DE2843351A1

DE2843351A1 - Neue pectinesterase, verfahren zu deren herstellung und verfahren zur herstellung von demethoxiliertem pectin unter verwendung der neuen pectinesterase

Info

Publication number: DE2843351A1
Application number: DE19782843351
Authority: DE
Inventors: Shigetaka Ishii; Keiichi Kiho; Hiroshi Sugimoto; Shinichi Sugiyama
Original assignee: Kikkoman Shoyu KK
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1977-10-08
Filing date: 1978-10-04
Publication date: 1979-04-12
Also published as: DE2843351C3; US4200694A; FR2405263A1; DE2843351B2; FR2405263B1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Pectinesterase, die erhältlich ist unter Verwendung eines Schimmelpilzes der Gattung Aspergillus, Penicillium, Fusarium oder Sclerotinia. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der neuen Pectinesterase. Weiterhin betrifft die Erfindung ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von demethoxiliertem Pectin mit einem gleichmässigen Methoxygruppengehalt unter Verwendung der erwähnten Pectinesterase.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältliche Pectinesterase ist ein neues Enzym, das sich von den bisher bekannten Pectinesterasen wesentlich darin unterscheidet, dass es die

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Methylester-Bindung des Pectins statistisch hydrolysiert.

Pectin ist ein Polysaccharid, das man in Pflanzen, wie Früchten, Gemüse und dergleichen, findet. Es ist eine wasserlösliche, farblose, geschmacklose, geruchlose, amorphe Substanz, deren Hauptstruktur eine lange Kettensequenz aus o>-1,4-Bindungen von D-Galacturonsäure-Einheiten ist, deren Carboxylgruppen zum Teil unter Bildung von Methoxygruppen (-OCHo) verestert sind. Eine Pectinlösung ist viskos und bildet beim Erhitzen zusammen mit Zucker und Säure unter geeigneten Bedingungen und anschliessendem Kühlen einen Gel, so dass es seit langem als Geliermittel bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, wie Gelee, Orangeade, Marmelade und dergleichen sowie als. Emulgiermittel oder Verdickungsmittel verwendet wurde.

Wenn die Carboxylgruppen vom Pectinmolekül vollständig unter Ausbildung des Methylesters verestert sind, hat das Pectin einen Methoxygruppengehalt von 16,32 %. Hinsichtlich des Gelierungsmechanismus wird Pectin entsprechend dem Gehalt an Methoxygruppen in zwei Typen unterteilt. Pectine mit 7 % oder mehr Methoxygruppen werden als "Hoch-Methoxypectiri¹ bezeichnet, während man Pectine mit weniger als 7 % Methoxygruppen als "Niedrig-Methoxypectin" bezeichnet. Ein Gel eines Hoch-Methoxypectins hat Wasserstoffbindungen, während ein Gel eines Niedrig-Methoxypectins Ionenbindungen aufweist.

Das seither verwendete Pectin ist gewöhnlich ein Hoch-Methoxypectin. Bei dessen Gelierung wird sowohl Zucker in einer Menge von 6o % oder mehr und eine geeignete Menge einer Säure benötigt. Ausserdem muss man die Gelierbedingungen sorgfältig überwachen, und der Geliervorgang ist darum recht kompliziert. Andererseits benötigt man zum Gelieren eines Niedrig-Methoxypectins nicht in jedem Fall Zucker und Säure, und die Gelierung

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findet leicht statt in Gegenwart von lediglich Metallionen wie Calciumionen. Dies ermöglicht und erleichtert die Herstellung von Gelees und dergleichen mit niedrigem Zuckergehalt. Ausserdem kann diese Art des Pectins nicht nur als Gelierungsmittel sondern auch als Filmbildungsmittel für Yoghurt, Mayonaisen und dergleichen eingesetzt werden.

Falls das natürliche Hoch-Methoxypectin,das aus Pflanzen, beispielsweise Früchten erhältlich ist, auf irgendeine Weise zu einem Niedrig-Methoxypectin demethoxiliert werden kann, würde der Gelierungsvorgang vereinfacht werden, und das Anwendungsgebiet sich verbreitern. Ausgehend von dieser Vorstellung sind eine Reihe von Verfahren vorgeschlagen worden zu dessen Demethoxilierung. Die bisher bekannten Vorschläge schliessen beispielsweise ein (1) ein Verfahren, bei dem man eine Säure verwendet, (2) ein Verfahren, bei dem man Alkali verwendet, (3) Verfahren, bei denen man ein Enzym verwendet, und (4) ein Verfahren bei dem man Ammoniak verwendet.

Diese Verfahren haben aber alle verschiedene Nachteile. So ist das Verfahren (1) nachteilig deshalb, weil die Demethoxilierungsreaktion zu langsam verläuft und immer zu einem gewissen Ausmass mit einem Abbau des Pectins verbunden ist, wodurch die Gelfestigkeit erheblich vermindert wird. Ausserdem benötigt man bei diesem Verfahren saureresistente Vorrichtungen. Die Verfahrensweise (2), bei der man Alkali, wie Natriumhydroxid, verwendet, ergibt im Vergleich zu der Verwendung von Säure erheblich höhere Reaktionsgeschwindigkeiten für die Demethoxilierung. Aber die Art des Verfahrens (2) bedingt auch, dass gleichzeitig ein Abbau des Pectins stattfindet. Verfahren (3), bei dem die Demethoxilierung unter Verwendung von Pectinesterase erfolgt, einem Enzym, welches die Methoxygruppen des Pectins hydrolysiert,

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scheint ideal insofern zu sein, als die Demethoxilierung unter milden Bedingungen ohne Abbau des Pectins sehr schnell verläuft. Ein erheblicher Nachteil dieses Verfahrens besteht aber darin, dass das Niedrig-Methoxypectin, das nach diesem Verfahren erhältlich ist, immer sehr schlechte Gelbildungsfähigkeiten aufweist.

Deshalb besteht zur Zeit die Tendenz, die Demethoxilierung von Pectin durch das Ammoniakverfahren (4) vorzunehmen. Aber auch dieses Verfahren ist noch nachteilig, weil ein Abbau des Pectins in einem gewissen Ausmass unvermeidlich ist, und weil das nach diesem Verfahren erhaltene Niedrig-Methoxypectins eine beachtliche Menge an neugebildeten Amidgruppen enthält, und weil diese Verfahren erhebliche Mengen an Ammoniak benötigen, dessen Beseitigung ein weiteres Problem aufwirft.

Die Erfindung geht von der Überlegung aus, dass ein enzymatisches Verfahren grundsätzlich die beste Verfahrensweise ist, um unter milden Bedingungen, ohne Abbau des Pectins ein Niedrig-Methoxypectin mit der Fähigkeit einen festen Gel zu bilden, zu erhalten.

