DE60214283T2

DE60214283T2 - Fructosyl-Transferase produzierender Mikroorganismus und Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden unter dessen Verwendung

Info

Publication number: DE60214283T2
Application number: DE60214283T
Authority: DE
Inventors: Joon Sang Han; Kang June Park; Dae Sub Yeondeungpo-gu Shin; Jung Hoon Kim; Jin Chul Kim; Ki Chang Lee; Woon Hwa Lee; Seung Wook Kim; Seung Won Park
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2001-05-14
Filing date: 2002-05-14
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2022-05-15
Also published as: ATE338140T1; JP4338356B2; DE10221419A1; EP1266968B1; EP1266968A2; JP2002360238A; DE60214283D1; EP1266968A3; CN1390945A; CN1243832C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der in der Lage ist, gleichzeitig Fructooligosaccharide und Neofructooligosaccharide zu erzeugen sowie ein Verfahren zum Erzeugen von Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden unter Verwendung von besagten Mikroorganismus. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Penicillium citrinum KCTC 10225B aus erdigem Ursprung, welcher Fructosyl-Transferase erzeugt und Saccharose in Fructooligosaccharide der folgenden Formel I hydrolisiert:
in welcher n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, G Glucose repräsentiert und F Fructose repräsentiert; und Neofructooligosaccharide der folgenden Formel II:
in welcher n eine ganze Zahl ist von 1 bis 5, G und F wie oben definiert sind, unter Verwendung der Fructosyl-Transferase und ein Verfahren zum Erzeugen von Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden unter Verwendung von besagtem Mikroorganismus.
Stand der Technik
Fructooligosaccharide sind eine Mischung aus Oligosacchariden einschließend 1-Kestose (GF2), Nystose (GF3) und Fructosylnystose (GF4), in welchen 1 bis 3 Moleküle an Fructose an Saccharose gebunden sind durch β-(2,1)-Verknüpfung und gemeinhin in Pflanzen enthalten, wie z.B. Asparagus, Zwiebeln, Kartoffeln, Honig etc.. Sie werden derzeit als Nahrungsmittel herangezogen, zusammen mit Oligosacchariden aufgrund ihrer wünschenswerten Funktionen, einschließend beispielsweise ihren niedrigen Kalorienwert, das Fördern und die Vermehrung von Milchsäurebakterien und Bifidobakterien, die Verbesserung der Mikroflora in den Gedärmen sowie die Inhibition des Wachstums von pathogenen Bakterien, die Verbesserung der Darm-Perestaltik und die Stärkung des Immunsystems.
Folglich können Beispiele von Anwendungen von Oligosacchariden in verschiedenen industriellen Gebieten gefunden werden, einschließend Nahrungsmittel, Getränke, Süßigkeiten, Gesundheitsnahrung u. dgl..
Insbesondere wurde berichtet, dass Fructooligosaccharide exzellente Kalziumabsorbierende Wirkung zeigten, wenn sie in Kombination mit Difructoseanhydrid III (DFA III) (siehe japanische veröffentlichte Patentanmeldung Nr. 11-43438) verwendet werden. US-Patent Nr. 5,827,526 offenbarte, daß die Dauer und das Wiederauftreten von Diarrhoe im Menschen reduziert werden kann, wenn 0,5 bis 5 g an Fructooligosacchariden pro Tag dem Patienten verabreicht werden.
Die offengelegte koreanische Patentanmeldung Nr. 2000-57520 offenbart, dass eine Mischung von Fructooligosacchariden und Galactooligosacchariden mit verschiedenen essbaren Ingredienzien die Darmperestaltik verbessern kann und präbiotische Wirkungen effizient im Vergleich zu anderen Oligosacchariden fördern kann. Desweiteren sind Fructooligosaccharide derzeit Gegenstand von Wissenschaft und Forschung, um Diäten für Diabetiker-Patienten zu entwickeln, da sie exzellent hinsichtlich der Verbesserung der Darmperestaltik durch Induzieren der Proliferation von Lactobacillus Bifidus sind, eines der Bakterien, welche in der Mikroflora von menschlichen Gedärmen enthalten ist, den Blutzuckerspiegel bei der Verdauung nicht beeinflussen und nicht durch Verdauungsenzyme abgebaut werden. Desweiteren wurde gezeigt, dass sie den Cholesterinspiegel im Blut und der Leber senken. Daher werden solche Wirkungen von Fructooligosacchariden nun einer sorgsamen Untersuchung unterzogen.
Konventionell wurden Fructooligosaccharide erzeugt durch Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen, welche Fructosyl-Transferase erzeugen können. Beispielsweise ist ein Verfahren bekannt unter Verwendung des Aureobasidium pullulans-Stamm, ein Verfahren unter Verwendung von Aspergillus niger sowie ein Verfahren unter Verwendung von Stämmen von Penicillium und Fusarium sps. Jedoch weist Fructosyl-Transferase, hergestellt durch diese Verfahren, den Nachteil von geringen Saccharose-Hydrolyse-Titem auf.
