DD289287A5 - Verfahren zur isolierung von keimungsspezifischer alpha-amylase aus getreide - Google Patents

Abstract

Das erfindungsgemaesze Verfahren bezieht sich auf die Isolierung von keimungsspezifischer a-Amylase aus gekeimtem Getreidesamen, vorzugsweise aus Roggen. Keimungsspezifische a-Amylase ist speziell fuer den Nachweis und die Untersuchung der Eigenschaften von endogenen a-Amylase-Inhibitoren des Getreides erforderlich. Nach dem Verfahren wird ein CaCl2-haltiger waeszriger Extrakt aus Getreidesamen, in dem sich die keimungsspezifische a-Amylase befindet, nach Dialyse und Lyophilisierung in CaCl2-Loesung geloest und zur Inaktivierung der b-Amylase 10 min auf etwa 70C erhitzt. Nach Abkuehlung wird mit Aceton versetzt und zentrifugiert. Der UEberstand wird mit Weizen- oder Roggenstaerke behandelt und anschlieszend die keimungsspezifische a-Amylase mit einer Pufferloesung aus der a-amylasehaltigen Staerke eluiert.{keimungsspezifische a-Amylase; a-Amylaseisolierung; Roggen-a-Amylase; endogene a-Amylase-Inhibitoren; a-amylasehaltiger Staerkekomplex}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von keimungsspezifischer α-Amylase aus Getreide, vorzugsweise Roggen. Die keimungsspezifische α-Amylase ist speziell für den Nachweis und die Untersuchung der Eigenschaften von endogenen u-Amylase-lnhibitoren des Getreides erforderlich.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Keimungsspezifische α-Amylase ist für die I 'ntersuchung der Auswuchsempfindlichkeit von Getreide von wesentlicher Bedeutung.

Dieses Merkmal ist besonders bei Roggen von Interesse, da seine Auswuchsempfindlichkeit hoch ist. Das Gebiet der Züchtung auswuchsfester Roggenspezies wird seit langem bearbeitet.

Es setzt Kenntnisse über Bildung und Eigenschaften der keimungsspezifischen α-Amylase und ihrer Inhibitoren voraus, da bei der Züchtung von Getreide beide Komponenten als Marker Bedeutung besitzen.

Aus der Literatur (ZOYTER, A. und M.SCHRAMM: Biochem. Biophys. Acta 65 [1962] 200-206) ist bekannt, daß α-Amylase an Stärke adsorbiert werden kann. Die spezifische Bindung eines Enzyms an das unlösliche Substrat ist als üblicher Reinigungsschritt anzusehen. Daher ist die Adsorption von α-Amylase an Stärkegranuli viele Jahre als Isolationsschritt angewendet worden. Nach Literaturangaben hat die Methode Nachteile dadurch, daß die Stärkegranuli komplexe Aggregate darstellen, die weder rein noch homogen sind. Ferner hängt die Adsorption von der Oberfläche des Stärkegranula ab und nicht von der Gesamtstärkemenge. Dadurch werden relativ große Mengen an Adsorbens benötigt. Weiterhin ist die Stöchiometrie des gebildeten Komplexes der Bestimmung nicht zugänglich.

In der neueren Literatur wird zur spezifischer, Fällung von α-Amylase Glycogen aus Schalentieren eingesetzt (SILVANOVICH und HILL, Cereal Chemistry 54 [1977J1270 und MAC GREGOR, A.W., J. Inst. Brew. 83 [1977] 100).

Ferner wird die affinitätschromatographische Gewinnung aus Rohextrakter durch cycloheptaamylose-substituierte Sepharose 6 B empfohlen. Die Isolierung keimungsspezifischor α-Amylase aus Roggen wird im Gegensatz zu den anderen Getreidearten durch die Anwesenheit einer relativ großen Menge von löslichen Schleimstoffen erschwert. Nach unseren Erfahrungen ist die Affinitätschromatographie zur Isolierung keimungsspezifischer α-Amylase aus Rohextrakt für Roggen nicht geeignet.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Anreicherung der keimungsspezifischen α-Amylase aus Roggen mit einem hohen Reinigungsgrad, frei von ß-Amylase und möglichst geringem Anteil der sogenannten grünen α-Amylase.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolierung von keimungsspezifischer α-Amylase aus Getreide, vorzugsweise Roggen, durch Extraktion von gekeimten Getreidesamen, wird ein CoCI₂-haltiger wäßriger Extrakt aus gekeimtem Getreidesamen, vorzugsweise Roggen, in dem sich die keimungsspezifische a-Amylase befindet, nach Dialyse und Lyophilisierung in CaCI₂-Lösung gelöst und zur Inaktivierung der ß-Amylase 10min auf otwa 70°C erhitzt. Danach wird abgekühlt und mit Aceton bis zu einer Konzentration von 30VoI.-% versetzt, anschließend zentrifugiert, der Überstand mit Weizen- oder Roggenstärka behandelt und die a-amylasehaltige Stärke mit einer Pufferlösung behandelt und dabei die α-Amylase eluiort. Es wurde nämlich gefunden, daß keimungsspezifische α-Amylase aus Roggen an Weizenstärke und Roggenstärke gut gebunden wild, während Stärken anderer Herkunft, z. B. Kartoffel- und Maisstärke, sich wesentlich schlechter dafür eignen (Tab. 1). Überraschenderweise stellte sich bei Elektropherogrammen heraus, daß sich Jas Amylasespektrum zugunsten der keimungsspezifischen a-Amy'ase verschoben hat. Daraus läßt sich eine selektive Bindung der keimungsspezifischen α-Amylase ableiten (vergl. Abb. 1). Durch eine nachfolgende säulenchromatographische Fraktionierung der durch Anlagerung an Stärke gebundenen α-Amylase wurde festgestellt, daß die a-Amylaseaktivität zu mehr als 90% aus der keimungsspezifischen α-Amylase besteht. Man erhält etwa 40% der Enzymaktivität des eingesetzten Roggens bei einem Reinigungsfaktor von 20 (Tab. 2).