Das bisher zum Hydrolysieren der Methylester-Bindung von Pectin verwendete Enzym, nämlich Pectinesterase (nachfolgend als PE bezeichnet) hat die spezifische Wirkung, dass das Enzym zunächst an einer gewissen spezifischen Stellung der Methoxygruppe im Pectinmolekül angreift und dann nach und nach seine Wirkung entwickelt, wie in dem Aufsatz von Hill (Food Technol. 3^, 9o (1949)) beschrieben wird. Bei der Einwirkung von PE auf Hocn-Methoxypectin kann ein bestirrnites Molekül in erheblichem Masse auf das Niveau eines Niedrig-Methoxypectins demethoxiliert werden, während ein anderes Pectinmolekül vollständig oder nahezu vollständig intakt bleibt. D.h. mit anderen Worten, dass

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das Ausmass der Demethoxilierung nicht gleichmässig in den Pectinmolekülen verläuft. Wirkt beispielsweise PE auf ein Hoch-Methoxypectin mit einem Methoxygehalt von 1o % ein, unter Ausbildung, eines Niedrig-Methoxypectins mit einem Methoxygehalt von 5 %, so kann man im Extremfall ein Produkt erhalten, das eine 1:1 Mischung aus Molekülen darstellt, welche 0% Methoxygruppen aufweisen und Molekülen die 1o % Methoxygruppen aufweisen, was insgesamt einen durchschnittlichen Methoxygruppengehalt von 5 % ergibt. Diese grosse Breite im Methoxygruppengehalt der Moleküle ist wahrscheinlich der Hauptgrund für die niedrigen Gelbildungseigenschaften von Niedrig-Methoxypectinen, die mittels der bisher bekannten PE hergestellt wurden. .

Die Erfinder haben infolge dessen überlegt, dass man bei Verwendung einer PE, welche statistisch auf die Methoxygruppen des Pectins einwirkt, wie Säuren, Alkali oder Ammoniak, das also eine spezifische Wirkung dahingehend aufweist, dass es die Methylester-Bindung in Pectinmolekülen statistisch hydrolysiert, und das nicht die -=i-1,4-Bindungen von D-Galacturonsäure abbaut, ein Pectin erhältlich wäre, das einen gleichmässigen und ausreichend verminderten Methoxygruppengehalt aufweist, also ein Niedrig-Methoxypectin wäre, das die Fähigkeit hat, einen festen Gel zu bilden. Von diesen Überlegungen ausgehend wurde nach neuen Mikrobenstämmen gesucht, die in der Lage sind, eine neue PE herzustellen, welche die vorerwähnte spezifische Wirkung hat. Es wurde nun gefunden, dass man eine neue PE erhält, welche statistisch die Methylester-Bindung im Pectin hydrolysiert, wenn man eine Schimmelpilzstamm vom Genus Aspergillus, Genus Penicillium, Genus Fusarium oder Genus Sclerotinia auf den üblichen festen oder flüssigen Medien kultiviert, und dass diese.neue PE bei der Zugabe zu Pectin durch ein enzymatisches Verfahren ein demethoxiliertes Pectin ergibt, das die

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Fähigkeit hat, einen festen Gel zu bilden und einen gleichmassigen Methoxygruppengehalt aufweist.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, eine neue Pectinesterase und ein neues Verfahren zu deren Herstellung zu zeigen.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung eines demethoxilierten Pectins, das einen gleichmässigen Methoxygruppengehalt aufweist, aufzuzeigen, bei dem man die neue Pectinesterase zu Pectin zusetzt.

Diese Aufgaben und die Vorteile der Erfindung werden nachfolgend näher erläutert.

Die Erfindung betrifft eine neue Pectinesterase und ein Verfahren zu deren Herstellung und ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Schimmelpilzstamm vom Genus Aspergillus, Genus Penicillium, Genus Fusarium oder Genus Sclerotinia, welche die Fähigkeit haben, eine neue Pectinesterase zu bilden, die statistisch die Methylester-Bindung von Pectin hydrolysiert, kultiviert, worauf man anschliessend die neue Pectinesterase aus der Kultur isoliert. Gemäss der Erfindung wird ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von demethoxiliertem Pectin gezeigt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die neue Pectinesterase zu Pectin gibt, dadurch statistisch die Methylester-Bindung des Pectins hydrolysiert und so ein demethoxiliertes Pectin erhält, welches einen gleichmässigen Methoxygruppengehalt aufweist.

In Fig. T wird ein Säulenchromatogramm auf einer DEAE-Sephadex-A-5o-Säule des gemäss Beispiel 1 erhaltenen Enzyms gezeigt.

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In Fig. 2 wird das SE-Sephadex-Säulenchromatograinin gezeigt des erfindungsgemassen Enzyms, wie es nach Beispiel 1 erhalten wurde. Fig. 3 zeigt die Eluierungskurve des Enzyms, das erfindungsgemäss gemäss Beispiel 1 erhalten wurde bei einer präparativen Scheibenelektrophorese.

Nachfolgend werden die enzymatischen und physikochemisehen Eigenschaften der neuen, erfindungsgemäss hergestellten PE angegeben.

(1) Wirkungsweise und Substratspezifität; Das Enzym wirkt auf die Enzymesterbildung von Pectin ein und hydrolysiert diese statistisch. Seine Wirkungsweise ist spezifisch auf die Methylester-Bindung im Pectin und inert gegenüber Äthylester-, Propylester- und Äthylenglycolester-Bindungen.

(2) Optimaler pH für die Wirkungsweise und stabiler pH-Bereich: Der optimale pH-Bereich für die Wirkungsweise ist etwa

4,5 und der stabile pH-Bereich liegt bei 3 bis 6.

(3) Messung der Aktivität:

Die Aktivität der neuen PE kann wie folgt gemessen werden: 1 ml Enzymlösung, gelöst in o,o5 m.Acetatpuffer (pH 4,5) wird mit 1 ml einer 1 %-igen Lösung eines handelsüblichen Pectins der gleichen Pufferlösung wie vorher erwähnt gelöst und bei 3o C Io Min. inkubiert,und dann wird die Reaktion durch Eingiessen der Reaktionsmischung in 2n H₃SO₄ abgebrochen. Das Reaktionsgemisch enthält das während der Demethoxilierung des Pectins gebildete Methanol. Das Methanol wird mit Kaliumpermanganat oxidiert und mit Pentan-2,4-dion und Ammoniak umgesetzt und dann wird die Absorption bei 412 ran bewertet. Eine Enzymaktivität, die eine Absorption von o,84 in einer Reaktionszeit von 1 Min. zeigt, wird als

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eine Einheit angesehen.

(4) Bereich der optimalen Reaktionstemperatur:

Die optimale Reaktionstemperatur liegt im Bereich von 25 bis 5o°C, insbesondere 4o bis 45°C.

(5) Inaktivierungs-pH und Temperatur:

Das Enzym verliert seine Aktivität vollständig bei einer 1o minütigen Behandlung bei 6o°C. Es verliert auch die Aktivität bei einem pH unterhalb 2 oder oberhalb 8.

(6) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung:

++ ++ +
Es wird durch Hg , Cu und Ag inhibiert. Es wurden keine spezifischen Aktivatoren und Stabilisatoren gefunden,

(7) Molekulargewicht:

Das Enzym hat ein Molekulargewicht von35.ooo in o,1 m Ammoniumacetat-Pufferlösung bei 4°C und pH 5,o, gemessen durch Gelfiltrationsmethode mit Sephadex G-1oo (Handelsnahme, hergestellt von der Pharmacia Co., Schweden), nach dem Verfahren von Andrews (P. Andresw: Biochem.J., 96, 595 (1965)).

