DE3851022T2

DE3851022T2 - Verfahren zur Herstellung von verzweigten Fructo-Oligosacchariden.

Info

Publication number: DE3851022T2
Application number: DE3851022T
Authority: DE
Inventors: Seishiro Kainuma; Taizo Miwa; Masayoshi Muramatsu; Teruo Nakakuki
Original assignee: Japan Maize Products Co Ltd
Current assignee: Japan Maize Products Co Ltd
Priority date: 1987-09-04
Filing date: 1988-09-05
Publication date: 1994-11-24
Anticipated expiration: 2008-09-06
Also published as: DE3851022D1; JP2806522B2; JPS6463389A; ATE109797T1; EP0307158B1; EP0307158A2; EP0307158A3; US5334516A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren, das Mikroorganismen oder ein Enzym, das von Mikroorganismen produziert ist, die zur Gattung Aspergillus gehören, einsetzt, zur Herstellung von verzweigten Fructo-Oligosacchariden mit einer spezifischen Struktur, unter Verwendung von Saccharose als Rohmaterial.
Die physiologische Aktivität, die Fructo-Oligosaccharide besitzen, hat kürzlich besonderes Interesse erlangt ["Kagaku to Seibutsu" (Chemistry and Biology), Vol. 21, S. 291]. Zum Beispiel sind Fructo-Oligosaccharide schwierig zu verdauen und werden selektiv von nützlicher Darmflora, Lactobacillus bifidus im besonderen, genutzt, wodurch die Vermehrung dieser Organismen gefördert wird und die Laxation und dergleichen verbessert wird. Zusätzlich werden, wenn Fructo-Oligosaccharide von Lactobacillus bifidus abgebaut werden, organische Säuren produziert. Von diesen ist erkannt worden, daß sie die Wirkung haben, Cholesterinspiegel im Körper zu senken.
Fructo-Oligosaccharide werden durch die Wirkung einer Fructose-Transferase (Fructosyl-Transferase) auf Saccharose gebildet. Mikroorganismen, von denen bekannt ist, daß sie Fructose- Transferasen bilden, schließen Hefe, Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, etc. ein. Zusätzlich können, wie bereits früher von den Erfindern gezeigt worden ist, Fructo-Oligosaccharide auch unter Verwendung von Fructose-Transferase, die von Aspergillus sydowi produziert wird, effektiv produziert werden [siehe TOKKYO-KOKAI-KOHO (Veröffentlichung nach 18 Monaten der ungeprüften Patentanmeldung) SHOWA 61(1986)-187797 (hier im weiteren als TOKKAISHO 61-187797 bezeichnet)].
Diese Fructose-Transferasen wirkten jedoch auf Saccharose und bildeten entweder Fructo-Oligosaccharide mit einer Struktur, in der mehrere Fructosen über β-1,2-Bindungen an den Fructoserest von Saccharose gebunden sind, oder bildeten höhermolekulares Polyfructan, das aus denselben Bindungen bestand. Beispiele für Zucker, die unter Verwendung der Fructose-Transferase erhalten werden, die von Mikroorganismen produziert wird, wie denjenigen, die oben angegeben sind, und mit anderen Strukturen, als diese haben, sind bisher noch nicht berichtet worden.
Umgekehrt ist es bekannt, daß verschiedene Fructo-Oligosaccharide von verschiedenen Pflanzen produziert werden ("Kagaku to Seibutsu", Vol. 18, S. 674). Es ist berichtet worden, daß nicht-reduzierende Fructose-Polymere mit einem Polymerisationsgrad von 3-15 insbesondere in den Vorratswurzeln von Spargel vorkommen, und ihre Strukturen sind aufgeklärt worden [N. Shiomi, J. Yamada & M. Izawa, Agric. Biol. Chem., 40, 567 (1976), 43, 1375 (1979), 43, 2233 (1979)]. Die in den Vorratswurzeln von Spargel gefundenen Fructo-Oligosaccharide haben eine Struktur, in der Fructose an sowohl den Glucoserest als auch den Fructoserest von Saccharose gebunden ist, was zu der Struktur in einer verzweigten Form führt. Fructo-Oligosaccharide mit diesen Strukturen wurden nicht unter den Fructo-Oligosacchariden gefunden, die unter Verwendung von Mikroorganismen gebildet werden.