Die japanische ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 10-165192 offenbart ein Verfahren zum Erzeugen von β-Fructofuranosidase unter Verwendung von Penicillium citrinum FERM P-15944-Pilz, durch welchen eine Mischung von konventionellen Fructooligosacchariden mit Neofructooligosacchariden aus Saccharose erzeugt werden konnte. Es wird beschrieben, dass die Neofructooligosaccharide eine Mischung sind bestehend aus Neokestose (6G-β-Fructofuranosyl-Saccharose), Neonystose (6G-β-Fructofuranosyl-Nystose), welche eine Struktur aufweisen, in welcher 1 bis 3 Moleküle an Fructose an Saccharose durch β-(2,6)-Verknüpfung verbunden sind, was sie von konventionellen Fructooligosacchariden unterscheidet. Es wird auch beschrieben, dass Neofructooligosaccharide befeuchtende Wirkung aufweisen, exzellente Süßqualitäten, geringe Kalorien und Anti-Kavitäts-Wirkungen, Funktionen, die Proliferation von Bakterien im Darm zu induzieren und topische Immunantworten im Magen-/Darmtrakt zu fördern, und folglich in verschiedenen Gebieten eingesetzt werden können, beispielsweise als Süßstoffe, funktionale Nahrungsmittel in Medikamenten und als Promotoren für Pestizide.
D. Grizard et al. offenbart ein Verfahren zum Erzeugen einer Mischung von Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden unter Verwendung von Cytolase PCL5, einem kommerziell verfügbaren Enzym, abgeleitet von Aspergillus awamori (D. 'Grizard, C. Barthomuf, Food Biotechnology, 13('1), 93-105, 1999).
US-Patent Nr. 5,334,516 offenbart ein Verfahren zum Erzeugen von Neofructooligosacchariden (bezeichnet als "verzweigte Fructooligosaccharide") mit konventionellen Oligosacchariden unter Verwendung eines Enzyms, abgeleitet von Aspergillus sydowi.
In der Folge haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung intensiv den Stand der Technik gewürdigt und untersucht und Forschung in vielerlei Weise durchgeführt, um Fructooligosaccharide in einer hohen Ausbeute zu erzeugen. Als ein Ergebnis haben wir letztendlich einen neuen Mikroorganismus identifiziert, welcher in der Lage ist, Fructosyl-Transferase zu erzeugen mit hohen Saccharose-Hydrolyse-Titern und bestätigt, dass konventionelle Fructooligosaccharide und Neofructooligosaccharide in einer hohen Ausbeute über eine Reaktion des Mikroorgannismus mit hochkonzentrierter Saccharose-Lösung erzeugt werden konnten. Basierend auf diesen Entdeckungen wurde die vorliegende Erfindung entwickelt.
Offenbarung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen, welcher Fructosyl-Transferase mit einem hohen Titer erzeugen kann.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen zum Erzeugen von Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden in ei ner hohen Ausbeute durch Reagieren einer hoch konzentrierten Saccharose-Lösung mit dem Mikroorganismus.
Folglich stellen die Erfinder der vorliegenden Erfindung, um diese Aufgabe zu lösen, Penicillium citrinum KCTC 10225BP aus erdigem Ursprung zur Verfügung, welcher Fructosyl-Transferase erzeugt, Saccharose in Fructooligosaccharide der folgenden Formel I hydrolisiert:
in welcher n eine ganze Zahl ist von 1 bis 5, G Glukose repräsentiert und F Fructose repräsentiert; und Neofructooligosaccharide der folgenden Formel II:
in welcher n eine Ganze Zahl ist von 1 bis 5, G und F wie oben definiert sind, unter Verwendung von Fructosyl-Transferase, sowie ein Verfahren zum Erzeugen von Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden unter Verwendung von besagtem Mikroorganismus.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von Fructooligosacchariden bereit und von Neofructooligosacchariden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Aussäen und Kultivieren des Penicillium citrinum KCTC 10225BP Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung in einem ersten Wachstumsmedium bei 26 bis 28°C für zwei Tage, unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 100 bis 200 rpm, um den Mikroorganismus zu aktivieren;
Massenerzeugung des Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium bei 26 bis 28°C für 72 Stunden, unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 200 bis 500 rpm und Injizieren von Luft bei einer Rate von 0,5 bis 1 v/vm; und
Sammeln des erzeugten Mikroorganismus durch Zentrifugation, zweimaliges Waschen mit 0,85%iger physiologischer Salzlösung, gefolgt vom Kultivieren von Saccharose-Lösung mit einer Brix-Konzentration von Saccharose von 60 bis 77, wie durch ursprüngliches Einbringen eines Sensors gemessen, bei einer Temperatur in einer Größenord nung von 35 bis 50°C unter einem pH von 5 bis 7 für 20 bis 50 Stunden unter Rühren bei einer Geschwindigeit von 100 bis 300 rpm.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden zur Verfügung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Aussäen und Kultivieren des Penicillium citrinum KCTC 10225BP-Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung;
Massenproduktion des ausgesäten und kultivierten Mikroorganismus;
Mischen der in Massen produzierten Mikroorganismen mit einem Träger, um Beads auszubilden, welche dann in eine Säule gepackt werden können; und
Leiten einer Saccharose-Lösung durch die Säule, gepackt mit den Beads.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die oben genannte Aufgaben und weitere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden offensichtlicher werden nach Durchlesen der folgenden detaillierten Beschreibung, wenn sie in Verknüpfung mit den Zeichnungen gesehen wird, in welchen:
