CN111903845B - 一种利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法。所示方法包括以农产品加工副产物糖蜜为原料，利用果糖基转移酶FRC1进行低聚果糖转化的步骤。本发明生产得到的功能性生物饲料,可与其它全价饲料按照0.5%‑1%的添加量使用，利用该技术生产的生物饲料，在添加量为1%时，在肉鸡饲喂试验中死淘率、料肉比和日增长等数值均显著优于对照组，和抗生素组相比无显著差异，表明其可以成为有效的抗生素替代品。

Description

一种利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法。

背景技术

长期以来，抗生素在饲料中的滥用带来了严重的食品安全问题，抗生素替代品的研究日益受到重视。功能性低聚糖具有无污染、无残留、在体内参与肠道代谢、维持宿主微生态平衡等特点，作为一种较理想的可替代抗生素的饲料添加剂。低聚果糖在畜禽养殖中的作用主要表现在选择性增殖双歧杄菌等有益菌，益生菌大量增殖,生成酸性物质降低肠道pH，抑制有害菌的生长,提高动物抗病能力。同时益生菌在生长过程中可以合成大量B族维生素、短链脂肪酸。低聚糖如甘露聚糖还具有吸附肠道病原菌的功能，对动物起到很好的保健作用。

但是，多年来低聚果糖的生产成本始终居高不下，虽在功能性食品领域有较广泛的应用,但在较廉价的饲料中添加功能性低聚糖的成本仍相对较高,这种情况严重限制了低聚果糖在饲料行业的应用。开发低成本的功能性低聚果糖生产技术显得尤为必要。

低聚果糖的生产有微生物转化、酶转化和天然产物中提取三种方法。目前市场的主流生产方法为利用结晶的高纯度蔗糖为原料，通过果糖基转移酶的转化，然后进行色谱分离，浓缩，脱色等过程。由于果糖基转移酶在转化过程中受葡萄糖的抑制，因此在转化过程中低聚果糖的转化率有80-85%的转化率，加之蔗糖的价格居高不下，生产成本居高不下。因此目前低聚果糖主要应用于食品当中，其高昂的生产成本严重限制了其在饲料当中的应用。

蔗糖精炼过程中的副产物糖蜜的主要成分为蔗糖，特别是以甜菜为原料的糖蜜中蔗糖的含量能够占到70%（相对于干物质），因此是制备饲料低聚果糖的优质廉价原料。然而糖蜜采用市售的果糖基转移酶进行转化时，糖蜜中蔗糖的转化率通常在25-30%，远远低于以纯蔗糖为原料的转化率（转化率在80-85%），具体原因尚不明确，这也是目前糖蜜没有采用该项方案进行大规模生产的根本原因。本发明考察了多个市售及通过重组表达技术获得的果糖转移酶在糖蜜中的转化工艺，令人惊奇的发现，当糖蜜在高温70-75℃时，可以显著提高其转化率。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种简单易行、生产成本低的以废糖蜜为原料制备低聚果糖，兼具生产葡萄糖酸钙的方法。

根据本发明的利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法，包括以农产品加工副产物糖蜜为原料，利用高温果糖基转移酶FRC1进行低聚果糖转化的步骤，其中所述高温果糖基转移酶FRC1的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

根据本发明的利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法，其中，向糖蜜原料中加入500-1000U/kg的果糖基转移酶FRC1，在75℃搅拌转化12-24小时。

根据本发明的利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法，还包括向原料中加入碳酸钙，以及葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶得到含葡萄糖酸钙的转化液的步骤。

根据本发明的利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法，通过加水调整糖蜜到干物质含量为50%，然后利用氢氧化钾（钠）或其他碱性物质调整pH值至6.5。

根据本发明的利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法，包括以下步骤：

（1）全基因合成高温果糖基转移酶FRC1，连接到Pic9酵母表达载体，并转化毕赤酵母GS115，筛选阳性克隆，经发酵诱导培养获得粗酶液；

（2）将市售干物质含量为50-70%的糖蜜，通过加水调整到干物质含量为50%，然后利用氢氧化钾（钠）或其他碱性物质调整pH值至6.5；

（3）加入500-1000U/kg的高温果糖基转移酶FRC1，75℃，搅拌转化12-24小时进行低聚果糖的转化；

（4）降温至45℃，加入80-120g/kg的碳酸钙，然后加入1000-2000U/kg的葡萄糖氧化酶和10000-20000U/kg的过氧化氢酶，通风搅拌12小时进行葡萄糖酸钙的转化，然后升温至80-100℃进行灭酶；

