KR100458151B1 - 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하는 신규 미생물 및 이를이용하여 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을생산하는 방법 - Google Patents
프락토실 트랜스퍼라제를 생산하는 신규 미생물 및 이를이용하여 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을생산하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하는 신규 미생물 및 이를 이용하여 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하여 자당을 하기 화학식 1의 프락토올리고당과 하기 화학식 2의 네오프락토올리고당으로 분해하는 토양 유래 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P 및 상기 미생물을 이용하여 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을 생산하는 방법에 관한 것이다.
<화학식 1>
G: 글루코스, F: 프락토스
<화학식 2>
G: 글루코스, F: 프락토스
Description
본 발명은 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하는 신규 미생물 및 이를 이용하여 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하여 자당을 하기 화학식 1의 프락토올리고당과 하기 화학식 2의 네오프락토올리고당으로 분해하는 토양 유래 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P 및 상기 미생물을 이용하여 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을 생산하는 방법에 관한 것이다.
<화학식 1>
G: 글루코스, F: 프락토스
<화학식 2>
G: 글루코스, F: 프락토스
프락토올리고당은 수크로스(sucrose)에 프락토오스(fructose) 1 내지 3분자가 β-(2,1) 결합하여, 1-케스토스(1-Kestose GF2), 니스토스(Nystose GF3) 및 프락토실 니스토스(Fructosyl nystose GF4)로 이루어진 올리고당으로서 아스파라거스, 양파, 돼지감자, 벌꿀 등에 널리 분포되어 있다. 프락토올리고당은 기존에 알려진 올리고당과 함께 기능성 저칼로리, 유산균과 비피더스균 등의 증식인자, 장내 세균총의 개선, 유해균 성장 억제, 배변성질 개선, 면역력 강화 등의 기능성으로 현재 식·음료, 제과, 건강식품 등에 널리 적용되고 있으며, 특히 DFA Ⅲ(Difructose anhydride Ⅲ)와 병용하였을 때 칼슘 흡수 효과가 가장 우수하다고 보고된 바 있다(일본 특허 제 11-43438호). 미국특허 제 5,827,526호는 하루 0.5 내지 5g의 프락토올리고당을 섭취하면 설사가 억제효과가 있다고 개시하고 있으며, 대한민국 특허공개 제 2000-57520호는 프락토올리고당과 갈락토올리고당을 여러 식용성분과 혼합한 물질로 생산하였을 때, 다른 올리고당보다 장내 흐름을 양호한 상태로 개선하여 정장효과를 효과적으로 발현한다고 개시하고 있다. 또한 프락토올리고당은 인체 장내 세균 중 락토바실러스 비피더스(Lactobacillus bifidus)의 증식을 유도하여 배변활동에 탁월하며, 섭취시 혈당량에 영향을 주지 않고, 소화효소에 의해 분해가 되지 않아 당뇨병 환자식으로 응용하기 위한 연구가 활발히 고려되고 있다. 더불어 혈액 내 및 간에서의 콜레스테롤을 감소시키는 작용도 밝혀지고 있어 이에 대한 연구 또한 진행 중에 있다.
종래 프락토올리고당을 생산하는 방법으로는 프락토실 트랜스퍼라제(Fructosyl transferase)를 생산하는 미생물을 이용한 방법이 있다. 예를 들면, 오레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 페니실리움 속 균주(Penicillium sp.) 또는 푸사리움 속 균주(Fusarium sp.)를 이용하는 방법이 있다. 그러나, 상기 균주들로부터 생산된 프락토실 트랜스퍼라제는 자당분해역가가 낮은 문제점이 있다.
한편, 일본특허 제 10-165192호는 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum) FERM P-15944 곰팡이를 이용하여 β-프록토프라노시다제를 생산하였으며, 이를 이용하여 자당을 분해하면 기존의 프락토올리고당과 함께 네오프락토올리고당의 혼합물이 생산된다고 개시하고 있다. 또한 상기 네오프락토올리고당은 수크로스에 프락토오스 1 내지 3분자가 β-(2,6) 결합한 구조로 기존의 프락토올리고당 구조와는 상이하며, 네오케스토스(Neokestose, 6G-β-fructofranosyl-sucrose), 네오니스토스(Neonystose, 6G-β-fructofranosyl-kestose), 그리고 네오프락토실 니스토스(Neofructosyl nystose, 6G-β-fructofranosyl-nystose)로 이루어진 물질이라 규명하였다. 상기 특허에서는 상기 네오프락토올리고당이 우수한 보습작용, 우수한 단맛, 저칼로리성, 항우식작용, 장내 세균의 증식, 장관국소면역 증강작용 등의 기능을 갖고 있기 때문에 감미료, 기능성 식품, 사료, 의약, 식물의 방역 촉진제 등 다방면의 적용 가능성이 있음을 예시하였다.