Das Präparat ist zur Charakterisierung von Roggen hinsichtlich des Gehaltes an a-Amylase-lnhibitoren und z.B. zur Charakterisierung der Inhibitoren hinsichtlich deren Temperatur- und pH-Wirkungsbereichen geeignet. Wegen des üblicherweise niedrigen Preises für Stärke ist das Verfahren zusätzlich kostengünstiger als die Fällung mit Schalentierglycogen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende Ausführungsbeispiel und die Tab. 1 und Tab. 2 näher öi läuieii.

Ausführungsbeispiel

Beispiel 1.

Etwa 5g dialysierter, lyophilisierter Rohextrakt aus 40g gekelmtem Koggen in 100ml 10"³M CaCI₂ gelöst, etwa 6000 Einh. a-Amylase enthaltend (Tablettentest pH5,5), werden zur Inaktivierung von ß-Amylase 10min auf 7O⁰C erhitzt und anschließend schnell auf 20⁰C abgekühlt. Die Losung wird mit Aceton auf eine Acetonkonzentration von 30 Vol.-% gebracht und die entstandene Trübung abzentrifugiert. Zum Überstand gibt man unter Rühren 20g Weizenin oder Roggenstärke und läßt unter gelegentlichem Rühren 1 h im Kühlschrank stehen. Danach wird zentrifugiert (Kühlzentrifuge). Die feuchte a-amylasehaltige Stärke wird mit 30 ml Pufferlösung (0,2 η Natriumazetat und 0,1 η CaCI₂,1:4 mit dest. Wasser verdünnt) versetzt, 40min mit einem Magnetrührer langsam gerührt und die Aufschlämmung erneut zentrifugiert. Aus dem Überstand wird die a-Amylase mit Ethanol boi einer Konzentration von 80% gefällt. Das Präparat wird in wenig Wasser gelöst und lyophilisiert.

Tabelle 1

Isolierung von a-Amylase aus dlalyslertem Roggenmalzextrakt durch Adsorption an verschiedene Stärken

	a-Amylase	isoliert E (Aktivitätseinheiten)	%
Stärke	eingesetzt E (Aktivitätseinheiten)	2 304,3 2 734,9 3985,8 4718,8	32,3 38,3 55,7 66,0
Kartoffelstärke Maisstärke Roggenstärke Weizenstärke	7150,0 7150,0 7150,0 7150,0
Tabelle 2 Reinigung von keimungsspezifischer α	•Amylase aus Roggen

Reinigungsstufe	Menge	mg/g	Protein	Ausbeute	Amylaseaktivität	E/g	E	Aus	spez. Aktivität	Reini
	bzw.	Präp.				bzw.	gesamt	beute		gungs-
	Ausbeute		mg		Präp.			E/mg	faktor
			gesamt	[%]			l%)	Protein
		38,25		100	255	25 500	100
	Ig)
1. Roggen, ge	100	176,0	3825	56	1726	21062	82,6	6,53	_
keimt
2. Roggenmalz-	12,2	75,2	2147,2	2,0	9979	10224	40,1	9,8	1,5
dialysat
3. spez. Anla	1,0245	76,8			133	20,3
gerungen Stärke

Claims (1)

1. Verfahren zur Isolierung von keimungsspezifischer α-Amylase aus Getreide, vorzugsweise Rogqen, durch Extraktion von gekeimten Getreidesamen, dadurch gekennzeichnet, daß ein CaCI₂-haltiger wäßriger Extrakt aus Getreidesamen, vorzugsweise Roggen, in dem sich die keimungsspezifische α-Amylase befindet, nach Dialyse und Lyophilisierung in CaCI₂-Lösung gelöst und zur Inaktivierung der ß-Amylase 10 min auf etwa 70⁰C erhitzt, danach abgekühlt und mit Aceton bis zu einer Konzentration von 30 Vol.-% Aceton versetzt wird, anschließend zentrifugiert, der Überstand mit Weizen- oder Roggonstärke behandelt und die a-amylasehaltige Stärke mit einer Pufferlösung behandelt und dabei die α-Amylase eluiert wird.

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