DE60020777T2

DE60020777T2 - Herstellung von Chitin und Chitosan

Info

Publication number: DE60020777T2
Application number: DE60020777T
Authority: DE
Inventors: Mei-Huei Chen; Hing-Yuen Chen; Chih-Lu Wu; Su-Hui Chuang; Ing-Er Hwang; Yen-Li Chen
Original assignee: Food Industry Research and Development Institute
Current assignee: Food Industry Research and Development Institute
Priority date: 1999-07-08
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2020-02-11
Also published as: EP1471148B1; CN1128883C; CN1900125A; CN1289686C; EP1067197A3; DE60020777D1; EP1471148A3; HK1066565A1; CN1515676A; EP1471149A1; US6399338B1; EP1067197A2; DE60039201D1; EP1067197B1; US6255085B1; TW530089B; CN1282792A; EP1471148A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Chitin ist ein hoch unlösliches N-acetyliertes Polymer aus β-(1,4)-D-Glucosamin. Chitosan ist eine säurelösliche, deacetylierte Form von Chitin. Chitin, Chitosan und deren Derivate werden in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen, einschließlich der Herstellung von viskositätssteuernden Mitteln, Klebemitteln, chromatographischen Trägern, Papierstärkungsmitteln, Flockungsmitteln, Lebensmittelzusatzstoffen, Arzneimitteln und Kosmetika, verwendet.
Chitin kann durch Entproteinierung und Entkalkung von Krebs- oder Krabbenschalen hergestellt werden. Chitosan kann dann durch Deacetylierung des Chitins mit einer heißen Alkalilösung erhalten werden. Dieses Chitosanherstellungsverfahren hat eine Vielzahl unvorteilhafter Eigenschaften. Z.B. verlangt das Verfahren teure Heizenergie und ätzendes Alkali, das ein mögliches Gesundheitsrisiko darstellt. Das Verfahren erzeugt auch große Mengen an Abfall, wodurch beträchtliche Entsorgungskosten erforderlich werden. Zusätzlich ist die Versorgung mit Krabben- oder Krebsschalen höchst abhängig von saisonalen Faktoren oder Umweltfaktoren, was zu unvorhersagbaren Beschränkungen der Produktionskapazität führt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass unerwartet hohe Ausbeuten an Chitosan oder Chitin aus dem Pilz Rhizopus azygosporus erhalten werden können.
Demgemäß zeigt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan oder Chitin durch (1) Kultivierung eines Rhizopus azygosporus Pilzes in einem Medium, um eine Kultur zu bilden, und (2) Isolierung von Chitosan oder Chitin aus den Zellen. Z.B. können Chitosan und Chitin aus der Kultur durch Abtrennen der Pilzzellen von der Kultur und Isolieren des Chitosans oder Chitins aus den abgetrennten Zellen isoliert werden.
Ein Medium, das nützlich für das Verfahren der Erfindung ist, kann ungefähr 5 bis 60 g/l (z.B. ungefähr 30 g/l) Corn Steep Liquor, ungefähr 10 bis 100 g/l (z.B. ungefähr 50 g/l) Glucose, ungefähr 0,01 bis 30 g/l (z.B. ungefähr 2,5 g/l) Ammoniumsulfat oder andere geeignete Inhaltsstoffe einschließen.
Die Verfahren der Erfindung erlauben die Produktion von Chitosan oder Chitin in überraschenderweise hohen Ausbeuten aus einer Kultur, die einen Rhizopus azygosporus Pilz enthält. Des Weiteren wurde entdeckt, dass ein Medium, das Corn Steep Liquor, Glucose, Hefeextrakt und Ammoniumsulfat enthält, in der Lage ist, den Ertrag an Chitin und Chitosan aus einer Pilzkultur zu erhöhen. Daher stellen die Verfahren eine Alternative zur Herstellung von Chitin und Chitosan ohne Verlass auf umweltschädliche Chemikalien oder die veränderliche Menge an Schalentierernte dar.
Andere Eigenschaften oder Vorteile der vorlegenden Erfindung werden durch die folgende ausführliche Beschreibung sowie aus den Ansprüchen ersichtlich.
Ausführliche Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Chitosan oder Chitin in hohen Ausbeuten aus Pilzkulturen, die zur Familie der Mucoraceae gehören, nämlich Rhizopus azygosporus. Dieser Organismus ist auf Nachfrage von dem Culture Collection and Research Center (CCRC), Food Industry and Research Development Institute, Nr. 331, Shih-Ping Road, Hsinchu 300, Taiwan, Republik China, erhältlich. R. azygosporus ist als Katalog-Nr. CCRC31558 erhältlich.