1 ein Graph ist, welcher die Hydrolyse-Spiegel von Saccharose zeigt, während die Biomasse an Penicillium citrinim KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung variiert wird, wobei die Steigung (Einheit/1g an Saccharose) der Saccharose-Hydrolysetiter an Frulctosyltransferase ist;
2a ein Graph ist, welcher die Veränderung in der Biomasse an Mikroorganismen zeigt mit der Fermentationszeit der hauptsächlichen Kultivierung unter Verwendung eines Fermentors, während die Rührgeschwindigkeit von 300 rpm auf 500 rpm verändert wird;
2b ist Graph, welcher die Veränderung in der Menge an intrazellulären und extrazellulären Enzymen mit der Fermentationszeit der hauptsächlichen Kultivierung un ter Verwendung eines Fermentors zeigt, während die Rührgeschwindigkeit von 300 rpm auf 500 rpm variiert wird;
2c ist ein Graph, welcher die Veränderung in der Biomasse der Mikroorganismen und die Menge an intrazellulären Enzymen mit der Fermentationszeit der hauptsächlichen Kultivierung unter Verwendung eines Fermentors bei einer Rührgeschwindigkeit von 600 rpm zeigt;
3a ist ein Graph, welcher die Veränderungen der Menge an erzeugten Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden mit der Konzentration an Saccharose in einer eintopfartigen Fermentation nach der Impfung von Penicillium citrinum KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung in 3 l einer Saccharose-Lösung in einem 5 l Fermentor zeigt;
3b ist ein Graph, welcher die Veränderung in der Menge an erzeugten Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden mit der Wasserstoff-Ionenkonzentration (pH) in einer eintopfartigen Produktion nach Vermischen der Biomasse an Penicillium citrinum KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung in 3 l an Saccharose-Lösung in einem 5 l Reaktor zeigt;
3c ist ein Graph, welcher die Veränderung in der Menge an erzeugtem Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden mit der Temperatur in einer eintopfartigen Produktion nach Vermischen der Biomasse an Penicillium citrinum KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung in 3 l an Saccharose-Lösung in einem 5 l Reaktor zeigt;
3d ist ein Graph, welcher die Veränderung in der Menge an erzeugtem Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden mit der Rührgeschwindigkeit in einer eintopfartigen Produktion nach Vermischen der Biomasse an Penicillium citrinum KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung in 3 l an Saccharose-Lösung in einem 5 l Reaktor zeigt; und
4 ist ein Graph, welcher die Veränderung in der Menge an erzeugten Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden zeigt, wenn Penicillium citrinum KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung, welche in Alginat fixiert worden ist, kontinuierlich mit hoch konzentrierter Saccharose-Lösung umgesetzt wird.
Bevorzugte Ausführungsform zum Durchführen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail beschrieben werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sammelten Erde verteilt ringsum eine Zuckerfabrik lokalisiert in Inchon, Korea und trennten Mikroorganismen vom Erdreich ab. Für einen der Mikroorganismen zeigte sich, dass er die Fähigkeit, Fructosyl-Transferase eines hohen Titers zu erzeugen, aufwies. Der neue Mikroorganismus wurde als Penicillium citrinum identifiziert, welcher ein Pilz ist, der zum Genus Penicillium gehört. Der Mikroorganismus wurde hinterlegt beim Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), lokalisiert in Oun-dong, Yusong-gu, Taejon, Korea am 27. Februar 2001, als Hinterlegungs-Zugangsnummer KCTC-10225BP, so dass der Mikroogganismus für Dritte zugänglich sein kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben wissenschaftliche Untersuchungen betreffend die Eigenschaften und Morphologien des Penicillium citrinum KCTC 10225BP-Mikroogganismus gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Der Saccharose-Hydrolysetiter an Fructosyl- Transferase, erzeugt aus den Mikroorganismen, wurde gemessen. Er wurde als 1,5 Einheiten/1 g an Saccharose im Durchschnitt gefunden. Solch ein Ergebnis demonstriert, dass Fructosyl-Transferase, abgeleitet von Penicillium citrinum KCTC 1022BP gemäß der vorliegenden Erfindung einen Saccharose-Hydrolyse-Titer aufweist, welcher den anderen bekannten Enzymen überlegen ist, betrachtet man die experimentellen Ergebnisse von US-Patent Nr. 5,334,516, in welchem, wenn Saccharose unter Verwendung eines Enzyms, abgeleitet von Aspergillus, hydrolysiert wurde, zumindest 5 Einheiten des Enzyms benötigt wurden, um 1g an Saccharose abzubauen, sowie D. Grizard et al., in welcher 7 Einheiten des Enzyms, abgeleitet von Aspergillus awamori benötigt wurden, um 1g an Saccharose abzubauen.
Unter Verwendung des Penicillium citrinum KCTC 10225BP-Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, gleichzeitig Fructooligosaccharide und Neofructooligosaccharide in einer hohen Ausbeute zu erzeugen. Verfahren, welche für die Produktion von Fructooligosacchariden verwendet werden können, schließen eintopfartige Verfahren ein, immobilisierte kontinuierliche Verfahren etc., wie diejenigen, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
Die Eintopfverfahren sind für gewöhnlich die am häufigsten verwendeten Verfahren, in welchen Fructosyl-Transferase mit einer Saccharose-Lösung (Substrat) umgesetzt wird durch Vermischen von Mikroorganismen, welche das Enzym enthalten, mit der Saccharose-Lösung, um ein Produkt zu erhalten. In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein eintopfartiges Verfahren zum Erzeugen von Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden zur Verfügung in einer hohen Ausbeute unter Verwendung von Penicillium citrinum KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung.