(8) Es ist ein saures Protein mit einem isoelektrischen Punkt von PI 4,1.

In Tabelle 1 wird das erfindungsgemässe Enzym mit der bisher bekannten PE verglichen.

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Tabelle 1

	Substrats- spezifität	PE gemäss der Erfindung	PE aus Tomaten	PE aus Chlostridium
	K_m-Wert	Es ist spezifisch gegen über der Methylester-Bin dung von Pectin und hydro lysiert die Methylester- ,Bindung statistisch	Die Hydrolyse von Pec· tinmethylester be ginnt an einer bestimrti- ten spezifischen Po sition und verläuft dann nach und nach	multifermentance ^_n
	Molekulargewicht	3,2 χ 1o~³ m	4 χ Io m	T⁴-
	optimaler Ph	35.OOO	-	Die Hydrolyse beginnt an der reduzierenden Endgruppe des Pectin- moleküls·
909815/	optimale Reak·- tionstemperatur	4,5	6-9	2,5 χ 1o~³ m
ο co	' Aktivator(en)	4o bis. 45°C	-	4OO.OOO
-J -J	Inaktivierungs- temperatur	keine	ο,ο m CaCl₂ o,o5 m NaCl	9,ο
	Inhibitor(en)	6o C während 1o Min.	-	25 - 35°C
	Hg ,Cu , Ag	Polygalacturonsäure	o,o5 m NaCl
	38°C während 3o Min.
	-

f 1: Das Enzym wird in Biochem, T_, 4oo5-4o1o (1968) erwähnt.

/ 2: Das Enzym wird in Bacteriol, 1o2, 72-78 (197o) und 1o3, 595-6oo (197o) erwähnt.

-P-CO CO

Wie vorher erwähnt, unterscheiden sich die neuen gemäss der Erfindung erhältlichen Enzyme von allen bekannten PE hinsichtlich der enzymatischen und physikochemischen Eigenschaften, so dass man das Enzym als ein neues Enzym ansehen kann.

Nachfolgend wird die Herstellung des neuen Enzyms gemäss der Erfindung näher beschrieben.

Die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen sind Schimmelpilzstämme, die zum Genus Äspergillus, Genus Penicillium, Genus Furasium oder Genus Sclerotinia gehören, und die die Fähigkeit haben, die neue PE zu bilden. Konkrete Beispiele für den Schimmelpilzstamm der zum Genus Äspergillus gehört, sind Äspergillus japonicus Nr. 1744 ACTT 2o236, und Äspergillus niger ATCC 1o15. Ein konkretes Beispiel für einen Schimmelpilzstamm vom Genus Penicillium ist Penicillium chrysogenum ATCC 1o1o7. Ein konkretes Beispiel für einen Schimmelpilzstamm vom Genus Fusarium ist Fusarium oxysporum ATCC 15653, und konkrete Beispiele für Schimmelpilzstamme vom Genus Sclerotinia sind Sclerotinia archidis IFO 5291, Sclerotinia libertiana ATCC 2oo25 und dergleichen. Alle diese Stämme können von den Organisationen, bei denen diese Stämme hinterlegt wurden, bezogen werden.

Die Schimmelpilzstämme, die gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind jedoch nicht auf die vorher angebenen beschränkt und alle Schimmelpilze vom Genus Aspergillus Genus Penicillium, Genus Fusarium oder Genus Sclerotinia, die gleichzeitig die Fähigkeit haben, die neue PE zu bilden, können erfindungsgemäss verwendet werden.

Die Schimmelpilzstamme mit der Fähigkeit, ein Enzym zu bilden, welches statistisch die Methylester-Bindung von Pectin

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hydrolysiert, können entweder auf festen oder flüssigen Medien in der für die Kultivierung von Schimmelpilzen üblichen Weise gewonnen werden.

Als Nährmedium für die Medien kann man eine Vielzahl von Substanzen verwenden, wie sie üblicherweise bei der Kultivierung von Mikroorganismen verwendet werden.

Als Kohlenstoffquelle kommen alle Kohlenstoffverbindungen, die assimilierbar sind, infrage oder Substanzen, welche solche Kohlenstoffverbindungen enthalten. Beispiele für solche Kohlenstoff quellen schliessen ein einzeln oder in Mischung Weizen, Weizenkleie, Glucose, Sucrose, Stärke, Maltose, Dextrin, Glycerin und dergleichen. Als Stickstoffquelle können alle verwertbaren Stickstoffverbindungen oder alle Substanzen, welche solche Stickstoffverbindungen enthalten, verwendet werden. Beispiele für solche Stickstoffquellen schliessen einzeln oder als Gemische ein Sojabohnenmehl, Sojaschrot, entfettes Sojabohnenmehl, Weizengluten, Pepton, Fleischextrakt, Milchkasein, Maismaische, Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid. Auch anorganische Salze, wie solche des Phosphors, Kaliums, Magnesium, Calciums und dergleichen, können verwendet werden. Ausserdem können auch einzeln oder in Kombination organische oder anorganische Substanzen, die für das Wachstum der Mikroorganismen oder bei der Herstellung von Enzymen erforderlich sind, gegebenenfall zu dem Medium gegeben werden.

Im Falle einer Festkultur kann ein geeignetes festes Medium, wie Weizenkleie,mit 0,6 Volumenteilen Wasser befeuchtet werden, worauf man dann 15 Min. bei 12o°C autoklavisiert. Dann wird mit einem Saatpilz inokuliert und die Kultivierung während 3 bis 5 Tagen vorgenommen. Die kultivierte Weizenkleie, die

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man so erhält, wird dann mit einer geeigneten Menge (beispielsweise dem 6-fachen ihres Gewichtes) Wasser bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren während einer geeigneten Zeit extrahiert. Das Extrakt wird dann mit Diatomeenerde filtriert oder zentrifugiert, wobei man ein durchsichtiges Extrakt gewinnt.

Bei einer Flüssigkultur wird ein Nährmedium, das sich aus einer geeigneten Kombination der vorher erwähnten Kohlenstoff quellen, Stickstoffquellen und anorgansichen Salzen zusammensetzt, beispielsweise ein Medium aus Wasser, Glucose, Pepton, Ammoniumsulfat, Hefeextrakt, KH₂PO^ und dergleichen, auf einen pH von 5 bis 7 eingestellt, unter den gleichen Bedingungen wie das feste Medium sterilisiert, mit einem Saatschimmelpilz inokuliert und dann kultiviert. Obwohl man die Kultivierung nach jeder geeigneten Kulturmethode durchführen kann, wie einer Stehkultur, Schüttelkultur, Rührkultur, Belüftungskultur und dergleichen, sind untergetauchte Kulturen mit einer ausreichenden Belüftung und Rühren bevorzugt im Falle von Grossansätzen.

Die Kultivierungstemperatur kann in einem Bereich variiert werden, welcher das Wachstum des enzymbildenden Schimmelpilzes und die Bildung des Enzyms ermöglicht. Vorzugsweise liegt die Temperatur zwischen 2o und 4o C.