또한, 디 그리자드 등은 상업적으로 판매되고 있는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 유래의 효소인 시톨라제 PCL5(Cytolase PCL5)를 이용하여 프락토올리고당과 네오프락토올리고당의 혼합물을 제조한 바 있으며(D. Grizard,et al., Food Biotechnology, 13(1): 93-105, 1999), 미국특허 제 5,334,516호는 아스퍼질러스 시도위(Aspergillus sydowi) 유래의 효소를 사용하여프락토올리고당과 네오프락토올리고당(문헌에서는 분지된 프락토올리고당으로 명기)을 생산했다.
이에 본 발명자들은 프락토올리고당을 고수율로 생산하기 위한 연구를 계속하던 중, 높은 자당분해역가를 갖는 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하는 신규 미생물을 동정하였으며, 이를 배양하여 고농도의 자당용액과 반응시켰을 때 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당이 고수율로 생산됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 높은 역가의 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하는 신규 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P 균체량 변화에 따른 자당의 분해정도를 도시한 그래프이다. 여기서 기울기(unit/자당 1g)는 프락토실 트랜스퍼라제의 자당분해역가를 나타낸다.
도 2a는 발효조를 이용한 본 배양시 교반속도를 300rpm에서 500rpm까지 변화를 주었을 때 배양시간에 따른 균체 생산량의 변화를 도시한 그래프이다.
도 2b는 발효조를 이용한 본 배양시 교반속도를 300rpm에서 500rpm까지 변화를 주었을 때, 배양시간에 따른 세포 내, 외 효소량 변화를 도시한 그래프이다.
도 2c는 발효조를 이용한 본 배양시 교반속도를 600rpm으로 운전했을 때 균체 생산량과 균체 내 효소 변화량을 도시한 그래프이다.
도 3a는 5리터 발효조 내의 3리터 자당 용액에 본 발명의 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 접종한 후 회분식 배양시, 자당 농도 변화에 따른 프락토올리고당과 네오프락토올리고당의 생산량 변화를 도시한 그래프이다.
도 3b는 5리터 발효조 내의 3리터 자당 용액에 본 발명의 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 접종한 후 회분식 배양시, 수소 이온 농도(pH) 변화에 따른 프락토올리고당과 네오프락토올리고당의 생산량 변화를 도시한 그래프이다.
도 3c는 5리터 발효조 내의 3리터 자당 용액에 본 발명의 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 접종한 후 회분식 배양시, 온도 변화에 따른 프락토올리고당과 네오프락토올리고당의 생산량 변화를 도시한 그래프이다.
도 3d는 5리터 발효조 내의 3리터 자당 용액에 본 발명의 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 접종한 후 회분식 배양시, 교반속도 변화에 따른 프락토올리고당과 네오프락토올리고당의 생산량 변화를 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 알지네이트에 고정화시킨 후 고농도 자당용액과 연속반응시켰을 때 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당의 생산량 변화를 도시한 그래프이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하여 자당을 하기 화학식 1의 프락토올리고당과 하기 화학식 2의 네오프락토올리고당으로 동시에 분해하는 토양 유래 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 제공한다.
<화학식 1>
G: 글루코스, F: 프락토스
<화학식 2>
G: 글루코스, F: 프락토스
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 1차 종배지에서 26-28℃, 100-200rpm에서 2일 동안 진탕배양하여 활성화시킨 종배양단계;
(b) 발효배지에서 26-28℃, 200-500rpm에서 72시간 동안 진탕배양하면서 공기를 0.5-1v/vm 속도로 주입하여 균체를 대량생산하는 단계; 및
(c) 원심분리하여 균체만을 회수하고 0.85% 생리식염수로 2회 세척한 후, 자당농도가 처음 삽입한 브릭스(Brix) 60-70인 자당용액에서 35-50℃, 100-300rpm, 및 pH 4-7로 20-50시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당의 생산방법을 제공한다.
