TW530089B - Method of producing chitosan or chitin using rhizopus azygosporus and actinomucor taiwanensis - Google Patents

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530089 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明背景 幾丁質極不溶於β-(1，4)- D -葡糖胺之N-乙醯化聚合物。 幾丁聚醣是幾丁質之酸溶性脫乙醯化形式。在許多工業應 用中使用幾丁質、幾丁聚醣及其衍生物，包括黏度控制 劑、黏著劑、色層分析載體、紙強化劑、絮結劑、食品添 加劑、藥物及化粧品等應用。 可由榜蟹或蝦殼之脫蛋白質作用及脫鈣作用製造幾丁 質。接著以幾丁質與熱鹼溶液之脫乙醯化作用可獲得幾丁 聚醣。該幾丁聚醣之生產作用具有許多不利的特徵。例 如，該方法需要貴的熱能量及具有潛在性危害健康的苛性 鹼。該方法也會生大量的廢物，因此必須有大量的處置成 本。此外，蝦及螃蟹殼完全依賴於季節及環境等因素，導 致不可預期的生產量限制。 此夕卜，Shimahapa等人（1989)研究的32株•之幾 丁聚醣產量只在10〜150mg/200ml (0·05〜0.75g/L)之間 (Shimahara, Kenzo et al.5 Screening of Mucoraceae Strains Suitable for Chitosan Production，Elsevier，London，第 171-178 頁， 1989);而在其他文獻中所記載的oryzae NRRL 395 或HUT1219菌株之幾丁聚醣產量最高亦 只達到 0.7g/L (Hang，1990)或 0.5g/L。 因此，仍有需要發展生產幾丁質及幾丁聚醣之方法。 發明概述 — 本發明係以發現可自真菌de"⑽⑽及自真菌 ⑽生產意想不到的高產量之幾丁聚醋衣幾 丁質為主。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 530089 A7 B7 五、發明説明（2 ) 因此，本發明以生產幾丁聚醣及幾丁質之方法為特徵， 其係以（1)在培養基中培養真菌或 dciz·⑽mwcor 真菌，以形成菌絲體，及⑵自細胞分 離出幾丁聚醣及幾丁質。例如，自菌絲體隔離出幾丁聚醣 及幾丁質，其係以自培養物分離出真菌細胞及自分開的細 胞分離出幾丁聚醣及幾丁質。 本發明也包括一種生產幾丁聚醣及幾丁質之方法，其係 以⑴在適於本發明方法之培養基中培養白黴科族真菌，以 形成菌絲體，及⑵自真菌菌絲體隔離出幾丁聚醣及幾丁 質。 適用於本發明方法之培養基可包括約5至60公克/公升（例 如，約30公克/公升）之玉米浸潰液、約10-100公克/公升（例 如，約50公克/公升）之葡萄糖、約0.01至30公克/公升（例 如，2.5公克/公升）之硫酸銨或其它適合的成份。 本發明的方法以含有αζ少或^(ciz·⑽ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如真菌之菌絲體允許令人驚訏的高產量生產。而 且，頃發現含有玉米浸潰液、葡萄糖、酵母萃取液及硫酸 銨之培養基能夠增加真菌菌絲體之幾丁質及幾丁聚醣生產 量。因此，本發明的方法提供一種生產幾丁質及幾丁聚醣 之替換方法，不依賴對環境有害的化學品或甲殼類產量的 許多限制。 由以下詳細的說明及也由申請專利範圍會使得本發明的 其它特性或優點更顥而易見。 本發明的詳細說明 本發明係關於以屬於白黴科族之真菌菌絲體生產高產量 -5— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530089 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____B7 五、發明説明（4 ) 85··246-249、美國專利申請案第5,232,845號、Rane等人在 1993 年的 Food Biotech 7 :11-33 及 Hang 在 1990 年的 Lett 12:911-912中可發現分離幾丁聚醣另外的細節及步驟。 通常自醱酵液分離細胞團，並以蒸餾水清洗。接著將細 胞以0.5至2N之NaOH處理’並將驗性混合物在121 下培養 15分鐘。然後以離心作用將固體物質形成團塊，並以蒸餘 水及乙醇清洗。經清洗的物質以2 %醋酸溶液處理並在95 下培養12小時。接著以離心作用分離所得之淤漿，得到酸 溶性上層清液（含幾丁聚醣）及非酸溶性沉澱物（含幾丁 質）。 以2N的NaOH將上層清液之pH調整至1〇，藉以沉殿出幾丁 聚醣。最後以蒸餾水清洗幾丁聚醣並將其冷凍乾燥。也以 蒸餾水清洗非酸溶性沉殿物並將其冷;東乾燥。將該非酸溶 性及非鹼溶性分餾純化成幾丁質。 不需進一步的推敲，咸信本技藝的熟練者可由以上的揭 示及以下的說明為基礎利用本發明至最大極限。將以下的 實施例解釋成只是使本技藝的熟練者可以如何練習本發明 的例證而已，不是以任何方式限制本發明的條文。將在本 發明中說明的任何文獻併入本文以供參考。 將以下的實施例結果總結在排列於實施例之後的表2中。 實施例1 將以4天斜面培養之⑽孢子懸浮液直接 在含有100毫升新鮮的醱酵培養基之25〇毫升搖動燒瓶中培 育。 一 - Ί - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公瘦) 〜 ^--------! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530089 A7 ___ B7 五、發明説明（5 ) 在28 °C下進行48小時的醱酵作用，同時以200轉/分鐘搖 動。