In der Zwischenzeit werden die immobilisierten kontinuierlichen Verfahren, in welchen Mikroorganismen oder Enzyme in einem Träger immobilisiert sind, und ein Substrat in Kontakt gebracht wird mit dem Träger zum Umsetzen mit den Mikroorganismen oder den Enzymen auch bis hier hin, immer weiter verbreitet verwendet. Ein Vorteil dieser Verfahren ist, dass Mikroorganismen oder Enzyme wieder verwendet werden können und die Reaktion kontinuierlich durchgeführt werden kann. Jedoch weisen diese Verfahren auch Nachteile auf, dahingehend, dass für die Immobilisierung der Enzyme die Enzyme, enthalten in Mikroogganismen, extrahiert und abgetrennt werden sollten und die Enzyme, abgeleitet von den Mikroorganismen, üblicherweise instabil sind. Folglich wird derzeit ein Verfahren verwendet unter Verwendung von immobilisierten mikrobiologischen Zellen, in welchem die Mikroorganismen direkt in einem Träger immobilisiert werden. Das Verfahren, welches mikrobiologische Zellen immobilisiert, benötigt keine Abtrennung der Enzyme aus den mikrobiologischen Zellen und kann folglich die Reduktion der Enzymaktivität während der Extraktion der Enzyme vermeiden. Desweiteren ist es auch ein Vorteil, dass die komplizierten Prozesse zum Extrahieren und Abtrennen der Enzyme in einem einzelnen Schritt durchgeführt werden können. Folglich stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Verfügung zum kontinuierlichen Herstellen von Fructooligosacchariden und Neotructooligosacchariden durch Immobilisieren von Penicillium citrinum KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung auf einem Träger. Das immobilisierte kontinuierliche Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird im Detail wie folgt erläutert.
Zunächst wird Penicillium citrinum KCTC 10225BP ausgesät und kultiviert. Der ausgesäte, kultivierte Mikroorganismus wird in Massen in einem Fermentationsmedium produziert. Das Aussäen und Kultivieren wird vorzugsweise durchgeführt bei 26 bis 28°C für 2 Tage, wobei gleichzeitig bei einer Geschwindigkeit von 10 bis 200 rpm gerührt wird. Die Massenproduktion wird vorzugsweise durchgeführt bei 26 bis 28°C für 42 bis 72 Stunden, unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 200 bis 600 rpm und unter Injektion von Luft in einer Rate von 0,5 bis 1 v/vm. Die in Masse produzierten Mikroorganismen werden dann gut mit einem Träger vermischt. Die Mischung wird auf Beads aufgebracht, welche dann in eine Säule gepackt werden. Der Träger wird vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Alginat-Gel, fotoquervernetztem Harz, Acrylamid-Gel, k-Canagenen, Chitosan und Gelatine, obwohl Träger, welche im allgemeinen im Stand der Technik verwendet werden, ohne Einschränkung verwendet werden können. Die Konzentration des Trägers ist vorzugsweise 1 bis 2%. Als nächstes wird eine Saccharose-Lösung durch die Säule, gepackt mit den Beads, passiert. Vorzugsweise weist die Saccharose-Lösung eine Konzentration von Brix 60 bis 70 auf und wird bei einer Rate von 100 bis 300 ml/hr passiert sowie bei einer Temperatur von 35 bis 55°C.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von zwei Experimenten, in welchem Furctooligosaccharide durch ein eintopfartiges Verfahren erzeugt werden und ein immobilisiertes kontinuierliches Verfahren unter Verwendung von Penicillium citrinum KCTC 10225BP der vorliegenden Erfindung. Tabelle 1
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, waren 400 g an Mikroorganismen nötig, wenn das eintopfartige Verfahren eingesetzt wurde, um 100 l an Fructooligosacchariden zu erzeugen. Die Reaktionszeit benötigt, um 1 l an Fructooligosacchariden zu erzeugen, betrug ungefähr 24 Stunden. Jedoch waren nach Vervollständigung der Reaktionen weitere 12 Stunden nötig, bis die nächste Reaktion begonnen hatte, um die erzeugten Fructooligosac charide aus den Mikroorganismen abzutrennen, das Reaktionsgefäß zu waschen und das Reaktionsgefäß mit einer frischen Saccharose-Lösung und Mikroorganismen zu befüllen. Im Gegensatz dazu wurden im Fall des immobilisierten kontinuierlichen Verfahrens 50 g an Mikroorganismen benötigt, um 100 l an Fructooligosacchariden zu erzeugen. Die Reaktionszeit benötigte zur Produktion von 1001 an Fructooligosacchariden ungefähr 25 Tage mit einer Produktionseffizienz von 4,02 l/Tag. Dementsprechend wurde gezeigt, dass, wenn das immobilisierte kontinuierliche Verfahren eingesetzt wurde, eine kleinere Menge an Mikroorganismen benötigt wird und die Produktionseffizienz sechsfach höher ist im Vergleich zum eintopfartigen Verfahren.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben unter Verwendung einer Ausführungsform, gezeigt in den folgenden Beispielen. Jedoch sind die Beispiele gedacht zur Illustration der vorliegenden Erfindung und begrenzen nicht den Umfang der Erfindung auf selbige.
Beispiel 1
Identifikation des Mikroorganismus
Mikroorganismen wurden erhalten aus Erdreich, gesammelt um eine Zuckerfabrik, lokalisiert in Inchon, Korea. Einer der Mikroorganismen zeigte sich als eine hohe Fähigkeit aufweisend, Fructosyl-Transferase von einem hohen Titer zu erzeugen. Der neue Mikroorganismus wurde als Penicillium citrinum identifiziert, welcher ein Pilz ist, gehörend zum Genus Penicillium. Der Mikroorganismus wurde hinterlegt beim Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), lokalisiert in Oun-dong, Yusong-gu, Taejon, Korea, am 27. Februar 2001,mit der Hinterlegungs-Zugangs-Nr. KCTC-10225BP, so dass der Mikroorganismus verfügbar sein kann für Dritte.