나아가 본 발명은
(a) 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 종배양하는 단계;
(b) 상기 종배양된 균체를 대량생산하는 단계;
(c) 상기 대량생산된 균체를 담체에 혼합하여 비드를 제조한 후, 이를 컬럼에 충진하는 단계; 및
(d) 상기 비드가 충진된 컬럼에 자당용액을 통과시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P 유래의 높은 자당분해역가를 갖는 프락토실 트랜스퍼라제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 인천광역시 중구 신흥동 3가 주변에 산재하는 토양을 채취하여 미생물을 분리하여 그 중 고역가의 프락토실 트랜스퍼라제를 생산할 수 있는 신규 미생물을 동정하였으며, 그 결과 페니실리움 속 곰팡이 균인 페니실리움 시트리눔으로 확인되었다. 상기 미생물을 제 3자에게 일반분양될 수 있도록 대전광역시 유성구 어은동 소재의 한국생명공학연구원에 2001년 2월 27일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 18080P). 또한 본 발명에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P의 학문적 성상을 조사하였으며, 이를 표 1에 기재하였다. 상기 미생물로부터 생산된 프락토실 트랜스퍼라제의 역가를 측정한 결과, 평균 1.5unit/ 자당 1g이었다. 이는 아스퍼질러스 유래의 효소가 1g의 자당을 분해하는 데 5unit 이상 필요하다고 보고한 미국특허 제 5,334,516호 및 아스퍼질러스 아와모리 유래의 효소는 자당 1g을 분해하는데 7unit가 필요하다고 보고한 디 글리자드 등의 연구결과(D. Grizardet al.,Food Biotechnology, 13(1): 93-105, 1999)를 고려할 때에 본 발명의 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P 유래의 프락토실 트랜스퍼라제의 역가가 월등히 우수하다는 것을 보여주는 것이다.
미생물 유래 프락토실 트랜스퍼라제를 이용하여 프락토올리고당을 생산하는 방법에 있어서, 본 발명에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 이용하면 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을 고수율로 동시에 생산할 수 있다. 이 때 사용할 수 있는 방법으로는 회분식(batch) 방법, 고정화(immobilization) 연속생산방법 등 당업계에 알려진 공지의 방법을 사용할 수 있다.
상기 회분식 방법은 프락토실 트랜스퍼라제 효소를 함유하는 균체와 자당용액(기질)을 혼합하여 반응시킴으로써 산물을 생산하는 방법으로 가장 널리 이용되는 일반적인 방법이다. 본 발명은 본 발명의 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 이용하여 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을 고수율로 생산하는 회분식 방법을 제공한다.
한편, 균체 또는 효소를 담체에 고정화시킨 후, 기질과 반응시켜 산물을 생산하는 방법은 최근까지 각광받는 분야 중에 하나이며, 이 고정화의 일반적인 장점은 균체나 효소의 재사용과 연속반응이 가능하도록 한다는데 있다. 그러나, 효소를 고정화하는 경우, 균체 내 효소를 균체 밖으로 추출 및 분리해야 하며, 또한 이렇게 분리된 효소는 일반적으로 불안정하다는 단점이 있다. 따라서 최근에는 균체를 직접 담체에 고정화시킨 고정화 미생물 균체(immobilized microbial cells)를 이용하여 산물을 생산하는 방법이 사용되고 있다. 상기 균체-고정화 방법은 균체로부터 효소를 분리할 필요가 없고, 추출조작 중의 효소활성 저하를 방지할 수 있으며, 또한 효소의 복잡한 추출 및 분리 단계의 반응을 한 단계로 끝낼 수 있는 장점을 가지고 있다. 따라서, 본 발명은 상기 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 담체에 고정화시켜 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당을 연속 생산하는 방법을 제공한다. 상기 본 발명에 따른 고정화 연속생산방법을 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
먼저, 본 발명에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 종배양을 한 후 발효배지에서 대량생산한다. 이 때 상기 종배양은 26 내지 28℃, 100 내지 200rpm에서 2일 동안 진탕배양하는 것이 바람직하고, 상기 대량생산은 공기를 0.5~1v/vm 속도로 주입하면서 26 내지 28℃, 200 내지 600rpm에서 42 내지 72시간 진탕배양하는 것이 바람직하다. 이후 대량생산된 균체를 담체에 혼합하여 비드를 제조한 후, 이를 컬럼에 충진한다. 상기 담체로는 당업계에서 일반적으로 사용되는 담체라면 제한없이 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 알지네이트 겔(Alginate gel), 한천, 광교차결합 수지(Photo cross-linkage resin), 아크릴아미드 겔(Acrylamide gel), 카파-카라지난(κ-Carrageenan), 키토산(Chitosan) 및 젤라틴(Gelatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 사용하는 것이 바람직하다. 이 때 담체의 농도는 1 내지 2%인 것이 바람직하다. 그리고 나서, 상기 비드가 충진된 컬럼에 자당용액을 통과시킨다. 이 때 브릭스 60 내지 70의 자당용액을 35 내지 55℃에서 100 내지 300㎖/hrs의 유속으로 컬럼에 통과시키는 것이 바람직하다.