每1公升的培養基包括10公克之氮源（大豆粉、消化蛋 白質或玉米浸潰液）、20公克之碳源（例如，葡萄糖、蔗 糖、玉米澱粉、糖蜜或大豆油）、1公克之酵母萃取液、5公 克之（NH4)2、1公克之K2HP04 ' 1公克之NaCl、5公克之 MgS04.7H20及 〇·1公克之 CaCl2。 自醱酵液回收細胞團，並在121°C下以1N的NaOH處理。將 非鹼溶性物質懸浮在2 %醋酸中，並將混合物在95°c下作用 12小時，使幾丁聚醣溶解。也將非酸溶性物質（幾丁質）清 洗、乾燥及稱重。以每公升的菌絲體之幾丁質或幾丁聚醣 公克方式計算產量，並將結果陳列在表2中。利用含有玉米 殿粉及消化蛋白質之培養基達到最高的產量。 實施例2 將以4天斜面培養之孢子懸浮液直 接在含有100毫升醱酵培養基之250毫升搖動燒瓶中培育。 根據實施例1的說明進行幾丁聚醣及幾丁質之醱酵作用，並 將結果陳列在表2中。利用含有玉米浸清液及葡萄糖之培養 基達到最高的產量。 實施例3 以根據實施例1之說明培養及處理， 除了所有的培養基包括以peptone當成氮源及在葡萄择、玉 米澱粉、蔗糖、糖蜜及大豆油之間變化的碳源之外。核實 施例以玉米澱粉當成碳源的培育作用會得到最佳的幾丁聚 醣與幾丁質產量，均達〇·9公克/公升。若以大豆油當成碳 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公ί! ^---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂： 530089 A 7 B7 五、發明説明（6 ) 源，則會有最高的幾丁質產量（1.5公克/公升）（表2)。 實施例4 以根據實施例2之說明培養及處理」 以，除了所有使用的培養基只包括以玉米浸潰液當 成氮源，而改變不同的碳源種類包括葡萄糖、玉米澱粉、 糖蜜及大豆油。本實施例是以葡萄糖當成發酵碳源時，可 得最佳的幾丁聚醣及幾丁質的產量（表2 )。 實施例5 以根據實施例1之說明培養及處理⑽， 除了每公升的培養基包括30公克之玉米浸潰液、50公克之 葡萄糖、2公克之酵母萃取液、2.5公克之（NH4)2S04及0.05 公克之CaCl2之外（表2)。該培養液可得最高的幾丁聚酷產 量，達1.1公克/公升。 實施例6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以根據實施例2之說明培養及處理 ίαήνα似似以，除了每公升的培養基包括30公克之玉米浸潰 液、50公克之葡萄糖、2公克之酵母萃取液、2.5公克之 (NH4)2S04及0.05公克之CaCl2之外。該菌絲體會得到最高 的幾丁聚醣（1.7公克/公升）與幾丁質（Μ公克/公升）之組合 產量（表2)。 實施例7 以根據實施例6之說明—培養及處理 ，除了每公升的培養基包括0.5公克之K2HPO4取 代CaCl2之外。該菌絲體會得到1.4公克/公升的高幾丁聚醣 產量。 -9—— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 530089 A7 B7 五、發明説明（7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 〇\ > •P LO Ρ Κ) > Ρ >4> 棼 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X in 2 s， Ο '^Ιί g备 ο 'in r X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X &r 綠 ο 'yi ^ ft 雜 00 ρ X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 5 X ρ Ρ ffi •d ^ V- Ρ Q ,Ρ X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X ρ Ρ 1—» 4^ <1 Η-* 〇 to 〇 Lo ο On ο b\ ο ο 1/1 ο 00 ο ο ρ ο σ\ ο ΟΝ ο Ln ο ρ ο Lh ο *4^ ο ο ·κ> ο Lh ο ο Lo 淼 Ι^ν 難系 Η半 〇 Η-* 〇 On 〇 <1 ο Ο *4^ ο b\ ο 1—* ο ·σ\ ο ο ο Ον ο ΟΝ 1—* ο ο *〇〇 ο ^sO ο Ον ο •私 ο οο ο νο ο <1 ο ο σ\ ο (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2IOX297公釐） 530089 A7 B7 五、發明説明（8 ) 在表2中使用的縮寫如下·· nR.a.n代表 ; lfA.t.lf 代表 ; lfS.M·丨丨代表 大豆粉；"C.S丄.代表玉米浸潰液；nC.S.’W<表玉米澱粉； 及nS.O.n代表大豆油。所有在表2中說明的培養基包括酵母 萃取液。 在以上的實施例1 - 7的結果顯示（1)ίαήν⑽ 及是卓越的幾丁質及幾丁聚醣製造物， 及（2)含有玉米浸潰液、葡萄糖及硫酸铵之培養基可增加由 真菌生產的幾丁質及幾丁聚醣。 其它的具體實施例 當然雖然本發明已經由與其有關的詳細說明加以說明， 但是前述的說明企圖做為說明，不是限制以附加的申請專 利範圍界定的本發明範圍。其它的觀點、優點及改良是在 本發明的範圍内。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X29<7公釐）