Das Ziel dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von verzweigten Fructo-Oligosacchariden bereitzustellen, so daß es möglich ist, Fructo-Oligosaccharide, die im wesentlichen identisch mit natürlich auftretenden verzweigten Fructo-Oligosacchariden sind, von denen bisher bekannt ist, daß sie nur in höheren Pflanzen vorkommen, industriell unter Verwendung mikrobieller Enzyme zu produzieren.
Wie zuvor angegeben, ist nunmehr, obgleich die Erfinder früher gezeigt haben, daß Fructo-Oligosaccharide, wie etwa 1-Ketose und Nystose, in denen Fructose durch β-1,2-Bindungen am Fructoserest von Saccharose gebunden ist, unter Verwendung der Mycele von Aspergillus sydowi erhalten werden können, als ein Ergebnis daran anschließender Forschung festgestellt worden, daß verzweigte Fructo-Oligosaccharide, in denen Fructose an sowohl die Glucosereste als auch die Fructosereste von Saccharose gebunden ist, gleichzeitig mit den obigen Fructo-Oligosacchariden unter denselben Reaktionsbedingungen erhalten werden können.
Zusammengefaßt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von verzweigten Fructo-Oligosacchariden von Formel A bereit.
(worin m=0-11, n=1-8 und 3 ≤ m+n ≤ 12)
wobei besagtes Verfahren den Schritt umfaßt, daß eine Saccharoselösung mit dem Mycel eines Fructose-Transferase-produzierenden Mikroorganismus der Gattung Aspergillus oder mit einem Fructose-Transferase-Enzym, das aus besagtem Organismus hergestellt ist, behandelt wird.
Obgleich jedes Mitglied der Gattung Aspergillus, das die Fähigkeit besitzt, Fructose-Transferase zu produzieren, als der Mikroorganismus, der in dieser Erfindung verwendet wird, befriedigend wäre, ist Aspergillus sydowi besonders bevorzugt. Beispiele für verwendete Vorratstypen von Aspergillus sydowi schließen IAM 2544, IAM 2514, IAM 2078 und IAM 2009 ein (von denen alle Type Culture Collection Numbers vom Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo, sind).
Gemäß dieser Erfindung ist es möglich, unter Verwendung der Nycele von Mikroorganismen oder des aus solchen Nycelen hergestellten Enzyms in einem industriellen Maßstab verzweigte Fructo-Oligosaccharide zu produzieren, die bisher nur aus höheren Pflanzen, wie etwa den Vorratswurzeln von Spargel bekannt waren. Da die verzweigten Fructo-Oligosaccharide, die erhalten werden, eine Struktur besitzen, die im wesentlichen identisch mit den oben genannten natürlich auftretenden verzweigten Fructo-Oligosacchariden ist, haben sie zusätzlich einen hohen Grad an Sicherheit, wenn sie zu Nahrungsmittelprodukten zugesetzt werden. Außerdem wird erwartet, daß diese verzweigten Fructo-Oligosaccharide verschiedene Wirkungen im Hinblick auf ihre physiologische Aktivität zeigen, einschließlich der Förderung der Vermehrung von Lactobacillus bifidus im Darm von Menschen, wodurch die Laxation verbessert wird.
Obgleich entweder ein festes oder flüssiges Medium als das Wachstumsmedium für Aspergillus sydowi, den in dieser Erfindung verwendeten Mikroorganismus, verwendet werden kann, ist im Falle eines flüssigen Mediums ein Medium, das die folgenden Bestandteile enthält, besonders bevorzugt.
Glucose 10% (W/V)
Cornsteep-Lösung 2%
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,1%
KH&sub2;PO&sub4; 0,2%
pH = 6, 0
Aspergillus sydowi wird in das Medium eingeimpft, das oben beschrieben ist, und unter aeroben Bedingungen durch zum Beispiel eine Rüttelkultur unter Verwendung eines Drehrüttlers, etc., oder eine Bewegungs-Belüftungs-Kultur unter Verwendung eines Topffermenters, etc. inkubiert. Eine Inkubationstemperatur von ungefähr 30ºC ist geeignet.
Wenn der Organismus für mehrere Tage unter diesen Bedingungen inkubiert wird, wird eine große Anzahl von Mycelen von Aspergillus sydowi gebildet und die Inkubation wird zu diesem Zeitpunkt beendet. Die Mycele werden dann mit Hilfe von Zentrifugation und Filtration gesammelt. Nach Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung werden die Mycele unter Verwendung von Lyophilisation haltbar gemacht. Außerdem können im Falle der Verwendung eines Mikroorganismus, der zu einer anderen Aspergillus-Gattung gehört als Aspergillus sydowi, die Mycele dieses Mikroorganismus unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens, wie das oben beschriebene, erhalten werden.
In dieser Erfindung werden verzweigte Fructo-Oligosaccharide produziert, indem Saccharose unter Verwendung der Mycele eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Fructose-Transferase zu produzieren und zur Gattung Aspergillus gehört, oder der Enzyme, die aus den Mycelen derselben hergestellt sind, behandelt wird, wobei die Mycele unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens erhalten werden.
Obgleich die Mycele in ihrer natürlichen Form verwendet werden können, ist es auch möglich, Mycele zu verwenden, die immobilisiert worden sind, zum Beispiel in Alginat, Acrylamidgel, Polyvinylalkoholgel, photovernetzendem Harz, Carrageenan, Chitosan oder Gelatine. Außerdem können die Mycele auch mit Glutaraldehyd und dergleichen behandelt werden, um die Trägerfestigkeit zu erhöhen. Wenn nicht-immobilisierte Mycele verwendet werden, ist es notwendig, die Saccharosebehandlung unter Verwendung von Batch-Verfahren durchzuführen, immobilisierte Mycele können jedoch auf eine Säule aufgebracht werden und kontinuierlich zugeführt werden, was es ermöglicht, daß die Reaktion effizienter durchgeführt werden kann als mit Batch- Verfahren. Zusätzlich werden, wenn Enzym verwendet werden soll, das aus den Mycelen hergestellt worden ist, die Mycele homogenisiert und eine Enzymlösung wird extrahiert. Diese Enzymlösung kann dann verwendet werden, nach weiterer Reinigung, falls erforderlich. Zusätzlich kann das Enzym, das erhalten wird, auch auf einem geeigneten Träger immobilisiert verwendet werden.