하기 표 1은 본 발명에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 이용한 회분식(Batch) 생산방법과 고정화 연속생산방법의 프락토올리고당 생산효율을 비교한 것이다.
| 항 목 | 회분식 방법 | 고정화 연속생산방법 |
| 균체량(100L 생산 시) | 400g | 50g |
| 생산효율(100L 생산 시) | 0.67L/일(100L/150일) | 4.02L/일(100L/24.9일) |
상기 표 1에 기재된 바와 같이, 회분식 방법의 경우 100L의 올리고당을 생산시 400g의 균체가 필요하였으며, 150일이 소요가 되어 생산효율은 0.67L/일이었다. 또한 1L의 프락토올리고당을 반응시키는데 24시간이 소요되었지만, 반응 후 반응균체와 생산된 올리고당의 분리, 반응조 세척, 반응조 내 새 균체와 자당용액 재충원등 반응 재시작까지 약 12시간이 부가적으로 소요되었다. 이에 반해 고정화 연속생산방법의 경우, 균체량은 50g만 필요하였고, 시간은 25일이 소요되어 생산효율은 4.02L/일이었다. 결과적으로 고정화 연속생산방법 적용시, 회분식 방법보다 적은 균체량이 요구되었으며, 생산효율 또한 6배 높음을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
균체 동정
인천광역시 중구 신흥동 3가 주변에 산재하는 토양을 채취하여 미생물을 분리하여 그 중 고역가의 프락토실 트랜스퍼라제를 생산할 수 있는 신규 미생물을 동정하였다. 그 결과, 동정된 미생물이 페니실리움 속의 곰팡이 균인 페니실리움 시트리눔인 것을 확인하였으며, 이를 2001년 2월 27일자로 한국생명공학연구원에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 18080P). 본 발명에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 곰팡이 배양에 일반적인 츠아펙-이스트 한천(Czapek-yeast algae, CYA) 배지와 말토 엑기스 한천(MEA) 배지에서 성장시켜 성장형태를 조사한 결과, 상기 두 배지에서 거의 비슷한 성장 형태를 나타내었다. 이에 대한 학문적 성상을 하기 표 2에 나타내었다.
| 배지별 성장특성 | ||
| 성 장 | ||
| MEA 배지 | CYA 배지 | |
| 생육속도(25℃, 7일 동안) | 2.6cm | 3.6cm |
| 생육속도(37℃, 7일 동안) | 2.2cm | 2.4cm |
| 생육속도(4℃, 7일 동안) | - | - |
| 균체 표면(Colony) | 벨벳모양, 편평하게 성장 | 벨벳모양, 깊고 외부 쪽으로 홈이 난 원형 |
| 균사체(Mycelium) | 분생자가 없는 나선형의 흰색균사회청록색의 집락 형성 | 분생자가 없는 나선형의 흰색규사회청록색의 집락 형성 |
| 삼출물(Exudates) | - | - |
| 색소(Pigment) | - | 옅은 황색의 색소 형성 |
| 균체이면 | 옅은 황색 | 짙은 황색 |
| 형태별 특징 | ||
| 분생자병(Conidiophores) | 기균사(aerial hypha)로부터 성장 | |
| 때때로 20-50μm의 가지를 포함하며, 100-200μm 크기로 성장 | ||
| 활면 | ||
| 외생포자: 분기 형태(furcatum-type), 2-4개 정도의 말단으로 구성됨(때때로 단균생, monoverticillate) | ||
| 메툴레(Metulae): 분지형태, 5-8개의 피알리드(phialide)를 가짐, 8.6-13.8×2.2-3.1μm 크기 | ||
| 피알리드(Phialide): 병모양, 4.3-8.3×1.8-2.9μm 크기 | ||
| 분생아포(Conidia) | 2.4-3.2×2.0-3.1μm 크기 | |
| 구형 | ||
| 분생아포 말단에서 풀어진 관 모양으로 성장 |
<실시예 2>
종배양 및 프락토실 트랜스퍼라제의 자당분해역가 측정
상기 실시예 1에서 동정된 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P의 종균(Seed)배양을 위한 배지조성은 대한민국 특허공개 제 1989-01127호에 개시된 프락토올리고당 생산균 배양조건의 조성을 변형하여 채용하였고, 이를 표 3에 나타내었다. 상기 균체는 250mL 플라스크(Flask)에서 배양하였고, 배지량은 50mL를 첨가하였으며,150rpm, 28℃로 진탕배양기에서 2일 동안 배양하였다.