Claims (1)

1. 530089

   申請專利範圍 5至60公克/公升之玉米浸潰液。 9. 根據申請專利範圍第8項之方法，_八1 士 丹進—步包含自菌絲 月豆刀離真菌細胞，及其中幾丁聚醣 π ^ _ 幾丁質係分離自分 開的真菌細胞。 10. 根據申請專利範圍第9項之方法， 土， 并甲培養基包含30公 克/公升之玉米浸潰液。 江根據申請專利範圍第9項之方法，其中培養基包含ι〇-100公克/公升之葡萄糖及o.omo公克/公升之硫酸按。 12. 根據中請專利範圍第n項之方法’其中培養基包句〇公克/公升之玉米浸料、50公克/公升之葡萄糖及^公克 /公升之硫酸銨。 13. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中培養基包含5至川 公克/公升之玉米浸潰液、10_100公克/公升之葡萄糖及 〇·〇1至3 0公克/公升之硫酸銨。 14·根據申請專利範圍第13項之方法，其中培養基包含“公 克/公升之玉米浸潰液、50公克/公升之葡萄糖及2 5公克 /公升之硫酸銨。 1 #! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 15. 種生產幾丁聚醣或幾丁質之方法，該方法包含 在培養基中培養白黴科族之真菌，以形成菌絲體，該均 養基包含5至30公克/公升之玉米浸潰液、1〇-1〇〇公克/公 升之葡萄糖及0.01至30公克/公升之硫酸銨；及 自真菌菌絲體分離幾丁聚醣^幾丁質。 16·根據申請專利範圍第η項之方法，其中培養基包含3〇公 克/公升之玉米浸潰液。 一 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（210X297公釐） 530089 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 17. 根據申請專利範圍第15項之方法，其中培養基包含50公 克/公升之葡萄糖。 18. 根據申請專利範圍第15項之方法，其中培養基包含15公 克/公升之硫酸銨。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 申請曰期 88.11.10 案 號 88119619 類 別 修正 中文說明書修頁(90年9月）