Der Mikroorganismus Penicillium citrinum KCTC-10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gezüchtet in einem Czapek-Hefen-Algen(CYA)-Medium und Malzextrakt-Algen (MEA), gemeinhin verwendet im Stand der Technik zum Kultivieren von Pilzen. Der identifizierte Penicillium citrinum KCTC 10225BP Mikroorganismus zeigte substantiell ähnliche Eigenschaften und Erscheinungsformen, wenn er in den beiden Medien gezüchtet wurde. Die wisschenschaftlichen Eigenschaften und Morphologien des Mikroorganismus sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Beispiel 2
Aussäen und Kultivieren sowie Messen des Enzym-Titers
Als ein Medium für die Verwendung des Aussäens und Kultivierens des Penicillium citrinum KCTC 10225BP Mikroorganismen wurde eine Modifikation der Mediumszusammensetzung, verwendet beim Kultivieren des Fructooligosaccharid-erzeugenden Mikroorganismus eingesetzt, wie es beschrieben wird in der koreanischen offengelegten Publikationsnummer 1989-1127. Die modifizierte Zusammensetzung ist in Tabelle 3 angezeigt. Der Mikroorganismus wurde in einem 250 ml Kolben kultiviert und die hinzugefügte Menge des Mediums betrug 50 ml. Die Kultivierung wurde durchgeführt in einem Inkubator unter Rühren mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 rpm bei 28°C für zwei Tage. Tabelle 3

Fußnote: pH korrigiert auf 6,0 mit 5N HCl.

Als nächstes wurde der Saccharose-Hydrolyse-Titer an Fructosyl-Transferase, welche hergestellt wurde aus dem kultivierten Penicillium citrinum KCTC 10225BP, gemessen. Der Saccharose-Hydrolyse-Titer wurde gemessen gemäß dem Verfahren beschrieben von Shinohara Satoshi (Japanische ungeprüfte Patentanmeldenummer 10-65192). Der Enzym-Titer wurde definiert als eine Menge (μmol) an Glukose, erzeugt durch Hydrolyse an Saccharose, einem Zuckersubstrat, pro Einheitszeit (Minute). Die Fructosyl-Transferase, hergestellt aus dem Mikroorganismus Penicillum citrinum KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung, zeigte sich als aufweisend eine Saccharose-Hydrolyse-Titer von 1,5 Einheiten/1g an Saccharose genommen als Mittelwert. Solch ein Ergebnis demonstriert, das Fructorylstransferase, abgeleitet von Penicillium citrinum KCTC 10225BP gemäß der vorliegenden Erfindung einen Saccharosehydolyse-Titer aufweist, der jeglichen anderen bekannten Enzymen überlegen ist, betrachtet man die experimentellen Ergebnisse von US-Patent Nr. 5,334,516, in welchem, wenn Saccharose unter Verwendung eines Enzyms abgeleitet von Aspergillus hydrolisiert wurde, zumindest 5 Einheiten des Enzyms benötigt wurden, um 1 g von Saccharose abzubauen, sowie von D. Grizard et al., in welchem 7 Einheiten des Enzyms, abgeleitet von Aspergillus awamori benötigt wurden, um 1 g an Saccharose abzubauen.
Desweiteren war nach einer Untersuchung des Saccharose-Hydrolyse-Titers in Abhängigkeit von der Biomasse der Mikroorganismen festzuhalten, dass mit der Zunahme der Biomasse des Penicillium citrium KTCT 10225BP die Abnahme an Saccharose zunahm.
Beispiel 3
Hauptkultur
Die Hauptkultivierung (Masseproduktion) wurde durchgeführt in einem 5l-Fermentor (Hanil R&D Co., LTD. Korea) unter Verwendung des Mikroorganismus, ausgesät und kultiviert in Beispiel 2. Der Mikroorganismus wurde in einer Menge von 5% (v/v) des Mediums in dem Fermentor verimpft. Die Reaktionsbedingungen waren eine Modifikation des Verfahrens beschrieben von Yu Moo-Young (koreanische offengelegte Publikationsnummer 1989-01127). 2a zeigt die Veränderung in der Biomasse der Mikroorganismen gemäß dem Kultivierungszeitraum nach Variieren der Rührgeschwindigkeit des Rührers in dem Fermentor von 300 rpm auf 500 rpm. Wie in 2 zu sehen ist, nahm mit Zunahme der Rührgeschwindigkeit die Menge der Mikroorganismen zu. 2b zeigt die Veränderung in der Menge von intrazellulären und extrazellulären Enzymen mit der Rührgeschwindigkeit. Bei der Rührgeschwindigkeit von 500 rpm zeigte die Menge an intrazellulären Enzymen eine Tendenz, nach 50 Std. abzunehmen. Man glaubte, dass dies verursacht wurde durch Rühren der Mikroorganismen und durch Schädigung der Umgebung in dem Fermentor. In ähnlicher Art und Weise war bei der Rührgeschwindigkeit von 400 rpm die Menge des intrazellulären Enzyms nach 50 Std. reduziert. Jedoch wurde keine Zunahme der Menge an extrazellulärem Enzym beobachtet. Die Zunahme der Menge des extrazellulären Enzyms aufgrund von Sekretion von Mikroorganismus wurde zu ungefähr 20 Einheiten erwartet, berücksichtigend das Volumen des Fermentors, was zu klein war, um gemessen zu werden. 2c zeigt die Veränderung in der Biomasse der Mikroorganismen sowie die Menge der intrazellulären Enzyme mit der Fermentationszeit der Hauptkultur unter Verwendung eines Fermentors bei der Rührgeschwindigkeit von 600 rpm. Über die Kultivierungszeit nahm die Biomasse der Mikroorganismen sowie die Menge des Enzyms zu. Wenn die Rührgeschwindigkeit des Fermentors erhöht wurde, zeigte die Biomasse der Mikroorganismen eine Tendenz, zuzunehmen. Mit Blick auf die Morphologie wurden Mikrokolloide beobachtet bei der Rührgeschwindigkeit von 400 rpm oder mehr und große Pellets mit einem Durchmesser von 2 mm wurde bei einer Rührgeschwindigkeit von 200 rpm oder weniger beobachtet.
