5. Аналогичен примеру 1, но было взято 5 мл аминопропилированного силохрома СХ-2 (d пор 1300 ), содержащего 25 мг N-сцльфосукцината хитозана на 1 мл сорбента. Нанесено 75 000 единиц фермента и был получен фермент с удельной активностью 4700 ед/мг с выходом 70%
П р и м е р 6. Аналогичен примеру 1, но уравновешивающий и рабочий буферы имели рН 8,0. Была получена щелочная фосфатаза с удельной активностью 4300 ед/мг с выходом 75%
П р и м е р 7. Аналогичен примеру 1, но количество ковалентно присоединенного N-сульфосукцината хитозана составляет 0,3 мг на мл сорбента. Получен фермент с удельной активностью 2000 ед/мг белка с выходом по активности 40%
П р и м е р 8. Аналогичен примеру 1, но количество ковалентно присоединенного N-сульфосукцината хитозана составляет 55 мг на мл сорбента. Получен препарат фермента с удельной активностью 3800 ед/мг белка с выходом по активности 60%
П р и м е р 9. Аналогичен примеру 1, но диаметр пор силикагеля 3000 . Получен фермент с удельной активностью 4500 ед/мг белка с выходом по активности 40%
Технико-экономический эффект предлагаемого изобретения заключается в получении высокоочищенной (удельная активность 4000-5000 единиц на 1 мг белка) щелочной фосфатазы из тонкого кишечника гренландского тюленя. Фермент с такой активностью пригоден в качестве маркера в высокочувствительном иммуноферментном анализе. Используемые носители намного дешевле конканавалин А-сефарозы 6В. Они могут быть промыты при регенерации щелочами, кислотами, детергентами и органическими растворителями, что затруднительно сделать с аффинными сорбентами на основе сефарозы 6В. Достигаемая высокая селективность при очистке не вытекает из анализа химической структуры используемого сорбента. Жесткая природа исходной матрицы позволяет использовать его в крупномасштабной очистке щелочной фосфатазы.
Claims (1)
- СПОСОБ ОЧИСТКИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ИЗ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ТЮЛЕНЯ, предусматривающий нанесение экстракта на хроматографический сорбент, уравновешенный буферным раствором солянокислого триса и хлористого магния, и элюцию ступенчатым градиентом, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют аминопропилированный кремнезем с диаметром пор с ковалентно присоединенным N-сульфосукцинатом хитозана в количестве 0,5 50,0 мг на 1 мл сорбента, а ступенчатый градиент создают добавлением в исходный буферный раствор 0,2М хлористого натрия.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU92014490A RU2036236C1 (ru) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | Способ очистки щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU92014490A RU2036236C1 (ru) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | Способ очистки щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2036236C1 true RU2036236C1 (ru) | 1995-05-27 |
RU92014490A RU92014490A (ru) | 1997-03-20 |
Family
ID=20134286
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU92014490A RU2036236C1 (ru) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | Способ очистки щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2036236C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL1006478C2 (nl) * | 1997-01-20 | 1999-03-23 | Bae Hee Dong | Bereiding van enzymprodukten en ruwe voedingsmaterielen onder toepassing van graanzaden |
US11628381B2 (en) | 2012-09-17 | 2023-04-18 | W.R. Grace & Co. Conn. | Chromatography media and devices |
-
1992
- 1992-12-25 RU RU92014490A patent/RU2036236C1/ru active
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
1. Land M., Bolts S., Butler L., Biochemistry, v.17, 5, р.915-919, 1978. * |
2. Сахаров И.Ю., Макарова И.Е. и Ермолин Г.А. Физико-химические свойства щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя. - Биохимия, т.53, вып.6, 1988, с.974-978. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL1006478C2 (nl) * | 1997-01-20 | 1999-03-23 | Bae Hee Dong | Bereiding van enzymprodukten en ruwe voedingsmaterielen onder toepassing van graanzaden |
US11628381B2 (en) | 2012-09-17 | 2023-04-18 | W.R. Grace & Co. Conn. | Chromatography media and devices |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Steers et al. | The purification of β-galactosidase from Escherichia coli by affinity chromatography | |
Janson | Large-scale affinity purification—state of the art and future prospects | |
EP1729867B1 (en) | A method for chromatographic purification | |
US5003047A (en) | Method for purifying biologically active ligate | |
AU2003232704A1 (en) | Method, use and kit for separating albumin from contaminants in a liquid | |
US4579661A (en) | Process in the purification of biologically active substances | |
JP3768485B2 (ja) | 血清アルブミンの精製方法 | |
EP0423938B1 (en) | Ligand-containing medium for chromatographic separation, process for preparing the medium, and use of the medium for isolating synthetic or natural molecules from a fluid mixture | |
Mohammad et al. | Dye—ligand affinity chromatography on continuous beds | |
Hedman et al. | Protein adsorbents intended for use in aqueous two-phase systems | |
RU2036236C1 (ru) | Способ очистки щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя | |
Sasaki et al. | Improved method for the immobilization of heparin | |
WO1999057992A1 (en) | Compositions and methods for protein purification based on a metal ion affinity site | |
US6150151A (en) | Affinity chromatographic matrix containing non-covalently bound ligand for purification of biological material | |
US5395856A (en) | HPLC avidin monomer affinity resin | |
JP2007238479A (ja) | ハイドロキシアパタイトに吸着された有機物の溶出方法及び該溶出方法を用いた有機物の精製方法 | |
Shimazaki et al. | Interacting properties of bovine lactoferrin with immobilized Cibacron blue F3GA in column chromatography | |
EP0310719B1 (en) | Method for purification of antibodies | |
US4841024A (en) | Purification of antibodies | |
Glad et al. | New methods for separation and recovery of biomolecules | |
Stemberger et al. | Heterogeneity of clottable fibrinogen isolated from plasma by affinity chromatography | |
Rudolph et al. | Enzyme purification by high-performance ion-exchange liquid chromatography | |
Schwidop et al. | Procedure for the purification of streptavidin by hydrophobic interaction chromatography | |
JP2006327991A (ja) | リコンビナントタンパク質の新規な精製法 | |
JP4154743B2 (ja) | インターロイキン6レセプターの精製方法 |