Obwohl die Kultivierungszeit von der Art des verwendeten Schimmelpilzes und der Art der Kultur abhängt, liegt sie im allgemeinen bei 1 bis 5 Tagen. Es ist bevorzugt, dass die Kultivierung dann abgebrochen wird, wenn die angesammelte Menge an Enzym gerade ihr Maximum erreicht hat.

Die so erhaltene KuItürbrühe,in welcher sich das Enzym

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gebildet und angesammelt hat, wird dann zentrifugiert oder mit Diatomeenerdafiltriert, um unlösliche Substanzen einschliesslich Mycele zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit oder das so erhaltene Filtrat wird dann unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder dergleichen ausgesalzen, wobei man einen Niederschlag gewinnt, den man mit einem Celluloserohr gegen eine geeignete wässrige Lösung dialysiert,und dann wird gefriergetrocknet, wobei man ein rohes Enzympulver erhält. Man kann auch die überstehende Flüssigkeit oder das Filtrat der Kultur mit einem organischen Lösungsmittel ausfällen, wie mit Alkohol oder Aceton, wobei man einen Niederschlag erhält, den man dann im Vakuum trocknet unter Ausbildung eines rohen Enzympulvers.

Erhält man den Enzymniederschlag aus der wässrigen Extraktlösung durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, so ist er erhältlich mit einer 7o bis 80 %-igen Ammoniumsulfatsättigung im Falle von Aspergillus japonicus Nr. 1744 ATCC 2o236, während man eine 65 bis 85 %-ige Ammoniumsulfatsättigung benötigt bei Verwendung der anderen Stämme. Wird der Enzymniederschlag durch Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel gewonnen, so ist er erhältlich bei einer Alkoholkonzentration oder Acetonkonzentration von 5o bis 75 %.

Das so erhaltene rohe Enzympulver wird anschliessend in ein gereinigtes Enzym überführt unter Anwendung von verschiedenen Verfahren, wie Ionenaustauschharz-Chromatografie (beispielsweise Amberlite IRC-5o) Gelfiltration über Sephadex (beispielsweise Sephadex G-I00, Sephadex G-2oo oder dergleichen) Ionenaustausch-Chromatografie über Ionenaustausch-Sephadex (beispielsweise DEAE Sephadex A-5o, QAE Sephadex A-5o, SE Sephadex oder dergleichen), (Sephadex ist ein Handelsname und wird von der Pharmacia Fine Chemicals, Schweden hergestellt. Die Hauptstruktur von Sephadex setzt sich aus Dextran zusammen.),

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isoelektrische Fraktionierung unter Verwendung von Ämpholine (Handelsname der LKB, Schweden), Elektrophorese auf Acetatmembranen, Stärke- oder Acrylamidgelen, isoelektrische Ausfällung und dergleichen, oder durch eine geeignete Kombination dieser Verfahren.

Die erfindungsgemäss erhältliche PE kann 'in einfacher Weise von der bekannten PE unterschieden werden. Man lässt die PE auf ein Hoch-Methoxypectin einwirken unter Bildung eines Niedrig-Methoxypectins und dann fraktioniert man das Niedrig-Methoxypectin, das man durch Säulenchromatografie erhalten hat über einen Ionenaustauscher, wie DEAE-Cellulose. Bei diesem Verfahren werden Pectine mit einem höheren Methoxygruppengehalt zuerst eluiert und anschliessend folgt die Elution der Pectine mit-.niedrigem . Methoxygehalt. Wenn die Pectinkonzentration im Eluat nacheinander gemessen wird, ist leicht ersichtlich, dass die Pectinmoleküle gleichmässig sind hinsichtlich ihres Methoxygruppengeha-ltes . Man kann infolge dessen die Wirkungsspezifität der verwendeten PE unterscheiden.

Bei der vorher erwähnten DEAE-Cellulose-Chromatografie stellt man fest, dass die Moleküle des mit der neuen PE gemäss der Erfindung erhaltenen Niedrig-Methoxypectins nahezu vollständig gleichmässig hinsichtlich des Methoxygruppengehaltes sind. Um die Verteilung der Methoxygruppen im Pectinmolekül weiter zu untersuchen, liess man Endopolygalacturonase, ein Enzym, welches in der Lage ist, die o(,--1,4-Glycosid-Bindung der Pectinsäure statistisch zu hydrolysieren, auf ein Niedrig-Methoxypectin mit einem Methoxygruppengehalt von 6,3 %, welches mit der neuen PE gemäss der Erfindung hergestellt worden war, einwirken. Nach dem Eliminieren der Methoxygruppen aus dem Hydrolysat wurde anschliessend ein Teil des Hydrolysates in das Oligomer der Galacturonsäure durch Verseifen mit Alkali überführt. Die beiden Oligouronid-Proben, die man so erhielt, wurden fraktioniert in der Reihenfolge des Grades der Galacturonsäure-Polymerisation

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mittels einer DEAE-Cellulose-Säulenchromatografie nach dem Verfahren von Hatanaka et al. (J. Agric. Chexn. Soc.Japan , Ao, 98 (1966)), und-der Grad der Polymerisation und Methoxygehaltes der Fraktionen wurde untersucht. Es wurde dabei festgestellt, das 9o % oder mehr des mit der neuen PE gemäss der Erfindung hergestellten Niedrig-Methoxypectins abgebaut wurde zu niedrigmolekulargewichtigen Substanzen aus 5 oder weniger Galacturonsäureeinheiten durch die Einwirkung der Endopolygalacturonase.

Dieses Ergebnis zeigt an, dass das erfindungsgemässe PE-Enzym statistisch auf das Pectin einwirkt und statistisch dessen Methoxygruppen hydrolysiert.

Anschliessend werden die Verfahren gezeigt, mit denen man die erfindungsgemässe PE auf Pectin einwirken lassen kann, nämlich Verfahren zum statistischen Hydrolysieren der Methylester-Bindung von Pectin mit PE gemäss der Erfindung. Folgende Verfahren sind hierzu geeignet:

(1) Ein Verfahren, bei dem man eine PE-Lösung gemäss der Erfindung direkt auf das Pflanzenmaterial, wie auf Obstschalen, aufträgt bevor man das Pectin daraus extrahiert.

(2) Indem man das PE gemäss der Erfindung auf das Pflanzenmaterial während der Extraktion des Pectins aus diesem Material gibt,

(3) indem man das PE gemäss der Erfindung auf das aus dem Pflanzenmaterial extrahierte Pectin gibt.

Die Bedingungen für die Wirkung der erfindungsgemässen PE werden nachfolgend gezeigt. Der bevorzugte pH-Bereich liegt bei 3 bis 6 und der bevorzugte Temperaturbereich bei 3o bis 5o C. Obwohl die Einwirkungszeit unter Berücksichtigung der Konzentration des Pectins, der Konzentration des Enzyms und dem

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beabsichtigten Methoxygruppengehalt gewählt werden muss, liegt jedoch im allgemeinen bei 1 bis Io h und vorzugsweise 1 bis 4 h.