Mit Blick auf die Enzymproduktion betrug die Menge des Enzyms, vorliegend in den Mikroorganismen, 1400 Einheiten pro 1 g an Mikroorganismus und die Menge des Enzyms, existierend außerhalb der Mikroorganismen betrug 150 Einheiten pro 1 ml des Kultivierungsmediums. Folglich wurde gezeigt, dass der Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung 2,8fach mehr an Enzym erzeugt, als der und Penicillium citrinum FERM P-15944 von Shinohara et al., (japanische ungeprüfte Patentanmeldenummer 10-165192), welche das Enzym in einer Menge von 500 Einheiten/g enthält.
Beispiel 4
Erzeugen von Fructooligosacchariden unter Verwendung eines eintropfartigen Verfahrens
Fructooligosaccharide wurden erzeugt durch Umsetzen der Mikroorganismen, hergestellt in Beispiel 2, mit einer Saccharose-Lösung. Der Gesamtanteil an Fructoseoligosacchariden (Festanteil in Prozent) wurde berechnet durch Dividieren durch die Summe der erzeugten konventionellen Furctoseoligosacchande, Neofructooligosaccharide, Fructose, Glukose und verbliebener Saccharose.
Die Veränderung des Gesamtanteils an Fructooligosacchariden (Feststoff in Prozent) wurde abhängig von der Rührgeschwindigkeit, Kultivierungszeit, Saccharosekonzentration, pH und Temperaturveränderung gemessen. In 3a ist die Veränderung in der Menge der insgesamt produzierten Fructooligosaccharide entsprechend der Konzentration an Saccharose gezeigt. Die höchste Ausbeute der Produktion der Oligosaccharide wurde bei einer Saccharosekonzentration an Brix 60 bis 70 beobachtet. Wenn die Konzentration der Saccharose höher war als Bix 70, kristallisierte die Saccharose als weißer Niederschlag aus, was die Reaktion mit Fructooligosacchariden behinderte. Folglich ist die optimale Konzentration an Saccharose für die industrielle Produktion bis zu Brix 70.
Auf der anderen Seite kann mit einer geringen Konzentration an Saccharose die Reaktion durch andere Mikroorganismen kontaminiert werden. Dementsprechend zeigte sich, dass die optimale Konzentration an Saccharose Brix 65 bis 70 war. Mit Blick auf die Reaktionszeit erreichte in 24 Stunden der Feststoffanteil das Maximum von 65%, was nahelegte, dass die vorliegende Erfindung ohne Probleme für die praktische industrielle Produktion eingesetzt werden kann.
3b zeigt die Veränderung der Fructooligosaccharid-Anteile (Feststoffe in Prozent) gemäß der vorliegenden Erfindung bei pH von 3 bis 7. Es wurde festgehalten, dass bei einem pH von 5 bis 7 die Effizienz der Produktion an Fructooligosacchariden hoch ist.
In den nachfolgenden Experimenten wurde die Saccharose-Lösung einer Reaktion unterzogen, ohne Einstellen des pH der Reaktion, durch Zugabe einer separaten Pufferlösung. Folglich kann das Verfahren zum Erzeugen von Neofructooligosacchariden desweiteren simplifiziert werden, ohne eine weitere Behandlung, mit Blick auf die industrielle Produktion.
3c zeigt die Veränderung des gesamten Fructooligosaccharid-Anteils (Feststoff in Prozent) mit der Reaktionstemperatur. Der Gesamtanteil an Fructooligosacchariden zeigte eine Tendenz, konstant bis zu 40°C zuzunehmen. Die höchste Aktivität wurde bei 45°C mit Blick auf die Reaktionsrate beobachtet. Die Reaktion wurde als vervollständigt in 24 Stunden gezeigt. Es ist zu erwarten, dass die Probleme, assoziiert mit der Kontamination durch andere Mikroorganismen gelöst werden könnten, da die Kultivierung bei einer hohen Temperatur durchgeführt wurde. Jedoch war die Gesamtmenge an erzeugten Fructooligosacchariden nicht signifikant höher, obwohl der Enzym-Titer bei 45°C größer war als diejenigen, offenbart in anderen Dokumenten. Dies kann erklärt werden durch eine Theorie, welche vorgeschlagen worden ist, festhaltend, dass die Erzeugung an Oligosacchariden durch Akkumulation von Glukose, erzeugt durch Hydrolyse an Saccharose in dem Reaktor inhibiert wird.
Als eine Lösung für dieses Problem wurden Verfahren zum Verbrauch von Glukose vorgeschlagen, welche Beispielsweise ein Verfahren zum Verbrauchen von Glukose durch Zugabe von Glukoseoxydase oder Hefe einschließen (siehe Yoon, Jong-won, et al., The Bulletin of the Korean Society for Biotechnology and Bioengineering, 9, 40-47, 1994).
Jedoch wurde in der vorliegenden Erfindung ein solches Verfahren nicht eingesetzt, da möglicherweise Verunreinigungen erzeugt würden.