| 성분 | 조성(g/L) |
| 자당 | 200 |
| NaNO3 | 2 |
| K2HPO4 | 5 |
| 효모 추출물 | 20 |
| MgSO4·7H2O | 1 |
| KCl | 1 |
| 수소이온농도: pH 6.0(5N 염산으로 보정) |
이후, 상기 배양된 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P로부터 생산된 프락토실 트랜스퍼라제의 자당분해역가를 측정하였다. 효소측정은 시노하라 사토루의 방법(일본특허 제 10-165192호)에 따라 측정하였으며, 효소 역가는 단위 시간(분) 당 기질인 자당을 분해하여 생성된 글루코오스의 양(μmol)으로 나타내었다. 그 결과, 본 발명에 따른 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P로부터 생산된 프락토실 트랜스퍼라제의 자당분해역가는 평균 1.5unit/ 자당 1g이었다. 이는 아스퍼질러스 유래의 효소가 1g의 자당을 분해하는 데 5unit 이상 필요하다고 보고한 미국특허 제 5,334,516호 와 아스퍼질러스 아와모리 유래의 효소는 자당 1g을 분해하는데 7unit가 필요하다고 보고한 디 글리자드 등의 연구결과(D. Grizardet al., Food Biotechnology, 13(1): 93-105, 1999)를 고려할 때에 본 발명의 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P 유래의 프락토실 트랜스퍼라제의 역가가 월등히 우수하다는 것을 보여주는 것이다.
또한 균체량에 따른 자당분해정도를 조사한 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P의 균체량이 증가할수록 분해된 자당의 양이 증가함을 볼 수 있다.
<실시예 3>
본 배양
상기 실시예 2에서 종배양된 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 발효조 내 배양액 부피의 5%(v/v)로 접종하여 5L 발효조(한일 R&D, Korea)에서 본 배양(대량생산)하였다. 이 때 배양 조건은 유무영 등의 방법(대한민국 특허공개 제1989-01127호)을 변형하여 채용하였다. 도 2a는 발효조 내 교반기의 교반속도를 300rpm에서 500rpm으로 변화시켰을 때의 균체량 변화를 도시한 것으로서, 교반속도가 증가할수록 균체량이 증가함을 볼 수 있다. 도 2b는 교반속도에 따른 세포 내외의 효소량을 도시한 것으로서, 교반속도가 500rpm인 경우, 50시간 이후 세포 내 효소 함량이 감소하는 경향을 보였다. 이는 균체 노화와 발효조 내의 환경 악화 등에 의한 것으로 보이며, 400rpm에서도 비슷한 성향을 나타내었다. 그러나, 균체 외 효소 함량 증가는 관측되지 않았다. 균체로부터 효소유출로 인한 균체 외 효소의 증가는 발효조 부피를 감안하여 약 20unit정도 증가를 예상할 수 있는데 이는 매우 미비하여 감지되지 않은 것으로 사료된다. 도 2c는 발효조를 이용한 본 배양시 교반속도를 600rpm으로 운전했을 때 균체 생산량과 균체 내 효소 변화량을 도시한 것으로서, 배양시간이 증가할수록 균체량 및 효소량이 증가하는 것을 볼 수 있다.발효조 내의 교반속도를 증가하였을 경우, 균체량은 증가하는 경향을 보였고, 그 생장 형태도 400rpm 이상에서는 미세한 콜로이드(Colloid) 형태를 보였으며, 200rpm 이하에서는 직경 2mm 정도 펠랫(Pellet) 형태로 크게 성장하는 특징을 보였다.
또한, 효소생산량을 조사한 결과 균체 내 존재하는 효소는 균체 1그램 당 1400unit이었으며, 균체 외 존재하는 효소는 배양액 1㎖ 당 150unit의 효소가 존재하였다. 이는 페니실리움 시트리눔 FERM P-15944의 균체 내 효소 함량이 1g 당 500unit이라는 시노하라 사토루의 보고(일본특허 제 10-165192호)를 고려할 때에 본 발명의 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P가 2.8배나 많은 양의 효소를 생산한다는 것을 나타내는 것이다.