Vorzugsweise wird die erfindungsgemässe PE dem Pectin in einer menge von 7o bis 1oo,ug, ausgedrückt als Enzymprotein pro 1 g Pectin, zugegeben. Wenn die beabsichtigte Verminderung des Methoxygruppengehaltes erreicht worden ist, wird die PE durch eine Wärmebehandlung bei 7o bis 1oo°C während etwa 1o Min. inaktiviert und das demethoxylierte Pectin wird aus der Reaktionsmischung in üblicher Weise, wie durch Ausfällen mit Alkohol oder durch Ausfällen mit einem Metallsalz gewonnen. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann man demethoxylierte Pectine mit verschiedenen :. Methoxygruppengehalten sehr schnell,ohne dass ein Abbau des Pectins stattfindet, erhalten. Weiterhin kann man nach dem erfindungsgemässen Verfahren Niedrig-Methoxypectine mit der Fähigkeit, einen festen Gel zu bilden, herstellen. Bei der Bildung eines Pectins mit einem gleichmässigen Methoxygruppengehalt, der so eingestellt werden kann, wie er jeweils benötigt wird, liegt keine Bildung von Amidgruppen vor, wie bei dem vorher erwähnten Ammoniak-Verfahren. Deshalb ist das erfindungsgemässe Verfahren von erheblicher technischer Bedeutung und Fortschrittlichkeit.

Die Herstellung von verschiedenen demethoxylierten Pectinen wird im folgenden Versuch gezeigt.

328 Einheiten PE, die aus einer Kultur von Aspergillus japonicus Nr. 1744 ATCC 2o236 erhalten worden war, wurden zu 1 1 einer 2 %-igen wässrigen Lösung eines Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt 12,1 %) gegeben und bei 3o°C inkubiert. Nach Min., 1 h, 2 h und 4 h wurde das Reaktionsgemisch auf 1oo°C während 1o Min. zum Abbrechen der Enzymreaktion erhitzt und

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- 2ο -

es wurden Pectine mit Methoxygehalten von 1o,5 %, 8,5 %, 7,5 % bzw. 6,3 % erhalten. Zu den jeweils erhaltenen Pectinen wurde Calciumchlorid gegeben und die Festigkeit der erhaltenen Gele wurde mittels eines Curd-Meters (HändeIsnähme, hergestellt von Iio Denki, Japan) gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Methoxy- gruppen- gehalt (%)■	Calziumgehalt	17,9	26,7	2,45	(mg/g Pectin)	43,6	6,48	65,5
1o,5	Gelfestigkeit	5,3o	41,8	(χ 1 o^q Dyη/cm'')	12,7o
8,5	O	1o, 6o	4,71	21 ,2o	6,o9
7,5	1 ,76	21,2o	1o,4o	3o,7o	13,8o
6,3	3,14		21 ,3o		21 ,2o
Ammoniak verfahren	5,29	2o,8o	33,3o	15,6o	26,6o
6.1
2o,6	16,6o	15,1o

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung und sollen keineswegs limitierend ausgelegt werden.

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Beispiel

9o g Weizenkleie wurden mit 72 ml Wasser besprüht und dann in einem Autoklaven während 3o Min. auf 12o°C erhitzt und nach dem Erhitzen mit Aspergillus japonicus Nr. 1744 ATCC 2o236 inokuliert und 45 h bei 3o°C kultiviert.

Die so erhaltene Kultur wurde mit 5oo ml Wasser vermischt, milde bei Raumtemperatur während 2 h gerührt, durch ein Leinentuch filtriert und dann nochmals über Diatomeenerde. Zu 4oo ml der so erhaltenen Extraktlösung wurden 243 g Ammoniumsulfat zum Aussalzen des Enzyms gegeben. Das ausgefallene Enzum wurde durch Zentrifugieren gesammelt, wieder gelöst in o,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,ο) und dann gründlich mit einem Celluloserohr gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert und dann einer Säulenchromatografie über DEAE-Sephadex A-5o unterworfen. Dabei wurde die dialysierte Enzymlösung durch eine Säule (2 cm 0 χ 35 cm),die mit DEAE-Sephadex A-5o gefüllt war, fHessen gelassen. Vorher war die Säule mit o,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,o) equilibriert worden, um das Enzym in der Säule zu adsorbieren. Die Säule wurde mit der gleichen Pufferlösung gründlich gewaschen und dann wurde die Konzentration an Natriumchlorid in der Pufferlösung erhöht, entsprechend dem linearen Elutionsgradienten des Enzyms. Das Eluat wurde in 1o ml aliquote Fraktionen geteilt. Die Fraktionen Nr. 1oo bis 117 (Gesamtvolumen 18o ml), die mit Natriumchloridkonzentrationen zwischen o,21 und o,24 m eluiert worden waren, wurden gesammelt (siehe Fig. 1, welche das Saulenchromatogramm dieses Enzyms über DEAE-Sephades A-5o zeigt), mit einem Celluloserohr dialysiert gegen destilliertes Wasser und dann gefriergetrocknet.

Das getrocknete Produkt wurde nochmals in einer kleinen Menge

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o,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 3,8) gelöst und durch eine Säule 1 cm 0 χ 25 cm) von SE-Sephadex, die vorher mit der gleichen Pufferlösung (pH 3,8) equilibriert worden war, fHessen gelassen, wobei das Enzym in der Säule verblieb und dann wurde das Enzym durch lineare Gradientenelution mit ansteigender Natriumchloridkonzentration in der Pufferlösung eluiert. Alle aliquoten Fraktionen hatten ein Volumen von 1o ml. Die Fraktionen Nr. 21 bis 25 (Gesamtvolumen 5o ml) wurden gesammelt (Fig. 2 zeigt das Säulenchromatogramm dieses Enzyms, über SE-Sephadex), gefriergetrocknet, nochmals in Wasser gelöst und ener Gelfiltration durch eine Sephadex G-1oo-Säule (2 cm 0 χ loo cm) unterworfen.

Man erhielt 18,7 mg des gereinigten Enzyms, das nicht durch irgendein anderes Enzym als der neuen PE gemäss der Erfindung verunreinigt war, und durch ultrazentrifugierung und Elektro phoresa wurde festgestellt, dass es sich um ein homogenes Protein handelt.

Fig. 3 zeigt die Elutionskurve bei einerpräparativen Scheibenelektrophorese des so erhaltenen gereinigten Enzyms.

In einem anderen Ansatz wurde die vorher erwähnte Verfahrensweise wiederholt mit der Ausnahme, dass Aspergillus japonicus Nr. 1744 ATCC 2o236 ersetzt wurde durch Aspergillus niger ACTT 1o15. Man erhielt dabei 12,6 mg des gereinigten Enzyms, das nicht durch ein anderes Enzym verunreinigt war, und das ebenfalls, wie durch ultrazentrifugierung und Elektrophorese festgestellt wurde, ein homogenes Protein war.

Beispiel 2

In einem 1-1-Erlenmeyer-Kolben wurden 2oo ml eines Mediums aus

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o,1 % NH₄NO₃, o,1% KH₃PO₄, o,o5 % MgSO₄ und 1,5 % Pectin gegeben, 3o Min. auf 12o°C erhitzt, mit Penicillium chrysogenum ATCC 1o1o7 inokuliert, und dann 1 Woche bei 25 C einer Schüttelkultur unterworfen mit 14o Bewegungen pro Min. und einer Schütteldistanz von 1o cm. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit Diatomeenerde vermischt und filtriert.