3d zeigt die Veränderung des Gesamtanteils an Fructooligosacchariden (Feststoffe in Prozent) mit der Rührgeschwindigkeit. Es wurde festgehalten, dass die Reaktivität mit der Zunahme der Rührgeschwindigkeit abnahm. Man glaubt, dass die Reaktionsfläche zwischen den Mikroorganismen und der Saccharose-Lösung vermindert war durch Blasen, erzeugt, wenn der Rührer bei einer hohen Geschwindigkeit rührte. Folglich wurde festgehalten, dass die optimale Rührgeschwindigkeit bis zu 200 rpm ist. In der vorliegenden Erfindung wurden 100 rpm für die Produktion für die Fructooligosacchariden verwendet. Als eine Konsequenz des Durchführens der oben beschriebenen Experimente zur Erzeugung von Fructooligosacchariden enthaltend Neofructooligosaccharide sind die optimalen Bedingungen zum Erzeugen von Fructoolisosacchariden definiert als eine Saccharosekonzentration von Brix 60 bis 65, eine Reaktionstemperatur von 45°C, eine Reaktionszeit von 24 Stunden sowie eine Rührgeschwindigkeit von 100 rpm.
Beispiel 5
Kontinuierliche Erzeugung von Fructooligosacchariden über Immobilisierung von Mikroorganismen
Penicillium citrinum KCTC 10225BP, ausgesät und kultiviert in Beispiel 2, wurde in einer Menge von 5% (v/v) an Medium verimpft und in einem 5l Fermentor (Hanil R&D Co., Ltd., Korea) kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Mikroorganismen eingesammelt und in Natriumalginat immobilisiert (Junsei Chemical, Japan), um Fructooligosaccharide zu erzeugen. Die Mikroorganismen wurden bei einer bestimmten Konzentration mit der Alginat Biomasse vermischt. Die sich ergebende Mischung wurde in einer vorher bestimmten Rate unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe (Gilson, France) zum Fließen gebracht und durch eine Nadel mit einem Durchmesser von 1 mm bei einer Höhe von 20 cm zu 1 %iger wässriger Kalzium-Chlorid-Lösung (CaCl₂) getropft, wobei gleichzeitig unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt wurde. Die 1%ige wässrige Kalzium-Chlorid-(CaC1₂)-Lösung wurde verwendet, um Beads über eine Ionenaustauschreaktion zwischen Kalzium-Ionen (Ca²⁺) in der Lösung und Natrium-Ionen (Na⁺) des Alginats auszubilden. Um die optimalen Konzentrationen der Mikroorganismen und des Alginats, welche miteinander kombiniert werden sollten, zu bestimmen, wurden die Mikroorganismen bei der Konzentration von 25 bis 100 g/l vermischt mit dem Alginat bei einer Konzentration von 1 bis 2%. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass wenn Mikroorganismen bei einer Konzentration von bis zu 50 g/l mit dem Alginat vermischt wurden, bei einer Konzentration von bis zu 1,5%, perfekt kugelförmige Beads ausgebildet wurden. Oberhalb der obengenannten Konzentrationen wurden Beads von nicht einheitlichen Formen ausgebildet aufgrund der Zunahme der Viskosität. Folglich wurden in diesem Beispiel Mikroorganismen bei einer Konzentration von 50 g/l mit dem Alginat bei einer Konzentration von 1,5% vermischt, um die Beads zu erzeugen. Die resultierenden Beads wurden bei 4°C für 10 Stunden gelagert, gewaschen mit destilliertem Wasser und in eine Saccharose-Lösung von Brix 60 bei 4°C für 10 Stunden zum Altern eingetaucht. Anschließend wurden die Beads in eine 1 l Säule aus Glas gepackt und eine Saccharose-Lösung von Brix 60 wurde durch die Säule passiert. Hier betrug die Reaktionstemperatur 45°C und die Saccharose-Lösung wurde injiziert in einer Rate von 200 ml/Stunden durch eine peristaltische Pumpe. 4 zeigt die Veränderung in der Menge an Fructooligosacchariden und Neofructooligosacchariden, erzeugt von dem immobilisierten kontinuierlichen Verfahren für 40 Tage. Es wurde festgehalten, dass der feste Anteil der insgesamt produzierten Fructooligosaccharide (%) konstant war innerhalb eines Bereiches von 55 bis 60% und sowohl Form als auch Härte der Beads nicht von einem ursprünglichen Stadium abwich.
Als eine Konsequenz des Durchführens der oben beschriebenen Experimente zur Erzeugung von Fructooligosacchariden enthaltend Neofructooligosaccharade zeigten sich die optimalen Bedingungen zum Erzeugen von Fructooligosaccharide durch das immobilisierte kontinuierliche Verfahren als eine so große Konzentration von Brix 60, eine Reaktionstemperatur von 45°C und eine Flußrate der Saccharose-Lösung von 150 bis 200 ml/Stunden.