<실시예 4>
회분식 방법을 이용한 프락토올리고당의 생산
상기 실시예 2에서 본 배양하여 얻은 균체를 회수하여 자당 용액과 반응시켜 실제 프락토올리고당의 생산을 수행하였다. 고형분비 총프락토올리고당 함량(%)은 네오프락토올리고당과 기존 프락토올리고당의 합으로 나누어 구하였으며, 교반속도, 배양시간, 자당농도, 수소이온농도, 온도변화 등에 따른 고형분비 총프락토올리고당 함량(%)을 조사하였다. 도 3a는 자당의 농도에 따른 고형분비 총프락토올리고당 함량(%)의 변화를 도시한 것으로서, 자당 농도가 브릭스(Brix) 60 내지 70의 경우 프락토올리고당 생산수율이 가장 높음을 확인할 수 있었다. 자당의 농도가 브릭스 70보다 높을 때에는, 고농도의 자당으로 인해 흰색으로 자당이 석출됨으로써 프락토올리고당 반응을 저해하는 것을 발견하였다. 따라서, 공업화를 위한 최적의 자당농도는 브릭스 70이하임을 확인할 수 있었다. 또한 낮은 자당 농도에서는 타 미생물에 의한 오염의 위험성이 있기 때문에 최적 자당 농도는 브릭스 65에서 브릭스 70 범위가 최적인 것으로 발견되었다. 반응 시간은 24시간만에 최고 수준인 65%에 도달하여 실재 공업적 생산에 문제가 없을 것으로 예측할 수 있다. 도 3b는 수소이온 농도(pH)에 따른 고형분비 프락토올리고당 함량(%)의 변화를 도시한 것으로서, 수소이온 농도 4 내지 7 사이의 경우 프락토올리고당 생산수율이 가장 높음을 확인할 수 있었다.
이후 실험에서는 수소이온 농도를 별도의 완충용액(Buffer solution)을 사용하여 조절하지 않고 자당 용액 자체를 사용하여 반응시켰다. 따라서 네오프락토올리고당의 공업적 생산 면에서 보면 별도의 처리 없이 보다 단순화된 공정을 기대할 수 있을 것으로 예상된다.
도 3c는 온도에 따른 고형분비 총프락토올리고당 함량(%)의 변화를 도시한 것으로, 40℃까지는 일정하게 증가하는 경향을 보였다. 반응 속도 면에 있어서는 45℃에서 가장 높은 반응성을 나타내었으며, 24시간만에 반응이 종료됨을 알 수 있었다. 또한 고온에서 운전함으로 인해 타균에 의한 오염 문제도 어느 정도 해결될 것으로 예상되었다. 그러나, 45℃에서 효소의 역가가 다른 문헌의 수치보다도 높음에도 불구하고, 총프락토올리고당 생산량은 크게 높지 않은 결과를 보였는데, 이는 이전에 제기된 바와 같이 자당의 분해로 인해 반응조 내에 글루코스가 축적되면올리고당의 생산이 저해를 받기 때문이라 사료된다.
이에 대한 해결책으로 축척된 글루코스를 소모시키는 방법들이 제공되고 있는데, 예를 들면, 글루코스 옥시다제(Glucose oxidase)나 효모를 같이 첨가하여 글루코스를 소모시키는 방법 등이 있다(윤종원 등, 한국생물공학회지, 9, 40-47, 1994). 그러나 본 발명에서는 불순물의 생성이라는 단점으로 이에 대한 시도는 하지 않았다.
도 3d는 교반속도에 따른 고형분비 총프락토올리고당 함량(%)의 변화를 도시한 것으로, 교반속도가 증가할수록 반응성이 낮아지는 것을 볼 수 있다. 이는 교반기가 고속 회전할 때 생성된 공기방울에 의해 균체와 자당용액 간의 반응 면적이 작아짐에 기인한다고 사료된다. 따라서, 반응에 적합한 교반속도는 200rpm이하로 예상되었으며, 프락토올리고당 생산을 위한 본 발명에서는 100rpm으로 수행하였다.