Zum Filtrat wurden 3 Volumenteile kaltes Äthanol gegeben,und die Mischung wurde bei 4 bis 5 C über Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und in einer 2oo ml o,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,o) gelöst. Unlösliche Teile wurden durch Zentrifugieren entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine DEAE-Sephadex-Säule (2 cm 0 χ 35 cm), die vorher mit o,1 m Acetat-Pufferlösung equilibriert worden war, gegeben. Nachdem die Säule gründlich mit dem gleichen Puffer gewaschen worden war, wurde das Enzym einer linearen Gradienteneluxerung mit ansteigenden Konzentrationen von Natriumchlorid in der Pufferlösung unterworfen. Die Fraktionen , die eine Aktivität der neuen PE zeigten, wurden gesammelt und mit einem Celluloserohr gegen o,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,o) dialysiert und anschliessend wurde das dialysierte Produkt nochmals einer Säulenchromatografie über DEAE-Sephadex unter den gleichen Bedingungen wie vorher angegeben unterworfen.

Von den eluierten Fraktionen wurden die Fraktionen, in denen eine Aktivität der neuen PE festgestellt wurde, mit einem Celluloserohr gegen o,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 4,o) dialysiert und auf eine Säule 0 cm 0 χ 25 cm) CM-Cellulose, die vorher mit der gleichen Pufferlösung wie vorher angegeben equilibriert worden war, gegeben. Die Konzentration der Natriumchloridlösung in der Pufferlösung wurde linear für die Gradienteneluierung

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des Enzyms erhöht. Die die Aktivität der neuen PE aufweisenden Fraktionen wurden gesammelt, mit einem Celluloserohr gegen o,o5 m Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,o) dialysiert und dann gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde nochmals in einer geringen Menge o,o5 m Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,o) gelöst, auf eine Sephadex-G-1oo-Säule (2 cm 0 χ 1oo cm), die vorher mit der gleichen Pufferlösung equilibriert worden war, gegeben und dann mit der gleichen Pufferlösung einer Gelfiltration unterworfen.

Die so erhaltenen Fraktionen, welche die Aktivität der neuen PE zeigten, zeigten keine Endopectinaseaktivität und waren unter dem Gesichtspunkt der Proteinchemie homogen.

Tabelle 3 zeigt die Gesamtproteinmenge (mg), die Gesamtaktivität (Einheiten), die spezifische Aktivität (Einheiten/mg) und andere Werte, die man bei dem vorerwähnten Reinigungsverfahren gemessen hatte. Dabei wurde die Gesamtproteinquantität (mg) gemessen nach der Vorschrift in J_._ Biol. Chem. , 193, 265-275 (1951).

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Tabelle 3

co ο co CO

cn

co

	Volumen der Lösung (gi)	Gesamtpro tein (mg)	Gesamtakti vität (Einheiten)	Spezifische Aktivität (Einh./mg)	Ausbeute (%)
Kulturfiltrat	1ooo	68oo	11ooo	1 ,62	1oo
Fraktion ausgefällten mit • Alkohol	2oo	28oo	99oo	3,54	9o
. Fraktion der neuen PE aus der: ersten DEAE-Sephadex-Chro- matografie	15o	7oo	6ooo	8,57	54,5
Fraktion der neuen PE aus .der zweiten DEAE-Sephadex- Chromatografie	1oo	2oo	44oo	22,oo	4o
Fraktion der neuen PE aus der CM-Cellulose-Chromato- .. grafie	8o	7o	26oo	37.1	23,6
. Fraktion der neuen PE aus der Sepahdex G-1oo-Gel~ filtration ^v	5o	4o	19oo	47,5	17,3

to

Ul

K) OO -Ρου co cn

Beispiel

9o g Weizenkleie wurden mit 81 m Leitungswasser besprüht und dann in einem Autoklaven während 3o Min. bei 12o C sterilisiert. Anschliessend wurde mit Sclerotinia archidis IFO 5291 inokuliert und 5 Tage bei 27°C kultiviert.

Zu der erhaltenen Kultur wurden 5oo ml Leitungswasser gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 h gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde mit dem zweifachen Volumen an kaltem Aceton vermischt, und der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und in einem Luftstrom getrocknet. 5o g des rohen Enzyms wurden in 5o ml Wasser gelöst und die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde Ammoniumsulfat bis zu einer o,8 Sättigung gegeben und der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und nochmals in Wasser gelöst und dann in einem Celluloserohr gegen o,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,5) bei 5 C dialysiert. Die innere Lösung der Dialyse wurde auf pH 3,ο eingestellt und dann auf eine Säule aus Amberlite IRC-5o (Rohm und Haas, Co., USA), die vorher mit o,1 m Lactat-Pufferlösung (pH 3,o) equilibriert worden war, gegeben. Die Säule wurde mit der gleichen Pufferlösung gewaschen. Nach dem Entfernen der Verunreinigungen durch Eluierung mit o,2 m Lactat-Pufferlösung (pH 4,o) wurde das Hauptprodukt mit 5oo ml einer o,2 m Lactat-Pufferlösung (pH 5,o) eluiert und es wurden 1oo ml Fraktionen mit einer PE-Aktivität gewonnen. Diese Fraktionen wurden gesammelt und mit einem Celluloserohr gegen o,o2 πι Acetat-Pufferlösung (pH 5,5) dialysiert und dann im Vakuum auf 1o ml konzentriert. Das Konzentrat wurde auf pH 5,5 eingestelt und dann auf eine Säule (2 cm 0 χ 35 cm) von DEAE-Sephadex, die vorher mit o,o2 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,5) equilibriert worden war, gegeben

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und dann wurde die Säule gründlich mit der gleichen Pufferlösung wie vorher gewaschen und das Enzym wurde dann durch lineare Gradienteneluierung mit ansteigender Konzentration an Natriumchlorid in der Pufferlösung eluiert.

Die so erhaltenen Fraktionen, die die Aktivität der neuen PE gemäss der Erfindung zeigten, wurden gesammelt und durch nochmalige Chromatografie in der vorher angegebenen Weise gereinigt und man erhielt dabei die erfindungsgemässe neue PE, welche keine Endopectinase enthielt. In Tabelle 4 wird die Gesamtproteinmenge, die Gesamtaktivität, die spezifische Aktivität und die Ausbeute, die bei dem vorher erwähnten Reinigungsverfahren erzielt wurde, angegeben.