Beispiel 6
Analyse von Fructooligosacchariden
Die Fructooligosaccharide, erhalten aus Beispiel 4 und Beispiel 5 wurden analysiert unter Verwendung eines High-Performance Flüssigkeits-Chromatografie (HPLC)-Systems (Shimazu, Japan). Eine ODS-Säule (5 um, 150 mm x 4 mm), erzeugt von Daiso Co., Ltd. (Osaka, Japan) und ein Refraktions-Index-Nachweisgerät wurden eingesetzt. Da eine Substanz, unterschiedlich von konventionellen Fructooligosacchariden nachgewiesen wurde, wurden die Produkte abgetrennt unter Verwendung eines erzeugenden präpara tiven High-Performance-Flüssigkeits-Chromatografie-Systems (Prep-HPLC), erzeugt durch Waters Corp. (Massachusetts, USA). Die resultierenden Refraktionen wurden einer NMR-Analyse unter Verwendung eines ARX 400 MHz Spektrometer (Bruker, Germany) unterzogen, um ihre Struktur zu bestimmen. Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
Wie in der oben gezeigte Tabelle dargestellt, wurde bestätigt, dass die Fructooligosaccharide, erzeugt unter Verwendung von Penicillium citrinum KCTC 10225BP-Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung, konventionelle Fructooligosaccharide (Formel I) wie auch Neofructooligosaccharide (Formel II) enthielten mit einer Struktur unterschiedlich derjenigen der konventionellen Fructooliosaccharide. Folglich wurde bestätigt, dass der Penicillium citrinum KCTC 10225BP-Mikroorganismus, verwendet in der vorliegenden Erfindung konventionelle Fructooligosaccharide gleichzeitig mit Neofructooligosacchariden einer unterschiedlichen Struktur erzeugen kann.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie oben beschrieben, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung einen neuen Mikroorganismus, Penicillium citrinum KCTC 10225BP identifiziert, welcher Saccharose in konventionelle Oligosaccharide und Neofructooligosaccharide hydrolisieren kann. Fructosyl-Transferase, erzeugt aus dem Penicillium citrinum KCTC 10225BP zeigt einen Saccharose-Hydrolyse-Titer von wesentlich höher als die von konventionellen Mikroorganismen abgeleiteten Enzyme. Folglich ist es unter Verwendung von Penicillium citrinum KCTC 10225BP möglich, Fructooligosaccharide zusammen mit Neofructooligosacchariden in einer hohen Ausbeute bei geringen Kosten zu erzeugen.

Claims

Penicillium citrinum KCTC 10225BP aus Erdreich-Ursprung, in der Lage Fruktosyltransferase zu erzeugen und Saccharose in Fruktooligosaccharide der folgenden Formel I zu hydrolisieren:
in welcher n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, G Glukose repräsentiert und F Fruktose repräsentiert und Neofruktooligosaccharide der folgenden Formel II:
in welcher n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, G und F, wie oben definiert sind, unter Verwendung von besagtem Enzym Fruktosyltransferase.
Ein Verfahren zum gleichzeitigen Produzieren von Fruktooligosacchariden und Neofruktooligosacchariden aus Saccharose unter Verwendung eines Mikroorganismus Penicillium citrinum KCTC 10225BP, wie in Anspruch 1 definiert.
Das Verfahren zum Produzieren von Fruktooligosacchariden und Neofruktooligosacchariden gemäß Anspruch 2, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: Aussäen und Kultivieren des Penicillium citrinum KCTC 10225BP Mikroorganismus, wie in Anspruch 1 definiert, in einem ersten aussäenden Medium bei 26 bis 28°C für 2 Tage unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 100 bis 200 rpm, um den Mikroorganismus zu aktivieren; Massenproduktion des Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium bei 26 bis 28°C für 72 Stunden, unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 200 bis 600 rpm und Injektion von Luft bei einer Rate von 0,5 bis 1 v/vm; und Einsammeln der produzierten Mikroorganismen durch Zentrifugation, je zweimaliges Waschen mit 0,85%iger physiologischer Salzlösung, gefolgt von Kultivieren in einer Saccharoselösung mit einer Brix-Konzentration von Saccharose von 60 bis 77, wie durch ursprüngliches Insertieren eines Sensor gemessen wird, bei einer Temperatur in einer Größenordnung von 35 bis 50°C und bei einem pH von 5 bis 7 für 20 bis 50 Stunden unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 100 bis 200 rpm.
Das Verfahren zum Erzeugen von Fructooligosacchariden und Neoffructooligosacchariden gemäß Anspruch 2, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: Aussäen und Kultivieren des Penicillium citrinum KCTC 10225BP Mikrooganismus, wie in Anspruch 1 definiert; Massenproduzieren der ausgesäten und kultivierten Mikroorganismen; Vermischen der massenproduzierten Mikroorganismen mit einem Träger, um Beads auszubilden, welche dann in eine Säule gepackt werden; und Passieren einer Saccharose-Lösung durch die Säule, gepackt mit den Beads.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Schritt des Aussäens und Kultivierens bei 26 bis 28°C für zwei Tage durchgeführt wird unter Rühen bei einer Geschwindigkeit von 100 bis 200 rpm.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der massenproduzierende Schritt durchgeführt wird bei 26 bis 28°C für 42 bis 72 Stunden unter Rühren bei einer Geschwindigkeit von 200 bis 600 rpm und Injizieren von Luft bei einer Rate von 0, 5 bis 1 v/vm.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Träger einer ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alginat-Gel, photoquervernetztem Harz, Acrylamidgel, Chitosan und Gelatine.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Träger verwendet wird bei einer Konzentration von 1 bis 2%.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Beads erzeugt werden durch Tropfen der Mischung der Mikroorganismen und des Carriers durch eine Nadel mit einem Durchmesser von 1 mm zu einer 1 bis 2%igen wässrigen Kalziumchlorid (CaCl₂)-Lösung.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Saccharoselösung eine Konzentration von Brix 60 bis 70 aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Saccharoselösung durch die Säule bei 35 bis 55°C passiert wird und mit einer Rate 100 bis 300 ml/Stunde.