（5）进入板框压滤除去未反应的碳酸钙，同时将反应液进行澄清，然后进入多效蒸发浓缩至干物质含量70-75%；

（6）加入玉米芯或者其他吸水能力强的饲料原料进行吸附，干燥后粉碎，过筛得到产品。

本发明直接利用生物酶和农产品加工副产物进行生产，无需分离纯化，可以将转化液直接浓缩并与载体吸附进行干燥，制备含低聚果糖及葡萄糖酸钙的具有替代抗生素功能的生物饲料添加剂。这种含低聚果糖及葡萄糖酸钙的功能性饲料添加剂生产技术，由于使用了价格较为低廉的农产品加工副产物糖蜜为原料，同时利用特定的果糖基转移酶FRC1，显著提高了其低聚果糖的转化率，转化率为67.4%，约为市售商业果糖基转移酶的3.0倍，后期加工过程中又免去了低聚果糖及葡萄糖酸钙的纯化工序，因此大大降低了其生产成本,使其在畜牧养殖业中的应用切实可行的。

具体实施方式

本发明首先筛选获得了具有高效转化糖蜜的果糖基转移酶FRC1，然后以农产品加工副产物糖蜜和碳酸钙为原料，利用果糖基转移酶FRC1，结合商业市售的葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶的系统酶转化，得到富含功能性低聚果糖及葡萄糖酸钙的转化液，进一步经蒸发浓缩与纤维类物质为载体进行混合吸附干燥，得到含有低聚果糖及葡萄糖酸钙的具有替代抗生素功能的生物饲料添加剂，其中每100kg功能性饲料添加剂中含低聚果糖20-25kg、葡萄糖酸钙10-15kg、水分8-10kg。

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步说明。

实施例1、果糖基转移酶对糖蜜中蔗糖的转化率的影响

目前商业使用的果糖基转移酶为来源于黑曲霉的的果糖基转移酶，其基因序列如NCBI数据库ABB59678.1所示，最适温度为45-50℃，本发明中的果糖基转移酶FRC1与之相似性为64.4%，最适温度为70-75℃，以糖蜜为原料，商业酶酶活在50℃下标定，FRC1在75℃下标定，在添加量为1000U/L下，分别在最适温度下转化12和24小时后，商业酶对糖蜜的转化率分别为22.4%和23.6%，FRC1对糖蜜的转化率分别为64.2%和67.4%。

实施例2、具有替代抗生素功能的生物饲料添加剂的制备方法

（1）在2吨的反应釜中，称取1吨干物质含量在70%的甜菜糖蜜，其中蔗糖含量为46%，加水400公斤，开启搅拌将物料混合均匀后，用10%的氢氧化钾调整pH值为6.5。然后调整搅拌转速在60-80转/分钟，逐渐升温至75℃后，加入1公斤酶活为1500U/mL的果糖基转移酶，温度保持在75℃，持续转化12小时，此时通过HPLC测定，低聚果糖含量为18.2%。果糖基转移酶的酶活测定及低聚果糖的含量测定均参照GBT-23528-2009中执行。

（2）将温度降低到45℃后，加入80-100公斤的碳酸钙后，搅拌均匀后，依次加入1公斤的10000U/mL的葡萄糖氧化酶和200000U/mL的过氧化氢酶，通风比1：0.2，35℃转化12小时。转化结束后，升温至70℃进行灭酶。此时反应液中葡萄糖酸钙的含量为8.6%。葡萄糖酸钙含量的测定方法参照GB15571-2010测定。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的酶活测定方法参照DB41/T 1729-2018和QB/T 4614-2013方法进行标定。

（3）将上述反应液通过板框压滤，除去未反应的碳酸钙，同时将料液进行澄清后，进入三效低温浓缩至固形物含量为70%后结束，此时浓缩液中低聚果糖和葡萄糖酸钙的含量为26.7%和13.2%。

（4）将上述浓缩液体和300公斤的玉米芯粉进行混合均匀后，进入流化床进行烘干至水分含量为8-10%，降温后粉碎过筛，此时测得产品中低聚果糖和葡萄糖酸钙的含量为25.3%和12.4%。