Verfahren zum Kultivieren von Pilzen sind im Stand der Technik gut bekannt. Z.B. kann Hefe-Malz-Extrakt Agar (YM Agar) mit einem Pilz geimpft werden, und der geimpfte Agar wurde bei 25°C bis 37°C für 3 bis 6 Tage bebrütet. Die Sporen, die aus dem Pilz erhalten wurden, wurden in einer Flüssigkeit suspendiert, um eine Kultur mit 10⁴ bis 10⁷ cfu/ml zu erreichen. Diese Kultur wird direkt in ein Fermentierungsmedium geimpft.
Das Fermentierungsmedium kann einen anfänglichen pH besitzen, des im Bereich von 3 bis 8 liegt und kann 10 bis 100 g/l einer Kohlenstoffquelle (z.B. Glucose, Saccharose, Maisstärke, Melasse oder Sojabohnenöl), 5 bis 60 g/l einer Stickstoffquelle (z.B. Sojabohnenmehl, Pepton oder Corn Steep Liquor), 0,5 bis 20 g/l Hefeextrakt, 0,01 bis 30 g/l (NH₄)₂SO₄, 0 bis 3 g/l K₂HPO₄, 0 bis 3 g/l NaCl, 0 bis 15 g/l MgSO₄·7H₂O und/oder 0 bis 0,3 g/l CaCl₂ enthalten. Der Pilz wird in dem Fermentierungsmedium für zusätzliche 2 bis 4 Tage gezüchtet.
Chitosan kann aus der Mycelia des Pilzes nach Standardverfahren isoliert und gereinigt werden. Z.B. kann Alkali- und Säurebehandlung verwendet werden, um Chitosan zu isolieren, wie es in McGahren et al., Process Biochem. 19: 88 bis 90, 1984 beschrieben ist. Zusätzliche Einzelheiten und Verfahren zum Isolieren von Chitosan können in der europäischen Anmeldung Nr. EP 0 531 991 A2 ; Yokoi et al., J. Fermen. Bioeng. 85: 246 bis 249, 1998; US-Patent Nr. US 5,232,842 ; Rane et al., Food Biotech. 7: 11 bis 33; 1993; und Hang, Biotech. Lett. 12: 911 bis 912, 1990 gefunden werden.
S.C. Tan et al (1996), Carbohydr. Polym. 30, 239 bis 242, beschreibt die Extraktion von Chitosan aus der Mycelia vom Pilz der Gattung Rhizopus.
JP-A-8 013 250 (Abstrakt, AN 1996-113 203) beschreibt die Herstellung einer auf Chitosan-Chitin basierenden Hohlfaser, wobei dies die heiße alkalische Behandlung einer Biomasse der Gattung Rhizopus umfasst, die bei einem pH-Wert von 4,0 bis 6,0 kultiviert wurde.
Im Allgemeinen wird die Zellmasse von der Fermentierungsbrühe abgetrennt und mit destillierten Wasser gewaschen. Die Zellen werden dann mit 0,5 bis 2 N NaOH behandelt und die alkalische Mischung bei 121°C für 15 min bebrütet. Das feste Material wird dann durch Zentrifugieren pelletiert und mit destilliertem Wasser und Ethanol gewaschen. Das gewaschene Material wird mit einer 2%igen Essigsäurelösung behandelt und bei 95°C für 12 h bebrütet. Die resultierende Aufschlämmung wird dann durch Zentrifugieren isoliert, wodurch ein säurelöslicher Überstand (der Chitosan enthält) und ein säureunlöslicher Niederschlag (der Chitin enthält) erbracht wird.
Der pH des Überstandes wird auf 10 mit 2 N NaOH angepasst, wodurch das Chitosan ausgefällt wird. Das Chitosan wird schlussendlich mit destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Der säureunlösliche Niederschlag wird auch mit destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Diese säureunlösliche und alkaliunlösliche Fraktion ist gereinigtes Chitin.
Es wird angenommen, dass ein Fachmann ohne ausführliche Darstellungen auf Grundlage der obigen Offenbarung und der Beschreibung unten die vorliegende Erfindung in seinem vollsten Umfang nutzen kann. Die folgenden Beispiele sind lediglich als darstellend zusammengestellt, wie ein Fachmann die Erfindung anwenden kann, und sollen den Rest der Offenbarung in keiner Weise beschränken.
Die Ergebnisse der folgenden Beispiele sind in Tabelle 2 zusammen gefasst, die nach den Beispielen angeführt ist.
Beispiel 1
Eine Suspension von Sporen des Rhizopus azygosporus aus 4 Tage geneigten Kulturen wurde direkt in 250 ml Rüttelflaschen geimpft, die 100 ml eines frischen Fermentiermediums enthielten.