   補充專利説明書 本《夕年？月日 CA

   530089 中 文 、發明 名稱 与0P、us azyg〇sPorus^、Actinomucor taiwanensisi^M^ 幾丁聚醣或幾丁負^之方法 英 文 if?TTS°Prrr9F PRODUCING CHITOSAN OR CHITIN t^Pa3K^0PUS AZYG〇SP〇RUS AND ACTINOMUCOR TAIWANENSIS 姓 名 國 籍 1. 陳美惠 2. 陳慶源 3. 吳志律 4. 莊淑惠 均中華民國 5. 黃英蛾 6. 陳彦霖 7. 袁國芳 % 人 住、居所 1. 臺灣省新竹市西大路582巷15弄8號 2. 臺灣省苗栗頭份鎮忠孝二路16巷3號 3 ·今灣省新竹市經國路一段83 8巷2弄8號 ’今灣省，竹縣新埔鎮中正路253號 5.堂南雄縣林園鄉溪州二路％巷32號 6·今，省桃園縣平鎮市新富二街18號13樓 7·堂灣省新竹市湖路4〇〇巷45弄11號 裝 訂 姓 名 (名稱T 國 籍 食品工業發展研究所 中華民國 三、申請人 f事務 臺灣省新竹市食品路331號 劉廷英 >X297公釐） 530089 第088119619號專利申請案 中文說明書替換頁(92年2月） A7 B7 五、發明説明（ 災· 1 27 年月曰

   之幾丁聚醣或幾丁質。 特別有用於本發明方法之真菌包括穴/nzopt^ (7Z少及 dciMomweor ία/w⑽ens/s。此二者生物可取自在中華民國台灣新 竹市300西平路331號之食品工業及研究發展所(Food Industry and Research Development Institute)的菌絲體收集及研究中心（Culture Collection and Research Center，CCRC) 0 乂是取自 編號第CCRC31158號，而^4ci/⑽七是取自編號 第 CCRC31159號。 培養真菌的步驟係為熟知之技藝。例如，可以真菌接種 於ΥΜ洋菜，及將該經接種之洋菜培養在25°C至37°C下保溫 3至6天。得自真菌之胞子係懸浮在液體中，以達到104至 107cfu/毫升之貯液。該貯液可直接接種成醱酵培養基。 醱酵培養基可具有範圍自3至8之起始pH及可包括10至 100公克/公升之碳源（例如，葡萄糖、蔗糖、玉米澱粉、糖 蜜或大豆油）、5至60公克/公升之氮源（例如，大豆粉、消 化蛋白質或玉米浸潰液）、0.5至20公克/公升之酵母萃取 物、0.01至3 0公克/公升之（NH4)2S04、0至3公克/公升之 K2HP〇4、〇至3公克/公升之NaCl、0至15公克/公升之 MgS04*7H20及/或〇至0.3公克/公升之CaCl2。將真菌在醱酵 培養基中生長額外2至4天。 可以標準方法將幾丁聚醣與真菌絲分離及純化。例如， 根據 McGahren等人在 1994年的 Process Biochem 19:88-90 中的 說明，可利用鹼及酸處理以分離幾丁聚醣。在歐洲專利申 請案第 〇 53 1 991A2號、Yokoi等人在 1998年的 J.Fermen Bioeng 本紙張尺度適用中a國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐)