NL1006478C2 - Bereiding van enzymprodukten en ruwe voedingsmaterielen onder toepassing van graanzaden - Google Patents

Description

Titel: Bereiding van enzymproducten en ruwe voedings-materialen onder toepassing van graanzaden.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op de bereiding van enzymen met hoge activiteit onder toepassing van verschillende zaden.

5 Meer in detail heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een protocol voor een massabereiding van enzymen met hoge activiteit, gebaseerd op het idee dat wanneer graan- en oliezaden worden gekiemd bij de juiste omgevingsomstandigheden, grote hoeveelheden enzym met hoge 10 activiteit kon worden verkregen.

BESCHRIJVING VAN DE STAND DER TECHNIEK

Een enzym is een eiwit dat bindt aan een substraat en de bruikbaarheid van het substraat doet toenemen. Het is een essentiële stof, nodig voor onderhoud en activering van 15 biologische mechanismen van levende wezens. Gebaseerd op het begrip van de biochemische karakteristieken en het belang in het leven van enzymen, zijn enzymen actief toegepast in de medische, farmaceutische en voedingsindustrie en in het veld van de biotechnologie. Bovendien 20 hebben vele onderzoeksactiviteiten efficiënte producten en enzymen opgeleverd. Het bereiken van de industrialisatie van enzymbereiding ondervindt echter verschillende hindernissen. Een ander probleem is het ontwikkelen van een methodologie waarbij enzymactiviteiten onder verschillende 25 groeicondities (pH, temperatuur en dergelijke) behouden blijven. Ten derde moet een massaproductietechnologie worden ontwikkeld. Om deze hindernissen effectief te overwinnen, zijn verschillende pogingen gedaan enzymen te bereiden onder toepassing van genetische manipulatie-30 technologie, maar tengevolge van de nadelen bij een 1006478" 2 productie op grote schaal en het gemis aan economische concurrentie, werd het praktische gebruik van de technologie verhinderd en was het succes van de technologie eveneens niet hoog.

5 SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

Een doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een methode voor massaproductie van enzymen met hoge activiteit.

Een ander doel van de uitvinding is gericht op het 10 aanwenden van de ruwe voedingsmaterialen van gekiemde zaden als koolstofbron bij de gesorteerde (of gemengde) voedingsproduct ie, en aldus bij te dragen aan een grotere productiviteit van vee/huisdieren.

Een ander doel van de uitvinding is gericht op het 15 verminderen van milieuvervuiling veroorzaakt door mest van dieren bij het verminderen van de hoeveelheden aan organisch fosfaat en mest na het voeden met voedsel, aangevuld met enzym van gekiemde zaden aan vee/huisdieren.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN

20 Fig. 1 geeft een blokdiagram weer, dat de werkwijzen volgens de uitvinding voorstelt.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Bij deze uitvinding richte men zich op het overwinnen van moeilijkheden bij de productie van enzymen 25 onder toepassing van micro-organismen, waarbij de uitvinding is gebaseerd op het feit dat de hoogste enzym-activiteit wordt waargenomen tijdens de kiemperiode van verschillende zaden.

De uitvinder heeft ontdekt dat maximale activiteit 30 van amylase, cellulase, pectinase, CMC-ase, beta-glucanase xylanase en proteinase tijdens de kiemperiode van graan-en oliezaden, zoals gerst, tarwe, maïs, sojaboon en canola.

1 006478"· 3

Toegenomen activiteit van fytase werd ook waargenomen tijdens de kiemperiode van deze zaden. De uitvinding verschaft een productietechnologie voor enzym onder toepassing van het kiemen van zaden en het oogsten daarvan 5 op het optimale moment van enzymactiviteit. Graan, dat toevoegstofbron voor zetmeel voor diervoeder is, bevat een grote hoeveelheid organisch fosfaat. Mono-gastrische dieren, zoals kippen, varkens en honden, missen enzymen die organische fosfaten hydrolyseren in hun spijsverterings-10 stelsel. Daarom kan organisch fosfaat niet worden verteerd door deze dieren. Om dit nadeel te compenseren, worden anorganische fosfaten als supplement toegevoegd bij de bereiding van gemengde voeders. Dit veroorzaakt een hogere kostprijs van het voeder en milieuvervuiling als gevolg van 15 excessief gebruik van het anorganische fosfaat. Aangezien deze dieren geen organische fosfaten kunnen verwerken, zou het gebruik van fytase, dat organisch fosfaat hydrolyseert, in gemengde voeders bijdragen aan een betere aanwending van voeder bij deze dieren, en zou de productiviteit 20 maximaliseren en de kosten van vleesproductie reduceren en ook milieuvervuiling door organische fosfaten verminderen.

Recent zijn er, gebaseerd op deze logica, verschillende pogingen gedaan om fytase en andere enzymen aan diervoeders toe te voegen, niet alleen voor raono-25 gastrische dieren, maar ook voor herkauwers, zoals vee, herten, schapen en geiten. Verschillende studies zijn uitgevoerd op dit gebied in de Verenigde Staten, Canada, Japan, Nederland, Duitsland, Verenigd Koninkrijk en Finland. In het Nederland is het verplicht om fytase aan 30 diervoeders toe te voegen.

Deze landen hebben een hoge bevolkingsdichtheid met een kleiner gebied, met een evenredig groter aantal huisdieren, zodat ernstige milievervuilingsproblemen ontstaan in rivier- en grasland als gevolg van organische 35 fosfaten in dierenmest, omdat sommige dieren organische fosfaten niet kunnen verteren. De onderhavige uitvinding 1006478" 4 zou bijdragen aan een verbeterde aanwending van diervoeders, en daarbij de milieuvervuiling verminderen, de kosten van voeder aanzienlijk reduceren en de groeisnelheid van dieren doen toenemen door het gebruik van fytase en 5 andere enzymen van gekiemde graanzaden.Bovendien verschaft de uitvinding een economisch en efficiënt enzymproductie-protocol, onder toepassing van de productiemechanismen van enzymen tijdens de kiemperiode van verschillende planten-zaden. Tot op heden is de praktische aanwending van fytase 10 door kiemprocessen van zaden niet beschreven.

Volgens de uitvinding was de kiemproductietech-nologie door kiemen van graanzaden ontwikkeld, gebaseerd op de volgende principes. In het algemeen produceren planten zaden voor productie. Om de groei van de gekiemde zaden 15 effectief te stimuleren, in het bijzonder tijdens een vroeg stadium van de kieming, worden verschillende verzamelde voedingsstoffen in de zaden gehydrolyseerd en verbruikt. Zaden bevatten, als voedingsmiddel zetmeel, oliën en eiwitten als energiebron en mineralen zoals fosfaten, in 20 essentie voor de groei. Enzymen zijn in essentie nodig om de verzamelde voedingsstoffen in enzymen effectief aan te wenden. Aldus begint de afscheiding van verschillende enzymen onder bepaalde condities voor de kieming. Bij het begin van de spruit van zaden onder bepaalde omgevings-25 omstandigheden, hydrolyseren verschillende enzymen verzamelde voedingsstoffen in de zaden voor het verschaffen van energie en essentiële mineralen voor de groei, en tegelijkertijd worden verschillende enzymen geproduceerd in de zaden. In het bijzonder is adenosinetrifosfaat (ATP), 30 dat is samengesteld uit fosfaat, nodig voor het energie-metabolisme. De ATP's worden aangevoerd door de hydrolyse van organisch fosfaat door de werking van fytase. Daarnaast worden beta-glucanase, proteïnases en andere enzymen geproduceerd en deze fungeren voor de vertering van 35 verschillende verzamelde voedingsstoffen. De hoeveelheden en activiteiten van de geproduceerde enzymen hangen af van 1 OOR/; 78^ 5 de klassificatie van de zaden, kiemomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid, vochtgehalte van het zaad en duur van incubatie. Zelfs bij zaden van dezelfde soort, bijvoorbeeld rijstzaden, verschillende hoeveelheden en 5 activiteiten van enzymen, afhankelijk van de hoeveelheden eiwitten, structurele verschillen van zetmeel, ras en gekweekte variëteit van de zaden.

Volgens de onderhavige uitvinding hebben we de optimale kiemomstandigheden van verschillende zaden 10 geïdentificeerd en de beste omstandigheden voor een enzymproductie gekozen, om de vee- en voedingsindustrieën deze technologie effectief te kunnen laten gebruiken. Volgens deze uitvinding had de productie een fytase-prioriteit en werden de andere enzymen subsidiair 15 behandeld.

De volgende beschrijving laat stappen zien die een producent eenvoudig kan aanwenden voor de processen van zaadselectie, kweek, drogen, pletten en verpakken, onder verwijzing naar fig. 1. Volgens deze uitvinding werd de 20 productie van ruwe voedingsmaterialen uitgevoerd in fase 1, de productie van voedingsmaterialen met hoge zuiverheid uitgevoerd in fase 2, en productie van enzymproducten uitgevoerd in fase 3.

Het eerste proces: Het proces van zaadselectie 25 Zaden opgeslagen in de bak (1) worden getrans porteerd naar zeef (11) en gebroken, en beschadigde zaden worden verwijderd in de eerste zeving en die zaden met vertraagde spruit en beschimmelde zaden worden eveneens verwijderd in de tweede zeving. Die zaden die de eerste 30 zeving zijn gepasseerd worden in een zoutoplossing geplaatst en slechts die zaden die in de oplossing zinken worden gebruikt. De drijvende zaden worden weggegooid na verzameling met een verzamelingsapparaat (5). De in de eerste en tweede zeving gekozen zaden worden ondergedompeld 35 in een vat (7) dat een niet-ionogeen hydrofiele emulgator 1006478' 6 bevat, en vervolgens overgebracht naar kiemincubator (8), uitgerust met thermometer (9) en vochtmeter (10).

Het tweede proces: Het proces van kieming en .incubatie

De hierboven geselecteerde zaden worden gelijkmatig 5 verspreid en geincubeerd bij de juiste vochtigheid en temperatuur. Op het moment dat de maximale hoeveelheid enzymen wordt geproduceerd, wordt de incubatie gestopt en het droogproces begonnen.

Het derde proces: Het droogproces 10 Aan het eind van het tweede proces, worden de gekiemde zaden (hierna "enzymproducten" genoemd) geoogst en onderworpen aan een droogproces met een hete, droge-luchtgenerator (12).

Het vierde proces: Het proces van pletten en verpakken 15 De gedroogde enzymproducten van het derde proces worden verwerkt tot drie soorten producten als weergegeven in fig. 1- De eerste producten geven enzymproducten met hoge zuiverheid weer en worden verwerkt door het verwijderen van de zaadvliezen onder toepassing van een 20 ontvliesmachine (16), het pletten tot stukjes met afmetingen van 0,1 mm en het verpakken onder toepassing van een vacuümverpakker (18) (pad nr. 2), de tweede producten worden als diervoedersupplement bereid. De enzymproducten met de vliezen worden geplet met een pletter (14) en 25 verpakt (15) (pad nr. 1). De derde producten geven vloeibare enzymproducten weer, bereid door het onderdompelen van de gepoederde producten met hoge zuiverheid van bovenstaand pad nr. 1 in een bufferoplossing (20)(21) en het extraheren van de enzymen onder toepassing van een 30 enzymextractor (19) en het verkrijgen van de bovendrijvende lagen na centrifugering (20) (pad nr. 3). Deze drie producten worden opgeslagen in een droge koude kamer.

1006478’ 7

In het navolgende beschrijven we de praktische uitvoering van de enzym- en voederproductieprocessen in detail.

Praktische uitvoering-nr.-.l 5 Na zeven werden gerstekorrels ondergedompeld in een 1,5%-ige natriumchloride-oplossing en overgebracht in water. Bij een vochtgehalte van de gerst van 50%, werden de gerstekorrels geincubeerd bij 25-30°C gedurende 30 uur, waarbij een vochtigheid van 90-95% binnen de incubator werd 10 gehandhaafd. Het kiemproces werd gestopt bij een spruit -lengte van 2,0 cm en hit te-gedroogd bij 40°C gedurende 36 uur. De vochtgehalten van de gekiemde en gedroogde gerstekorrels was 9%.

Praktische uitvoering nr. 2 15 Alle processen waren identiek met uitvoering nr. 1 behalve dat de gerst gedurende 12 uur werd ondergedompeld in 0,05% polysorbaat als een niet-ionogene hydrofiele emulgator om de kiemsnelheid te doen toenemen. De kiem-periode was ongeveer 12-24 uur korter. Het vochtgehalte van 20 de gekiemde en gedroogde gerstekorrels was 12%.

Praktische uitvoering nr. 3

Behalve dat rijstzaad werd gebruikt, waren alle processen identiek met operatie nr. 1. Het vochtgehalte van het gekiemde en gedroogde rijstzaad was 9%.

25 Prakt.ia.che uitvoering, nr». 4

Behalve dat tarwe werd gebruikt, waren alle processen identiek met operatie nr. 1. Het vochtgehalte van de gekiemde en gedroogde tarwezaden was 9%.

1006478' 8

Praktische uitvoering nr. 5

Na zeven werden sojabonen ondergedompeld in een 3,0%-ige natriumchloride-oplossing. Bij een vochtgehalte van 60% van de bonen, werden de bonen geincubeerd bij 30°C 5 gedurende 36 uur, met een vochtigheid binnen de incubator variërend van 90-95%. Bij een spruitlengte van 1 cm werd de incubatie gestopt en werden de bonen onderworpen aan droge hitte gedurende 24 uur bij een temperatuur van 80°C van een hete-luchtdroger. Vochtgehalte van de producten was 12%.

10 Praktische uitvoering nr. 6

Behalve dat canolazaad werd gebruikt, waren alle processen identiek met uitvoering nr. 5. Het vochtgehalte van het gekiemde en gedroogde canola was 9%.

Praktische uitvoering.nr..1 15 Alle processen waren identiek met uitvoering nr. 5, behalve dat de bonen werden ondergedompeld in 10% polysorbaat 80 gedurende 4 uur, als een niet-ionogene hydrofiele emulgator, om de kiemsnelheid te doen toenemen. De kiemperiode was ongeveer 24-36 uur korter. Het 20 vochtgehalte van de eindproducten was 12%.

Praktische uitvoering nr. 8

Alle processen waren identiek met uitvoering nr. 5, behalve dat mais werd gebruikt. De lengten van de maïsspruiten waren 1,5 cm en de eindproducten hadden een 25 vochtgehalte van 10%.

Om de enzymactiviteit van enzymextracten verkregen van geplette enzymproducten te stabiliseren, werden de vloeibare enzymextracten toegevoegd aan MgCl2 bij een concentratie van 0,5-1,0 M. Vloeibare enzymproducten werden 30 verkregen na centrifugeren van deze enzymproducten bij 1 0064 78 » 9 5.000 xg. Een biologische bufferoplossing was gebruikt voor het extraheren van de enzymen.

Experiment nr._I

Om de enzymactiviteit te stabiliseren, werden 5 vloeibare enzymproducten behandeld met 0,5-1,0 M MgCl2,

CaCl2 en CoCl2. Het effect van de enzymstabiliteit bij MgCl2 was 200 maal dat van CaCl2 en maakt de opslag van de vloeibare enzymproducten mogelijk voor meer dan 4 maanden.

Experiment nr. 2 10 Om de activiteit van de amylase geëxtraheerd van gekiemde gerst gebaseerd op de uitvinding vast te stellen, werden in vitro experimenten uitgevoerd. De hoeveelheden glucose vrijgemaakt van substraten zoals maïs, tarwe en gerst waren 223,8 μΜ, 288,8 μΜ en 318,9 μΜ. Bij deze 15. experimenten werden als substraten, niet-gekiemde maïs, tarwe en gerst geplet tot smalle deeltjes om een zeef van 0,5 mm mesh te kunnen passeren en geïncubeerd bij 38°C gedurende 24 uur.

Experiment nr._1 20 Om de activiteit van fytase geëxtraheerd van gekiemde gerst gebaseerd op de uitvinding vast te stellen, werden in vitro experimenten uitgevoerd als een bovenstaand experiment nr. 2. Van de bovenstaande substraten, waren de hoeveelheden vrijgemaakt fosfaat van maïs, tarwe en gerst 25 respectievelijk 613,7 μg, 373,9 μg en 1573,8 μg.

Experiment nr. 4

Tabel 1 toont de vergelijkende gegevens van de amylase-activiteiten van niet-gekiemde en gekiemde graan-en oliezaden gebaseerd op de uitvinding. De toenamen van 30 amylaseactiviteiten varieerden van een minimum waarde van 1 0064 78- 10 210% bij tarwe- en sojabonen tot een maximum waarde van 1300% bij maïs.

Tabel 1

Amylase-activiteit van niet-gekiemde en 5 gekiemde graan- en oliezaden __Amylase-activiteit (eenheid/kg)__

Relatieve

Graan__Niet-gekiemd__Gekiemd__toename (%)

Maïs 5.200 66.100 1.300

Tarwe 66.500 139.400 210

Gerst 64.444 176.100 280

Rijst 12.962 117.800 910

Soj aboon__65.679__133.500__210_

Experiment nr. 5

Tabel 2 toont de vergelijkende gegevens van de fytase activiteit van niet-gekiemde en gekiemde graan- en 10 oliezaden gebaseerd op de uitvinding. De toenamen van amylase-activiteiten varieerden van een minimum waarde van 120% bij sojabonen en een maximum waarde van 470% bij maïs.

1 0 0 64 7 8' 11

Tabel 2

Fytase-activiteit van niet-gekiemde en gekiemde graan- en oliezaden __Fytase-activiteit (eenheid/kg)__

Relatieve

Graan__Niet-gekiemd__Gekiemd__toename (%)

Maïs 13.900 64.600 470

Tarwe 112.400 227.600 210

Gerst 119.400 305.600 260

Rijst 5.200 31.900 630

Sojaboon _39.000 43.900_ 120_ 5 Experiment nr. 6

Om de activiteiten van verschillende enzymen geëxtraheerd van gekiemde gerst vast te stellen, werden experimenten uitgevoerd als beschreven onder experiment nr. 4 onder toepassing van niet-gekiemde gerst als 10 controle. Bij vergelijking met de niet-gekiemde gerst, bleken de activiteiten van verschillende enzymen toegenomen te zijn in de gekiemde gerst, zoals respectievelijk cellulase 300%, pectinase 500%, CMC-ase 500%, hemicellulase 300% en protease 400%.

15 Experiment nr. 7

Onder toepassing van sojabonen werden experimenten identiek met het bovenstaande experiment nr. 6 uitgevoerd. Vergelijking met niet-gekiemde sojabonen, bleken de activiteiten van verschillende enzymen te zijn toegenomen 1 00R478 ' 12 in de gekiemde sojaboon, zoals respectievelijk amylase 2500%, cellulase 400%, pectinase 600%, CMC-ase 500%, hemicellulase 200%, protease 600% en fytase 450%.

Diervoedingsexperiment 1: varkens 5 Varkens werden gevoederd met de geplette enzym- producten bereid van gerst beschreven in bovenstaande uitvoering nr. 1 als ruwe zetmeelvoedingsmaterialen. Na drie maanden van voeding bleek het relatieve lichaamsgewicht 20% te zijn toegenomen vergeleken met de 10 controlegroep die was gevoederd met een voeder voor algemene doelen.

Samenstelling van het voeder

Zetmeelvoeder (ruwe voedermaterialen volgens de uitvinding) 40-50% 15. Cellulasevoeder 20%

Proteïnevoeder 20%

Vulmaterialen, farmaceutica en mineralen 10-20%

Diervoedingsexperiment 2: braadkip

Braadkippen werden gevoerd met de geplette 20 enzymproducten geproduceerd van sojabonen beschreven in de uitvoering nr. 5 met dezelfde samenstelling van het voeder als bovenbeschreven behalve dat geplette enzymproducten van de sojabonen werden gebruikt als de bron van proteïnevoer. Na acht weken voeren, werd een relatieve lichaamsgewicht-25 toename van 15% waargenomen vergeleken met de controlegroep die was gevoed met een voeder voor algemene doelen.

Diervoedingsexperiment 3: ei-leggende hennen

Identieke experimenten beschreven in het diervoeder-experiment 2 werden uitgevoerd behalve dat ei-leggende 30 hennen werden gebruikt. De relatieve snelheden van ei-productie werden 8-10% verbeterd vergeleken met de 1 0 0 64 7 8 i 13 controlegroep die was gevoerd met een voeder voor algemene doelen. De initiële ei-legtijd was ongeveer twee weken verkort.

Diervoedingsexperiment 4: honden, mink en mossen 5 Identieke experimenten beschreven in het diervoeder- experiment 2 werden uitgevoerd bij honden, mink en vossen. Relatieve gewichtstoenamen van 15%, 13% en 20% werden waargenomen bij respectievelijk de honden, mink en vossen. Het bleek dat de mink en vossen die bij de behandelde groep 10 hoorden glanzender vachten hadden dan de controledieren. Enzymproducten van gekiemde graanzaden bevatten grote hoeveelheden aan verschillende enzymen met hoge activiteit, daarom wordt van verschillende substraten verwacht dat ze synergistisch hydrolyseren. We bevestigden een uitstekend 15 vervangingseffeet door 0,5 gew.% enzymproducten toe te voegen aan farmaceutica voor dieren vergeleken met de vulmaterialen.

Effect .van de uitvinding

Volgens deze uitvinding is een enzymproductie-20 technologie ontwikkeld voor gekiemde graanzaden. De technologie past natuurwetten toe, en produceert maximale hoeveelheden enzymen bij lage kosten. De enzymproducten zijn veilig zonder toxiciteit voor dierlijk gebruik aangezien de producten worden bereid van granen die door 25 mens en dier worden geconsumeerd. De enzymproducten bevatten niet alleen een maximale hoeveelheid aan fytase maar ook grote hoeveelheden van het enzym,· van verschillende substraten wordt verwacht dat ze synergistisch hydrolyseren. De enzymproducten toonden een 30 uitstekend vervangingseffect aangezien de enzymproducten verschillende voedingsstoffen als ruwe voedingsmaterialen bevatten voor de productie van gemengde voeders vergeleken met andere ruwe voedingsmaterialen.

1 006478 ’ 14

Door het toepassen van enzymproducten is het niet nodig fytase toe te voegen aan voeders voor herkauwers en dieren met een enkele maag voor de vertering van organische fosfaten. Daarom blijkt de onderhavige uitvinding zeer 5 bruikbaar bij de diervoeder- en vee-industrieën, aangezien het gebruik ervan economisch voordelig door een aanzienlijke reductie van de kosten van de voeders.

1 0 0fU7 8-»

Claims (7)

1. Q 64 7 8-* emulgator, gedurende 4-12 uur, om de kiemsnelheid te doen toenemen.

1. Graan- en oliezaden (rijst, gerst, tarwe, maïs, sojabonen en canola) producten verkregen door kiemprocessen voor de productie van enzymen.

2. Technologie die grote hoeveelheden van enzymen met 5 hoge activiteit, zoals amylase, cellulase, lipase, pectinase, CMC-ase, beta-glucanase, proteinase en fytase, produceert van geplette en gekiemde zaden.

3. Methodologie voor het extraheren van enzymen beschreven in conclusie 2, onder toepassing van een buffer- 10 oplossing en een oplossing van 0,5-1,0 M MgCl2 om de stabiliteit van de hoge activiteiten van de enzymen te handhaven.

4. Methodologie volgens conclusie 2 of 3, verder omvattende centrifugering van het extract om vloeibare 15 enzymproducten te bereiden.

5. Werkwijze voor het bereiden van algemeen ruw materiaal voor gemengde voeders, omvattende de stappen van: onderdompelen van de graan- en oliezaden in 1,5-3,0%-ige natriumchloride-oplossing en verwijderen 20 van inferieure graanzaden; het vochtgehalte van de graanzaden op 40-60% brengen; het incuberen bij 25-30°C gedurende 24-36 uur bij een vochtigheid van 90-95% in de incubator; 25 hete-luchtdrogen bij 25-80°C gedurende 24-36 uur en het vochtgehalte van de gedroogde en gekiemde zaden op 9-12% te brengen; en het pletten van de gedroogde gekiemde zaden en het verpakken van de producten.

6. Methodologie volgens conclusie 5, verder omvattende de stap van het onderdompelen van de graanzaden in 0,05-10,0% polysorbaat 80 als een niet-ionogene hydrofiele

7. Toepassing van enzymproducten van gekiemde zaden als ruwe diervoedermaterialen en als vulmateriaal voor 5 farmaceutica voor dieren. i 0ΠΡΛ7 8^