Ein pH von 5,0-7,0 ist wünschenswert und ein pH von 5,5-6,5 ist optimal für Enzymreaktionsbedingungen zur Bildung von verzweigten Fructo-Oligosacchariden Eine Temperatur von 30-70ºC ist wünschenswert und eine Temperatur von 40-60ºC ist sogar noch wünschenswerter für die Temperaturbedingungen. Die Saccharosekonzentration, die für das Rohmaterial verwendet wird, sollte 30-80% (W/V) betragen, am bevorzugtesten 50-80% (W/V). Zusätzlich sollte die Menge an Fructose-Transferase, die zu diesem Zeitpunkt eingesetzt wird, 5 Einheiten oder mehr pro 1 g feste Saccharose betragen. Eine Einheit ist hier definiert als die Enzymmenge, die 1 umol des Fructoserestes von Saccharose zu einem anderen Saccharosemolekül oder zu einem verzweigten Fructo-Oligosaccharid in 1 Minute bei pH 6,0 und 60ºC bei einer Substratkonzentration von 50% (W/V) Saccharose in Lösung überführen wird.
Nach Filtration, unter Verwendung zum Beispiel eines Membranfilters, Entionisierung und Entfärbung der so erhaltenen Reaktionslösung kann die Lösung konzentriert und in einen Sirup oder durch Sprühtrocknung in ein Pulver überführt werden. Außerdem können, obgleich die Reaktionslösung insgesamt 30-50% (W/W) Glucose, Fructose und nicht-umgesetzte Saccharose zusätzlich zu den Fructo-Oligosacchariden enthält, diese durch entweder Gelfiltration unter Verwendung von "Bio-Gel" (Warenzeichen; hergestellt von Bio-Rad Co., Ltd.) oder "Toyopearl HW40" (Warenzeichen; hergestellt von Toyo Soda Kogyo Co., Ltd.) oder durch stark saure Kationenaustauschharz-Säulenchromatographie entfernt werden. Es ist auch möglich, nur verzweigtes Fructo-Oligosaccharid in hoher Reinheit zu erhalten, indem das verzweigte Fructo-Oligosaccharid von Fructo-Oligosacchariden, wie etwa 1-Ketose und Nystose, unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie des oben beschriebenen, abgetrennt wird.
Wie zuvor in der allgemeinen Strukturformel (A) angegeben, ist das verzweigte Fructo-Oligosaccharid, das mit dieser Erfindung erhalten wird, ein Oligosaccharid mit einem Polymerisationsgrad von 6 oder mehr mit 1-11 Fructoseeinheiten, gebunden an den Glucoserest eines Saccharosemoleküls, und 1-9 Fructoseeinheiten, gebunden an den Fructoserest. Dieses verzweigte Fructo-Oligosaccharid besitzt eine Struktur, die im wesentlichen dieselbe ist wie diejenige von natürlich auf tretendem Fructo-Oligosaccharid, das in den Vorratswurzeln von Spargel enthalten ist, und besitzt einen extrem hohen Grad an Sicherheit irrt Hinblick auf seine Verwendung als ein Nahrungsmittelzusatz.
In derselben Art und Weise wie bei herkömmlichen Fructo-Oligosaccharide wird erwartet, daß das verzweigte Fructo-Oligosaccharid, das mit dieser Erfindung erhalten wird, die Wirkung besitzt, die Vermehrung von Lactobacillus bifidus im Darm von Menschen zu fördern, wodurch die Laxation verbessert wird. Zusätzlich sind, da die Ergebnisse von Blutzucker-Belastungstests gezeigt haben, daß die Fructo-Oligosaccharide, da sie nicht von Verdauungsenzymen im Körper hydrolysiert werden, nicht die Blutzuckerspiegel erhöhen, Anwendungen für Diabetes- Patienten ebenfalls in Betracht gezogen worden. Überdies ist auch erkannt worden, daß die verzweigten Fructo-Oligosaccharide so wirken, daß sie Cholesterin und neutrale Fettspiegel im Blut und der Leber verringern.
Produktformen des verzweigten Fructo-Oligosaccharids, das mit dieser Erfindung erhalten wird, schließen Gesundheitsnahrungsprodukte in der Form eines durch Sprühtrocknung hergestellten Pulvers und einer konzentrierten Flüssigkeit sowie die Verwendung als ein Zusatzstoff in anderen Lebensmitteln, wie etwa Brot und Keksen, ein.