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Tabelle

Volumen der Lösung (ml)

Gesamtprotein
(mg)

Gesamtaktivität (Einheiten)

spezifLsche
Aktivität
(Einh./mg)

Ausbeute

Rohe Extraktlösung

45o

25oo

1,6

1oo

Fraktion ausgefällt durch 0,8 %-ige Sättigung mit Λ (NH₄J₂SO₄

15o

800

3,9

77,5

ep Fraktion der neuen PE bei der

Amberlite IRC-5o Chromato- -t grafie

I00

19o

22oo

,6

55,o

« Fraktion der neuen PE bei der ■M ersten DEAE-Sephadex Chromatografie

80

45

31,1

Fraktion der neuen PE bei der zweiten DEAE-Sephadex Chromatografie

60

12,2

7o,o

32,5

,3

GO GO (Jl

Beispiel 4

In einem 1 1 Erlenmeyer-Kolben wurden 2oo ml eines Mediums vorgelegt, welches 5 % Hefeextrakt (hergestellt von Difco Laboratories, USA) und 3 % Pectin N.V. (Handelsname, Sunkist Growers, USA) enthielt, und das ganze wurde 3o Min. bei 12o°C gekocht und dann mit Fusarium oxysporum ATCC 15653 inokuliert und einer Stehkultur bei 25 C während 4 Wochen unterworfen. Die Kulturflüssigkeit wurde entfernt, 2oo ml des voher erwähnten frischsterilisierten Mediums wurdai zu dem zurückbleibenden Mycelium zugegeben und die Mischung wurde einer Schüttelkultur bei 25 C während 6 Tagen mit 14o Schlagen pro Min. und einer Schlagdistanz von Io ei unterworfen. 1 1 der so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurde mit 2o g Diatomeenerde vermischt und filtriert. Das Filtrat wurde mit einem Celluloserohr gegen destilliertes Wasser bei 5°C während 16h dialysiert und dann gefriergetrocknet. Das dabei erhaltene Pulver wurde nochmals in einer geringen Menge Wasser aufgelöst und die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf pH 6,ο eingestellt und durch eine zuvor mit o,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,o) equilibrierte DEAE-Sephadex A-25-Säule (2 cm 0 χ 35 cm) gegeben. Die nichtadsorbierten Fraktionen, also die Fraktionen, welche eine Aktivität der neuen PE zeigten, wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde in 2 ml einer o,o5 m Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,o) gelöst, unlösliche Anteile wurden durch Zentrifugieren entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Säule aus Sephadex G-75 gegeben und mit der gleichen Pufferlösung eluiert, und die Fraktionen, die die Aktivität der neuen PE zeigten, wurden gesammelt und gefriergetrocknet.

Das getrocknete Produkt wurde in einer kleinen Menge einer

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ο,ο5 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,ο) gelöst und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine zuvor mit der gleichen Pufferlösung wie vorher equilibrierten Säule aus CM-Sephadex C-5o gegeben, und die Säule wurde gründlich mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und anschliessend wurde eine lineare Gradientenelution mit ansteigender Konzentration an Natriumchlorid in der Pufferlösung durchgeführt. Die Fraktionen, welche eine Aktivität der neuen PE zeigten, wurden gesammelt, gefriergetrocknet, in einer geringen Menge Wasser gelöst und auf eine Säule von CM-Cellulose, die zuvor mit o,o5 m Acetat-Pufferlösung (pH 3,8) equilibriert worden war, gegeben. Dann wurde wiederum eine lineare Gradientenelution mit ansteigender Konzentration an Natriumchlorid in der Pufferlösung durchgeführt und man erhielt die neue PE, die frei von Endopectinaseaktivität war.

In Tabelle 5 wird die Gesamtaktivität, die spezifische Aktivität und die Ausbeute, die man nach dem oben beschriebenen Reinigungsverfahren erhält, gezeigt.

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Tabelle 5

co ο co

cn ■**·■ ο co

	Volumen der Lösung (ml)	Gesamtpro tein (mg)	Gesamtakti vität (Einheiten)	Spezifische Aktivität (Einh./mcj)	Ausbeute (%)
Kulturfiltrat	1ooo	25o	65oo	26	1oo
nicht-adsorbierte Fraktion in DEAE-Sephadex A-25 Chromatografie;	1oo	24	263o	11o	4o
Fraktion der neuen PE aus der Sephadex G-75 Chromato grafie	5o	19	222o	117	34
Fraktion der neuen PE aus der CM-Sephadex C-5o Chromatografie	1oo	11	2o5o	186	32
• Fraktion der neuen PE aus der CM-Cellulose-Chromato- grafie	4o	2,4	475	198	7

co

oo

OJ GO cn

Beispiel 5

In 1oo 1 Wasser wruden 4 kg eines Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt: 12,1 %) gelöst und zu der so erhaltenen Pectinlösung wurden 41oo Einheiten einer gereinigten PE, erhalten nach dem Verfahren nach Beispiel 1, gegeben. Die Mischung wurde 2 h bei 3o C inkubiert, dann wurde das Enzym durch Behandlung der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 1o Min. inaktiviert. Zu der Mischung wurde zum Ausfällen des Pectins ein gleiches Volumen Äthanol gegeben, und das ausgefallene Pectin wurde durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum getrocknet. Es wurden 3,6 kg Pectin mit einem Methoxygruppengehalt von 1o,6 % erhalten.

Beispiel 6

Zu 2 kg eines Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt:12,1 %) wurden 41oo Einheiten einer gereinigten PE, erhalten nach dem Verfahren gemäass Beispiel 1 gegeben. Die weitere Verfahrensweise war die gleiche wie in Beispiel 5. Es wurden 1,8 kg eines Pectins mit einem Methoxygruppengehalt von 6,8 % erhalten.

Beispiel 7

Zu 3o 1 Wasser wurden 1 kg Mandarinenschalen gegeben. Nachdem der pH der Suspension mit Chlorwasserstoffsäure auf 2,5 eingestellt worden war, wurde ein Hoch-Methoxypectin durch Rühren der Suspension bei 9o C während 1 h extrahiert. Nach dem Abkühlen wurde der pH der Suspension auf 4,ο mit einer verdünnten Natriummethoxidlösung eingestellt und dazu wurden 5ooo Einheiten einer gereinigten PE, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1, gegeben. Die Mischung wurde 2 h bei 4o°C inkubiert und anschliessend wurde das Enzym durch Behandeln der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 1o Min. inaktiviert. Es wurde dann*

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über Diatoraeenerde filtriert, wobei man ein transparentes Piltrat gewann, das mit dem doppelten Volumen Äthanol vermischt wurde. Der Niederschlag wurde gewonnen und im Vakuum getrocknet, wobei man 96 g eines Niedrig-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt : 6,3%) erhielt.

Beispiel 8

In einem Schüttelkolben wurden 5o ml Anteile eines Mediums eingebracht, welches 1 % Weizenkleie und o,5 % Pectin enthielt, und die Mischung wurde in einem Autoklaven während 15 Min. bei 12o°C sterilisiert und dann mit Penicillium chrysogenum ATCC 1o1o7 inokuliert und 3 Tage bei 3o°C kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Mycele durch Zentrifugieren abgetrennt und zu 5oo ml der überstehenden Lösung wurden zum aussalzen des Enzyms 3oo g Ammoniumsulfat gegeben. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und wieder in Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf pH 6,5 mit o,1 η NaOH eingestellt und 1 h bei 4o°C stehen gelassen. Durch diese Behandlung wurden die verunreinigenden, wertlosen Enzyme nahezu vollständig inaktiviert. Dagegen war die PE vollständig intakt.