이상의 네오프락토올리고당을 함유하는 프락토올리고당의 생산을 수행한 결과, 프락토올리고당 생산 운전을 위한 최적 반응 조건은 자당 농도 브릭스 60~65, 반응 온도 45℃, 교반속도 100rpm으로 24시간 동안 수행하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5>
균체 고정화를 통한 프락토올리고당의 연속생산
상기 실시예 2에서 종배양된 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 발효조 내 배양액 부피의 5%(v/v)로 접종하여 5L 발효조(한일 R&D, Korea)에서 본 배양하였다. 본 배양이 완료된 균체를 회수하여 소디움 알지네이트(Junsei Chemical, Japen)에 고정화하여 프락토올리고당을 생산하였다. 균체 농도와 알지네이트 농도를 혼합한 후, 혼합액을 연동펌프(Gilson, France)를 이용하여 일정 속도로 흘려주면서 직경 1mm의 주사바늘을 통하여 높이 20cm 높이에서 1% 염화칼슘(CaCl2) 수용액에 떨어뜨려 주었다. 이 때, 상기 1% 염화칼슘 수용액은 자석 교반기로 교반시켰다. 상기 염화칼슘 용액은 알지네이트 내의 소디움이온(Na+)과 칼슘이온(Ca2+)의 이온교환반응으로 비드 형성을 유도하기 위한 것이다. 균체 농도(25-100g/L)와 알지네이트 농도(1-2%)를 조합하여 비드를 제조한 결과, 균체농도는 50g/L 이하에서, 알지네이트 농도는 1.5%(w/v) 이하에서 완전한 원형의 비드가 형성되었으며, 이상의 범위에서는 점도의 증가로 불균일한 형태의 비드가 형성됨을 볼 수 있었다. 따라서, 균체농도는 50g/L로, 알지네이트는 1.5%로 사용하여 비드를 제조하였다. 생성된 비드는 4℃에서 10시간 방지한 후, 증류수로 세척한 다음, 브릭스 60의 자당용액에 담가 다시 4℃에서 10시간 동안 보관하여 숙성시켰다. 이후, 상기 비드를 1L 유리관에 충진시킨 후, 브릭스 60의 자당용액을 통액시켜 프락토올리고당 연속생산반응을 수행하였다. 이 때 반응온도는 45℃로 하였고, 자당용액의 유량은 연동펌프(Gilson, France)를 사용하여 시간당 200mL로 주입하였다. 도 4는 40일간 연속반응시켰을 때의 프락토올리고당의 생산량 변화를 나타낸 것으로서, 40일 간 총프락토올리고당 고형분 함량비는 55-60%로 일정한 경향을 보였으며, 비드의 형태, 강도 모두 초기와 차이가 없었다.
이상의 네오프락토올리고당을 함유하는 프락토올리고당 생산을 고정화 연속생산방법으로 수행한 결과, 프락토올리고당 생산을 위한 최적 반응 조건은 자당농도 브릭스 60, 자당용액 유속 150-200 mL/hrs, 반응 온도 45℃로 수행하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 6>
프락토올리고당의 분석
고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(Shimadzu, 일본)을 이용하여 상기 실시예 4 및 5에서 생산된 프락토올리고당을 분석하였으며, 다이소(Daiso, 일본)사의 ODS 컬럼(5μm, 150mm x 4mm)과 굴절검출기(Refractive Index Detector)를 사용하여 분석하였다. 그 결과, 기존의 프락토올리고당과는 다른 물질이 검출되었기 때문에 순품 제조용 고속 액체 크로마토그래피(Prep-HPLC, Waters, 미국) 시스템을 이용하여 물질을 분리하였고, 이를 NMR 분석(ARX400MHz, Bruker, 독일)으로 구조분석을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 4의 결과를 얻었다.
| 케스토스(Kestose) | 네오케스토스(Neo Kestose) | 니스토스(Nystose) | 네오니스토스(Neo Nystose) | ||||
| 성분 | δc | 성분 | δc | 성분 | δc | 성분 | δc |
| 1F11 | 63.7 | 6F11 | 63.00 | 1F11 | 63.82 | 1F11 | 62.99 |
| 2 | 106.0 | 2 | 106.41 | 2 | 106.0 | 2 | 106.36 |
| 3 | 79.4 | 3 | 79.58 | 3 | 79.6 | 3 | 79.58 |
| 4 | 76.6 | 4 | 77.13 | 4 | 76.6 | 4 | 77.10 |
| 5 | 84.0 | 5 | 83.86 | 5 | 84.0 | 5 | 83.82 |
| 6 | 65.0 | 6 | 65.08 | 6 | 64.98 | 6 | 65.03 |
| 1F21 | 63.2 | 1F11 | 64.25 | 1F21 | 63.63 | 1F21 | 63.77 |
| 2 | 106.5 | 2 | 106.43 | 2 | 105.8 | 2 | 105.97 |
| 3 | 79.4 | 3 | 79.04 | 3 | 80.3 | 3 | 79.19 |
| 4 | 77.2 | 4 | 76.70 | 4 | 77.2 | 4 | 76.52 |
| 5 | 83.9 | 5 | 84.06 | 5 | 83.8 | 5 | 83.91 |
| 6 | 65.1 | 6 | 65.12 | 6 | 65.04 | 6 | 64.90 |
| G 1 | 95.3 | G 1 | 94.72 | 1F31 | 63.16 | 1F31 | 63.17 |
| 2 | 73.9 | 2 | 73.73 | 2 | 106.4 | 2 | 106.42 |
| 3 | 75.4 | 3 | 75.17 | 3 | 79.5 | 3 | 79.36 |
| 4 | 72.0 | 4 | 71.94 | 4 | 77.1 | 4 | 77.20 |
| 5 | 75.2 | 5 | 74.26 | 5 | 83.8 | 5 | 83.82 |