Beispiel 1

100 ml des oben angegebenen flüssigen Mediums (pH 6,0) wurden in einen Sakaguchi-Kolben gegeben und Aspergillus sydowi IAM 2544 (Type Culture Collection Number vom Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo) wurde in das Medium von einer Schrägplatte eingeimpft. Dies wurde dann mit einem Vibratorrüttler für 5 Tage bei 30ºC kultiviert. Die Organismen wurden durch Zentrifugieren der Kulturflüssigkeit gesammelt und würden nach mehrmaligem Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung lyophilisiert und Tests unterzogen.
Glucose 10% (W/V)
Cornsteep-Lösung 2%
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,1%
KH&sub2;PO&sub4; 0,2%
pH = 6, 0
Als nächstes wurden 5 Einheiten der obigen Mycele pro 1 g fester Saccharose zu einer 50% (W/V) Saccharoselösung (pH 6,0) zugegeben. Unter Rühren bei einer Temperatur von 50ºC ließ man die Lösung für 2 Tage reagieren. Anschließend wurde, nach Entfernen der Mycele durch Filtration, jede der Fructo-Oligosaccharide durch Kohlenstoff-Säulenchromatographie in Fraktionen aufgetrennt. Diese Fraktionen wurden dann durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von "Toyopearl HW40S" (Warenzeichen; hergestellt von Toyo Soda Kogyo Co., Ltd.) gereinigt, um Fructo-Oligosaccharide hoher Reinheit zu erhalten, die eine Reihe von Polymerisationsgraden besitzen.
Die Reihe von Fructo-Oligosacchariden, die so erhalten wurde, wurde unter Verwendung von 0,1 N Salzsäure oder Invertase hydrolysiert, um die entsprechenden Molverhältnisse von Glucose und Fructose zu bestimmen. Die Ergebnisse hiervon sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 (Molverhältnisse von Glucose und Fructose im Anschluß an die Hydrolyse der gebildeten Fructo-Oligosaccharide) HCl-Hydrolyse Invertase-Hydrolyse Glucose Fructose
(In der Tabelle bezeichnet G Glucose und F bezeichnet Fructose.)
Wie in Tabelle 1 angegeben, ging der Anstieg im Molverhältnis von Fructose einher mit dem Anstieg im Polymerisationsgrad, unabhängig davon, welches Hydrolyseverfahren verwendet wurde. Es ist daher vermutet worden, daß die Struktur dieser Fructo- Oligosaccharide derart ist, daß Fructose über β-Fructofuranosid-Bindungen an Saccharose gebunden ist.
Anschließend, nach Methylierung dieser Fructo-Oligosaccharide mit dem bekannten Verfahren von Hakomori, wurden sie mit Säure hydrolysiert, gefolgt von einer Reduktion zu Glucitolacetaten. Diese Glucitolacetate wurden dann durch Kapillargaschromatographie analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 (Molverhältnisse von permethylierten Glucitolacetaten) 2,3,4,6-Tetramethyl 2,3,4-Trimethyl 3,4-Dimethyl
Wie in Tabelle 2 für die Verhältnisse der Peakflächen der permethylierten Zucker, die erhalten wurden, angegeben, war das Verhältnis von 2,3,4-TMG : 1,3,4,6-TMG : 3,4,6-TMG 1 : 2 : n-2 für GFn=5-12 im Gegensatz zu dem Verhältnis von 2,3,4,6-TMG 1,3,4,6-TMG : 3,4,6-TMG das 1 : 1: n-1 für GFn=2-4 betrug. Auf dieser Basis wurde deutlich, daß unter den Fructo-Oligosacchariden, die erhalten wurden, GFn=2-4 Fructo-Oligosaccharide waren, die die durch die allgemeine Strukturformel (B) unten angegebene Struktur besitzen, und GFn=5-12 verzweigte Fructo- Oligosaccharide waren, die die durch die allgemeine Strukturformel (A), die oben dargestellt ist, angegebene Struktur besitzen.
(In der obigen Formel, n = 1-3.)
Wie bisher gezeigt worden ist, ist es deutlich, daß die Fructo-Oligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad von 6 oder mehr, die erhalten werden, indem man die Mycele von Aspergillus sydowi auf Saccharose wirken läßt, neue verzweigte Fructo- Oligosaccharide sind. Obgleich diese verzweigten Fructo-Oligosaccharide diejenigen sind, die in den Vorratswurzeln von Spargel, einer höheren Pflanze, angetroffen werden, sind diese die ersten, die als Fructo-Oligosaccharide gefunden worden sind, die durch Mikroorganismen produziert wurden.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde eine Untersuchung über die Wirkungen von Substratkonzentration, zugegebener Menge an Mycelen und Reaktionstemperatur auf die Produktion von verzweigten Fructo- Oligosacchariden unter Verwendung der lyophilisierten Mycele, die in Beispiel 1 erhalten wurden, durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Tabellen 3 bis 5 dargestellt. Wie man in den Tabellen sehen kann, ist eine Konzentration von Saccharose, dem Substrat, von 30% (W/V) oder mehr bevorzugt. Im Hinblick auf die Menge an Mycel-Enzym, das zugegeben wird, ist ein Minimum von 5 Einheiten pro 1 g feste. Saccharose bevorzugt. Zusätzlich wurde auch bestimmt, daß eine Reaktionstemperatur von 40-60ºC günstige Ergebnisse lieferte. Tabelle 3 (Die Wirkung der Saccharosekonzentration auf die Fructo-Oligosaccharid-Bildung) Saccharose-Konz. in Substrat-Lsg. (%) Zusammensetzung der gebildeten Zucker (%) Saccarose Glucose Fructose