在本实施例中，步骤（1）中加入1公斤酶活为500U或1000U的高温果糖基转移酶FRC1，70-75℃，搅拌转化12-24小时进行低聚果糖的转化。

本发明制备的具有替代抗生素功能的生物饲料添加剂需与其它配合饲料共用，为畜禽生长提供营养的同时，摄入低聚果糖和葡萄糖酸钙以调高畜禽的免疫能力和抗病能力，减少饲喂过程中抗生素的使用量或者停用抗生素，实现“绿色养殖”。使用本发明生产的具有替代抗生素功能的生物饲料添加剂饲喂猪、肉鸡、鱼,添加量约分别为0.5%-2%。

实施例3、具有替代抗生素功能的生物饲料在肉鸡实验的效果验证

实验方法：

试验动物为144只1日龄AA肉鸡，随机分为3个处理（ABC），每个处理4个重复，每个重复12只鸡(公母各半)。经统计分析各处理初始体重差异不显著(P<0．05)。基础饲粮以玉米和豆粕为主要原料，参照中华人民共和国农业行业标准肉仔鸡饲养标准（ NY/T33-2004 ）设计饲料配方。其中A组为基础日粮对照，B组为加基础日粮基础上添加0.1%的金霉素（5%预混剂），C组为基础日粮加1%的本发明所产的生物饲料。饲喂周期21天后，称重统计。实验结果如表1所示。

表1 生物饲料替代抗生素对肉鸡生长性能的影响

从各个指标来看，抗生素组和生物饲料组都与对照组存在显著差异，其中生物饲料组在料肉比上与抗生素组相比有提升，表明利用本发明生产的生物饲料完全可以替代抗生素。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 一种利用糖蜜生产具有替代抗生素功能的生物饲料的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 619

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Phe Ser Leu Phe Leu Thr Ala Gly Ser Leu Ala Trp Ala Lys

1 5 10 15

Pro Ser Thr Pro Lys Leu Asp Tyr Asn Arg Ala Pro Pro Asn Leu Ser

20 25 30

Thr Leu Ala Asn Leu Thr Ile Tyr Asn Thr Trp Arg Pro Arg Ala His

35 40 45

Val Leu Pro Pro Thr Gly Gln Ile Gly Asp Pro Cys Met His Tyr Thr

50 55 60

Asp Pro Lys Thr Gly Leu Phe His Val Gly Tyr Leu His Glu Gly Ala

65 70 75 80

Ala Gly Ala Thr Thr Glu Asp Leu Val Thr Tyr Arg Asp Leu Asn Pro

85 90 95

Gly Gly Ala Pro Phe Ile Arg Ala Gly Gly Leu Asn Asp Pro Val Ala

100 105 110

Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Lys Gly Ile Asn Gly Thr Pro Thr

115 120 125

Leu Phe Tyr Thr Ser Val Ser Tyr Leu Pro Ile His Trp Thr Leu Asn

130 135 140

Tyr Thr Arg Gly Ser Gln Thr Gln Ser Leu Ala Val Ser Lys Asp Gly

145 150 155 160

Gly Arg Asn Phe Thr Lys Leu Arg Gln Gly Pro Ala Ile Pro Ala Pro

165 170 175

Pro Phe Ala Leu Asn Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Phe Val Phe Gln

180 185 190

Asn Lys Asp Leu Asp Ser Leu Leu Glu Ser Glu Ser Gly Thr Trp Tyr

195 200 205

Ser Val Ile Ser Gly Gly Val His Gln Lys Gly Pro Ser Met Phe Leu

210 215 220

Tyr Arg Gln His Asp Pro Glu Phe Gln Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu

225 230 235 240

Trp Trp His Glu Lys Ala Asn Thr Thr Trp Gly Asp Gly Leu Trp Ala

245 250 255

Gly Arg Tyr Gly Phe Asn Phe Glu Val Ala Asn Val Phe Ser Val Asp

260 265 270

Glu Lys Gly Tyr Asn Ser Asp Gly Glu Thr Phe Ile Thr Phe Gly Ala

275 280 285

Glu Trp Gln Glu Lys Pro Ile Val Pro Gln Val Ser Ser Phe Arg Asp

290 295 300

Met Leu Trp Ala Ala Gly Asn Ile Ser Leu Asp Asn Gly Lys Pro Lys

305 310 315 320

Phe Thr Pro Ser Met Val Gly Lys Leu Asp Trp Gly Arg Ser Ala Tyr

325 330 335

Ala Ala Ala Gly Lys Tyr Leu Pro Ser Asp Ser Lys Ala Ser Ser Lys

340 345 350

Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Tyr Leu Trp Leu Thr Gly Asp

355 360 365

Tyr Tyr Gly Asp Leu Lys Tyr Phe Pro Thr Pro Gln Gln Asn Trp Thr

370 375 380

Gly Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Thr Val Gly Arg Ile Ser Asn

385 390 395 400

Val Val Asp Asn Glu Leu Ser Arg Glu Glu Gly Ser Trp Arg Val Glu

405 410 415

Arg Asn Glu Ser Gly Val Leu Glu Leu Ala Thr Leu Lys Gln Val Ile

420 425 430

Ala Arg Glu Pro Met Ala Glu Phe Thr Lys Lys Ile Ser Phe Val Glu

435 440 445

Pro Gly Arg Asn Ile Ser Lys Ala Gly Ser Ala Pro Phe Asp Arg Asn

450 455 460

Pro Glu Ser Lys Phe Tyr Val Leu Lys Ser Ser Ile Ser Phe Pro Lys

465 470 475 480

Ser Ala Arg Asp Ser Glu Leu Lys Ala Gly Phe Gln Ile Leu Ala Ser

485 490 495

Asp Lys Glu Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn Glu Ser Ile

500 505 510

Ile Ile Asp Arg Ser Asn Thr Ser Ala Ala Ala Leu Thr Thr Ser Asp

515 520 525

Ile Asp Ala Arg Pro Glu Ala Gly Arg Leu Arg Leu Phe Asp Val Leu

530 535 540

Val Asp Glu Asp Glu Lys Ile Glu Thr Leu Asp Leu Thr Ile Val Val

545 550 555 560

Asp Asn Ala Ile Val Glu Val His Ala Asn Asp Arg Phe Gly Val Ala

565 570 575

Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Ala Asp Ser Thr Asp Ile Arg Phe Phe

580 585 590

His Gln Gly Ser Gly Glu Val Ser Phe Ser Asn Val Thr Ile Tyr Glu

595 600 605

Gly Leu Ala Asp Ala Trp Pro Glu Arg Lys Arg

610 615

Claims (5)

1.一种利用糖蜜生产生物饲料的方法，其特征在于，所述方法包括以农产品加工副产物糖蜜为原料，利用果糖基转移酶FRC1进行低聚果糖转化的步骤，其中，

所述果糖基转移酶FRC1的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，向糖蜜原料中加入500-1000U/kg的果糖基转移酶FRC1，在75℃搅拌转化12-24小时。

2.根据权利要求1所述的利用糖蜜生产生物饲料的方法，其特征在于，还包括向原料中加入碳酸钙、以及葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶得到含葡萄糖酸钙的转化液的步骤。

3.根据权利要求1所述的利用糖蜜生产生物饲料的方法，其特征在于，通过加水调整糖蜜到干物质含量为50%，然后调整pH值至6.5。

4.根据权利要求1所述的利用糖蜜生产生物饲料的方法，其特征在于，所述方法包括加入玉米芯或者其他吸水能力强的饲料原料进行吸附的步骤。

5.根据权利要求1所述的利用糖蜜生产生物饲料的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）合成氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的果糖基转移酶FRC1编码基因，并转化毕赤酵母，经发酵诱导培养获得粗酶液；

（2）将原料糖蜜，通过加水调整到干物质含量为50%，然后调整pH值至6.5；

（3）向原料中加入500-1000U/kg的果糖基转移酶FRC1，75℃，搅拌转化12-24小时进行低聚果糖的转化；

（4）降温至45℃，加入80-120g/kg的碳酸钙，然后加入1000-2000U/kg的葡萄糖氧化酶和10000-20000U/kg的过氧化氢酶，通风搅拌12小时进行葡萄糖酸钙的转化，然后升温至80-100℃进行灭酶；

（5）进入板框压滤除去未反应的碳酸钙，同时将反应液进行澄清，然后进入多效蒸发浓缩至干物质含量70-75%；

（6）加入玉米芯或者其他吸水能力强的饲料原料进行吸附，干燥后粉碎，过筛得到产品。