Die Fermentierung wurde bei 28°C über 48 h durchgeführt, während mit 200 U/min gerüttelt wurde. Jeder Liter des Mediums enthielt 10 g einer Stickstoffquelle (Sojabohnenmehl, Pepton oder Corn Steep Liquor), 20 g einer Kohlenstoffquelle (Glucose oder Maisstärke), 1 g Hefeextrakt, 5 g (NH₄)₂SO₄, 1 g K₂HPO₄, 1 g NaCl, 5 g MgSO₄·7H₂O und 0,1 g CaCl₂.
Die Zellmasse wurde aus der fermentierten Brühe zurückgewonnen und mit 1 N NaOH bei 121°C über 15 min behandelt. Das alkaliunlösliche Material wurde in 2%iger Essigsäure suspendiert und die Mischung bei 95°C über 12 h bebrütet, um das Chitosan aufzulösen. Das Chitosan wurde durch Anpassen des pH's des säurelöslichen Überstandes auf pH 10 ausgefällt. Das Chitosan wurde dann gewaschen, getrocknet und gewogen. Das säureunlösliche Material, Chitin, wurde auch gewaschen, getrocknet und gewogen. Die Ausbeuten wurden bezüglich Gramm Chitin oder Chitosan pro Liter Kultur berechnet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die höchsten Ausbeuten von Chitin und Chitosan wurden unter Verwendung des Mediums, das Maisstärke und Pepton enthielt, erreicht.
Beispiel 2
R. azygosporus wurde, wie in Beispiel 1, oben, beschrieben, kultiviert und verarbeitet, mit der Ausnahme, dass alle Medien Pepton als Stickstoffquelle enthielten, und die Kohlenstoffquelle wurde zwischen Glucose, Maisstärke, Saccharose, Melasse und Sojabohnenöl variiert. Die Einbeziehung von Maisstärke führte zu einer hohen Ausbeute von 0,9 g/l sowohl für Chitosan als auch Chitin, während die Einbeziehung von Sojabohnenöl zu der höchsten Ausbeute von 1,5 g/l für Chitin für dieses Beispiel führte (Tabelle 2).
Beispiel 3
R. azygosporus wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert und verarbeitet, mit der Ausnahme, dass jeder Liter des Mediums 30 g Corn Steep Liquor, 50 g Glucose, 2 g Hefeextrakt, 2,5 g (NH₄)₂SO₄ und 0,05 g CaCl₂ enthielt. Diese Kultur führte zu einer hohen Ausbeute von 1,1 g/l für Chitosan (Tabelle 2).
Die Abkürzungen, die in Tabelle 2 verwendet wurden, sind die folgenden: „R.a." steht für Rhizopus azygosporus; „S.M." steht für Sojabohnenmehl; „C.S.L." steht für Corn Steep Liquor; „C.S." steht für Maisstärke und „S.O." steht für Sojabohnenöl. Alle Kulturen, die in Tabelle 2 beschrieben sind, enthalten Hefeextrakt.
Die Ergebnisse der obigen Beispiele 1 bis 3 zeigen, dass (1) R. azygosporus ein überlegener Hersteller für Chitin und Chitosan ist, und (2) Medien, die Corn Steep Liquor, Glucose und Ammoniumsulfat enthalten, die Ausbeute an Chitin und Chitosan, die durch den Pilz produziert wird, erhöhen können.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Chitosan oder Chitin, wobei das Verfahren das Züchten eines Rhizopus azygosporus Pilzes in einem Medium, um eine Kultur zu bilden, und das Isolieren von Chitosan oder Chitin aus der Kultur umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Abtrennen von Pilzzellen aus der Kultur umfaßt, und worin das Chitosan oder Chitin aus den abgetrennten Pilzzellen isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Medium ungefähr 5 – 60 g/l corn steep liquor umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Medium ungefähr 30 g/l corn steep liquor umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Medium des weiteren ungefähr 10 – 100 g/l Glucose und ungefähr 0,01 – 30 g/l Ammoniumsulfat umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Medium ungefähr 30 g/l corn steep liquor, ungefähr 50 g/l Glucose und ungefähr 2,5 g/l Ammoniumsulfat umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium ungefähr 5 – 50 g/l corn steep liquor, ungefähr 10 – 100 g/l Glucose und ungefähr 0,01 – 30 g/l Ammoniumsulfat umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Medium ungefähr 30 g/l corn steep liquor, ungefähr 50 g/l Glucose und ungefähr 2,5 g/l Ammoniumsulfat umfaßt.