Reaktionsbedingungen:

Mycele mit 5 Einheiten pro 1 g feste Saccharose an Transferaseaktivität wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Saccharoselösungen (pH 6,0) bei 50ºC für 88 Stunden zur Reaktion gebracht.

GF&sub5;&submin;&sub1;&sub2;:

Bezeichnet verzweigte Fructo-Oligosaccharide (mit der allgemeinen Strukturformel A) mit 4-11 mit Saccharose verknüpfter Fructose.

GF&sub2;&submin;&sub4;:

Bezeichnet Fructo-Oligosaccharide (mit der allgemeinen Strukturformel B) mit 1-3 mit Saccharose verknüpfter Fructose. Tabelle 4 (Die Wirkung der Menge von zugesetztem Mycel-Enzym auf die Fructo-Oligosaccharid-Bildung) Menge an Mycel-Enzym, die zu Saccharose-Lsg. zugesetzt wird (Einheit/g) Saccharose Glucose Fructose

Reaktionsbedingungen:

Verschiedene Konzentrationen von Mycel-Enzym (Fructose-Transferase) wurden mit 50%iger Saccharoselösung (pH 6,0) bei 60ºC für 48 Stunden zur Reaktion gebracht. Tabelle 5 (Die Wirkung der Reaktionstemperatur auf die Fructo-Oligosaccharid-Bildung) Reaktionstemp. (ºC) Zusammensetzung der gebildeten Zucker (%) Saccharose Glucose Fructose

Reaktionsbedingungen:

Mycele mit 5 Einheiten Fructose-Transferase-Enzymaktivität pro 1 g fester Saccharose wurden mit 50%iger Saccharoselösung (pH 6,0) bei verschiedenen Temperaturbedingungen für 88 Stunden zur Reaktion gebracht.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung von verzweigten Fructo-Oligosacchariden von Formel A

(worin m = 0-11, n = 1-8 und 3 ≤ m+n ≤ 12)

wobei besagtes Verfahren den Schritt umfaßt, daß eine Saccharoselösung mit dem Mycel eines Fructose-Transferase-produzierenden Mikroorganismus der Gattung Aspergillus oder mit einem Fructose-Transferase-Enzym, das aus besagtem Organismus hergestellt ist, behandelt wird.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagter Mikroorganismus Aspergillus sydowi ist.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei besagter Mikroorganismus oder besagtes Enzym in immobilisierter Form vorliegt.

4. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei besagtes Fructose-Transferase-Enzym im Mycel oder in der Enzymzubereitung aus besagtem Mikroorganismus in einer Konzentration von wenigstens 5 Einheiten pro Gramm Saccharose zugeführt wird.

5. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches den (die) weiteren Schritt(e) umfaßt, daß die resultierende Reaktionslösung wenigstens einer der folgenden Behandlungen unterzogen wird: Filtration, Entionisierung, Entfärbung und Konzentration.

6. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das den weiteren Schritt umfaßt, daß verzweigtes Fructo-Oligosaccharid aus der resultierenden Reaktionslösung unter Verwendung von Gelfiltrations- oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt wird.

7. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, welches den weiteren Schritt umfaßt, daß verzweigte Fructo-Oligosaccharide von Formel A von anderen Fructo-Oligosacchariden durch Chromatographie abgetrennt werden.

8. Eine Verbindung von Formel A, wie definiert in Anspruch 1, die im wesentlichen frei von Verunreinigungen pflanzlichen Ursprungs ist.