| 6 | 62.9 | 6 | 63.08 | 6 | 65.03 | 6 | 65.03 |
| G 1 | 95.3 | G 1 | 94.97 | ||||
| 2 | 73.9 | 2 | 73.75 | ||||
| 3 | 75.4 | 3 | 75.26 | ||||
| 4 | 72.0 | 4 | 71.90 | ||||
| 5 | 75.2 | 5 | 74.27 | ||||
| 6 | 62.89 | 6 | 63.03 |
13C spectral data(δin ppm)
상기 표 4에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 이용하여 생산된 프락토올리고당은 기존 프락토올리고당(화학식 1)과 더불어 이와는 다른 구조의 네오프락토올리고당(화학식 2)을 함유하고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 미생물인 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P는 기존의 프락토올리고당과 함께 이와 구조가 다른 네오프락토오리고당을 동시에 생산하는 것을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 고역가의 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하여 자당을 기존의 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당으로 분해하는 신규 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 동정하였다. 본 발명에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P로부터 생산된 프락토실 트랜스퍼라제는 기존의 미생물 유래 효소보다 월등히 높은 자당분해역가를 갖기 때문에, 이를 이용하여 프락토올리고당을 저비용, 고수율로 생산할 수 있다.
Claims (12)
- 프락토실 트랜스퍼라제를 생산하여 자당을 하기 화학식 1의 프락토올리고당 및 하기 화학식 2의 네오프락토올리고당으로 분해하는 토양 유래 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum) KCTC 18080P.<화학식 1>G: 글루코스, F: 프락토스<화학식 2>G: 글루코스, F: 프락토스
- 미생물을 이용한 프락토올리고당의 생산방법에 있어서, 제 1항에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 이용하는 것을 특징으로 하는 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당의 생산방법.
- 제 2항에 있어서,(a) 제 1항에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 1차 종배지에서 26-28℃, 100-200rpm에서 2일 동안 진탕배양하여 활성화시킨 종배양단계;(b) 발효배지에서 26-28℃, 200-500rpm에서 72시간 동안 진탕배양하면서 공기를 0.5-1v/vm 속도로 주입하여 균체를 대량생산하는 단계; 및(c) 원심분리하여 균체만을 회수하고 0.85% 생리식염수로 2회 세척한 후, 자당농도가 처음 삽입한 브릭스(Brix) 60-70인 자당용액에서 35-50℃, 100-300rpm, 및 pH 4-7로 20-50시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당의 생산방법.
- 제 2항에 있어서,(a) 제 1항에 따른 미생물 페니실리움 시트리눔 KCTC 18080P를 종배양하는 단계;(b) 상기 배양된 균체를 대량생산하는 단계;(c) 상기 대량생산된 균체를 담체에 혼합하여 비드를 제조한 후, 이를 컬럼에 충진하는 단계; 및(d) 상기 비드가 충진된 컬럼에 자당용액을 통과시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프락토올리고당 및 네오프락토올리고당의 생산방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 종배양은 26-28℃, 100-200rpm에서 2일 동안 진탕배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 대량생산은 공기를 0.5-1v/vm 속도로 주입하면서 26-28℃, 200-600rpm에서 42-72시간 동안 진탕배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 담체는 알지네이트 겔(Alginate gel), 한천, 광교차결합 수지(Photo cross-linkage resin), 아크릴아미드 겔(Acrylamide gel), 카파-카라지난(κ-Carrageenan), 키토산(Chitosan) 및 젤라틴(Gelatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 담체의 농도가 1 내지 2%인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 비드는 균체와 담체의 혼합액을 직경 0.5 내지 1mm의 주사바늘을 통하여 1-2% 염화칼슘 수용액에 투하함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 자당용액은 브릭스 60 내지 70인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 자당용액을 35-55℃에서 100-300㎖/ hrs의 유속으로 컬럼에 통과시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
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