Zu 5o ml einer 2 %-igen wässrigen Lösung von Hoch-Methoxypectin (Methoxygruppengehalt:13,6 %) wurden 55 Einheiten einer nach der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise erhaltenen PE gegeben und das Ganze wurde 2 h bei 3o°C inkubiert. Dann wurde das Enzym durch Behandlung der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 1o Min. inaktiviert und anschliessend wurden 1oo ml Äthanol zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt, in Vakuum getrocknet, wobei man 8,8 g eines Niedrig-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt 6,8 %) erhielt.

§09815/097?

Beispiel 9

Auf 9o g Weizenkleie wurden 81 ml Leitungswasser gesprüht und das Ganze wurde in einem Autoklaven 3o Min. bei 12o°C erhitzt, dann mit Fusarium oxysporum ATCC 15653 inokuliert und 7 Tage bei 26 C kultiviert. Zu der Kulturbrühe wurden 5o ml Wasser gegeben und die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann durch ein Baumwolltuch filtriert und anschliessend mit Diatomeenerde filtriert. Bei Raumtemperatur wurden 4oo ml der so erhaltenen Extraktlösung 2 h mit 1,5 g DEA-Sephadex A-5o gerührt. Das DEAE-Sephadex, welches das Enzym adsorbierte, wurde durch Filtrieren gesammelt und mit 5o ml einer o,5 m Natriumchloridlösung wurde die PE eluiert.

1oo Einheiten der vorstehend erhaltenen PE wurden zu 5o ml einer 2 %-igen wässrigen Lösung eines Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt: 13,6%) gegeben und 4 h bei 3o°C inkubiert. Dann wurde das Enzym durch Behandeln der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 1o Min. inaktiviert und anschliessend wurden 1oo ml Äthanol zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde gewonnen und im Vakuum getrocknet, wobei man 8,7 g Niedrig-Methoxypectin (Methoxygruppengehalt: 5,3%) erhielt.

Beispiel 1o

Eine Mischung aus 1oo g Weizenkleie und 2o g Reiskleie wurde mit 11o ml Leitungswasser besprüht und 3o Min. in einem Autoklaven bei 12o°C erhitzt. Die Mischung wurde mit Sclerotinia libertiana ATCC 2oo25 inokuliert und 5 Tage bei 26°C kultiviert. Zu der erhaltenen Kulturbrühe wurden 6oo ml Wasser gegeben und die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt, durch ein Baumwolltuch filtriert und dann wurde das Filtrat zentrifugiert. Zu

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5oo ml der überstehenden Lösung wurden 266 g Ammoniumsulfat zum Aussalzen des Enzyms gegeben. Das ausgesalzene Enzym wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in o,o2 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,5) gelöst und dann ausreichend mit einem Celluloserohr gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert. Die innere Lösung der Dialyse wurde durch eine chromatografische Säule (2 cm 0 χ 33 cm) von DEAE-Sephadex A-5o gegeben und daraus wurde PE mit o,o2 m Acetat-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend o,2 m Natriumchlorid, eluiert.

Zu 5o ml einer 2 %-igen wässrigen Lösung eines Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt 13,6%) wurden 5o Einheiten der so erhaltenen PE gegeben und das Ganze wurde 1 h bei 3o C inkubiert. Dann wurde das Enzym durch Behandeln der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 1o Min. inaktiviert und anschliessend wurden 1oo m Äthanol zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde gewonnen und im Vakuum getrocknet, wobei man 8,5 g eines Pectins mit einem Methoxygruppengehalt von 9,2 % erhielt.

Θ09815/0977

e e r s e

it

Claims

Neue Pectinesterase, Verfahren zu deren Herstellung und Verfahren zur Herstellung von demethoxilxertem Pectin unter Verwendung der neuen Pectinesterase Patentansprüche

1. Eine neue Pectinesterase mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften:

(1) Einwirkung auf die Methylester-Bindung von Pectin unter statistischer Hydrolyse der Methylester-Bindung; Spezifität auf die Methylester-Bindung des Pectins und ohne Aktivität auf Äthylester-, Propylester- und Äthylenglycolester-Bindungen;

(2) einem optimalen pH-Wert für die Reaktivität von etwa 4,5 und einer Stabilität im pH-Bereich von 3 bis 6;

(3) einer Wirkungstemperatur im Bereich von 25 bis 5o C, insbesondere 4o bis 45°C;

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6o C während 1ο Min. oder bei einem pH-Wert unterhalb 2 (5) Inhibierung durch Hg , Cu und Ag ; ein spezieller Akti-

(4) vollständigem Aktivitätsverlust durch Wärmebehandlung bei 6o°C während 1o ]
oder oberhalb 8;
Inhibierung durc]
vator oder Stabilisator ist nicht bekannt;

(6) einem Molekulargewicht von 35.ooo gemessen bei 4°C in o,1 m Ammoniumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5, ο;

(7) dass sie ein saures Protein ist mit einem isoelektrischen Punkt von PI 4,1.

2. Verfahren zur Herstellung einer neuen Pectinesterase dadurch gekennzeichnet, dass man in einem Medium einen Schimmelpilzstamm vom Genus Aspergillus, Genus Penicillium, Genus Fusarium oder Genus Sclerotinia, der die Fähigkeit hat, die neue Pectinesterase zu bilden, die die Methylester-Bindung von Pectin statistisch hydrolysiert, kultiviert, worauf man anschliessend die neue Pectinesterase aus der Kultur gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Schimmelpilzstamm mit der Fähigkeit, die neue Pectinesterase zu bilden, Aspergillus japonicus No 1744 ATCC 2o236, Aspergillus niger ATCC 1o15, Penicillium chrysogenum ATCC 1o1o7, Fusarium oxysporum ATCC 15653, Sclerotinia archidis IFO 5291 oder Sclerotinia libertiana ATCC 2oo25 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass die Kultivierung 1 bis 5 Tage bei 2o bis 4o°C durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält.

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6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ein festes Medium ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ein flüssiges Medium ist.

8. ' Enzymatischer Verfahren zur Herstellung von dimethoxiliertem Pectin, dadurch gekennzeichnet , dass man zu einem Pectin ein Enzym gibt, welches die Methylester-Bindung des Pectins statistisch hydrolysiert, dass man damit die Methylester-Bindung des Pectins hydrolysiert und so ein demethoxiliertes Pectin mit einem gleichmässigen Methoxygruppengehalt gewinnt.

9. Verfahren zur Herstellung von dimethoxiliertem Pectin gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass das Enzym, welches statistisch die Methylester-Bindung des Pectins hydrolysiert, eine Kultur ist, die selbst durch Kultivierung in einem Medium eines Schimmelpilzstammes vom Genus Aspergillus, Genus Penicillium, Genus Fusarium oder Genus Sclerotinia erhältlich ist, welche die Fähigkeit haben, das erwähnte Enzym zu bilden,oder dass das Enzym ein rohes Enzym oder ein daraus erhältiches reines Enzym ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Methylester-Bindung des Pectins bei einem pH-Wert von 3 bis 6 bei einer Temperatur von 25 bis 5o°C während 1 bis 1o h, vorzugsweise 1 bis 4 h, hydrolysiert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in einer Menge von 7o bis 1oo/ug, ausgedrückt als Enzymprotein pro 1 g Pectin, gegeben wird.

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