DE1442060A1 - Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Amyloglucosidase - Google Patents

Description

"Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Amylogluooaidaae".

Die Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von Amylogluoosidase. Insbesondere betrifft die Erfindung die fermentative Herstellung einer Amyloglucosidase von bisher nicht erzielbarer Reinheit.

Es ist bereits bekannt, daß bestimmte Stämme von zur Gruppe Aspergillus niger gehörenden Pilzen und bestimmte Stämme von ßhizopus-Species das Enzym Amyloglucosidase erzeugen, welches die Hydrolyse von Stärke, Dextrinen oder Maltose zu Dextrose katalysiert. Dieses iflnzym wurde auoh als Glucamylase, glucogenes Enzym, Stärkeglucogenase oder /'-Amylase bezeichnet. Gereinigte

V.

Amylogluoosidase katalysiert die Hydrolyse der 'X-D-O

> 4), der oL-D-(1 > 6) und der ql-D-(1—> 3)-glucosi-i

dischen Bindungen von Oligosaccharide^

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Diese Amyloglucosidase erzeugenden Pilzstämme bilden gleichzeitig beträchtliche Mengen anderer Enzyme, z.B. OO -Amylase, Transglucosidase, Protease und manchmal Lipase. Von besonderer Wichtigkeit für die Erzielung hoher Ausbeuten an Dextrose aus Stärke durch solche Amyloglucosidase-Enzympräparate sind die Gegenwart und Mengen von Transgluoosidase und cü-Amylase. Transglucosidase führt zur Bildung nicht vergärbarer Dextrosepolymererund von Oligosacchariden, wie Banose, die 06-D-(I- ^6)-glucosidische Bindungen enthalten, insbesondere aus Maltose. Erfolgt durch die Wirkung der Transglucosidase eine solche enzymatisch^ Synthese unvergärbarer Kohlenhydrate, so erhält man bei der Verzuckerung von Stärke niedrigere Ausbeuten an Dextrose. ÖC-Amylase katalysiert die Bildung von Hydrolysenprodukten von niedrigerem Molekulargewicht, einschließlich Maltose, aus Stärke. Auf diese Weise beschleunigt sie die Bildung von Dextrose unter der Einwirkung von Amyloglucoj3idase, führt aber andererseits zur Entstehung von, der Einwirkung von Transglucosidase zugänglichen Oligosaochariden und so zu niedrigerem Ausbeuten an Dextrose mit Enzympräparaten, die beträchtliche Mengen Transglucosidase enthalten.

Es wurde bereits eine teträchtliche Anzahl von Stämmen der Gruppen*. Jlapergillus - oryzae« Aspergillus niger und Ehizopus auf ihre Amyloglucosidaseproduktion

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und auf die gleichzeitige Produktion von Transglucosidase und O^-Amyläse geprüft. Bisher wurden die testen Ausbeuten an Amyloglucosidase mit gewissen Stämmen der G-ruppen^AspergilluB-niger und Bhizopus erhalten, jedoch entstanden mit allen bisher untersuchten Stämmen beträchtliche Mengen Transglucosidase.

Wurden die verschiedenen bekannten Amyloglucosidasepräparate nach einem Verfahren zur Bestimmung der Transglucosidase-Aktivität geprüft, so wurden solche O&-Amylase und Transglucosidase-Aktivitäten gefunden, daß etwa 23% bis etwa 77$ eines Maltosesubstrats in unvergärbare Zucker umgewandelt werden. Die Gegenwart von Transglucosidase in üblichen Amyloglucosidasepräparaten ist allgemein bekannt; auch wurde ein Anzahl von Patenten auf Verfahren zur Verminderung des Transglucosidasegehaltes von Amyloglucosidasepräparaten für die Verwendung zur Herstellung von Dextrose aus Stärke erteilt.

Diese Verfahren sind jedoch umständlich und kostspielig, insbesondere bei ihrer Anwendung auf die technische enzymatische Umwandlung der Stärke stärkehaltiger Substanzen in Dextrose.

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Ein Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Amyloglucosidase in hoher Ausbeute, ohne beträchtliche gleichzeitige Entstehung unerwünschter Enzyme.

Ein anderes Ziel der Erfindung ist die Herstellung einer weitgehend reinen Amyloglucosidase, d.h. einer Amyloglucosidase von solcher Reinheit, daß eine umfangreiche Reinigung vermieden werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzielung hoher Ausbeuten an Dextrose bei der Umwandlung der Stärke stärkehaltiger Substanzen»

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer vonCO-Amyläse, Transglucosidase, Protease, Lipase und anderen verunreinigenden Enzymen weitgehend freien Amyloglucosidase.

Andere Ziele der Erfindung gehen aus der nachstehenden Beschreibung hervor.

Es wurde jetzt gefunden, daß gewisse Mutanten eines aus Erdboden isolierten typischen schwarzen Aspergillus fast zu vernachlässigende Mengen Transglucosidase, OO Amylase und anderer verunreinigendefEnzyme erzeugen. Eine typische mutantenkultur dieser Art wurde charakterisiert und bei der American Type Culture Collection unter

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der Bezeichnung "Aspergillua foetidus, Stamm Bode Mutant A103-1" unter der Eingangsnummer ATOG 14916 hinterlegt.

Die charakteristischen Eigenschaften dieses Mutanten sind folgende: Auf Czapekagar sich langsam ausbreitende Kolonien, mit Reichlichen schwarzen Köpfen über einem gelben oder hell-orangefarbenen Myoel, welches auf der Unterseite gelb bis orangefarben ist. Die Conidiophoren sind bis zu 500 /u lang, überragt von Bläschen mit etwa 30 /U, gelegentlich bis zu 75/U Durchmesser. Die Sporenköpfe haben einen Durchmesser von 80^u bis 130/U, gelegentlich bis zu 225/U. Die primären Sterigmata haben eine Größe von 7 bis 15/U mal 4yu bis 6 /u, die sekundären Sterigmata die gleiche G-iöße oder sind in großen Köpfchen etwas kleiner, als die primären Sterigmata. Die kugelförmigen Oonidien haben einen Durchmesser von 4/u bis 5»»u und sind durch Farbstäbchen oder Spinula etwas aufgerauht. Kolonien auf Ozapekagaö haben einen charakteristischen erdartiger G-eruch, ähnlich dem von Actinomyoeteia.. Dieser Geruch wurde bei keinem anderen Aspergillus beobachtet.

Der Mutantkspergillus foetidus ATOC 14916 und ähn- ! liohe zur Erzeugung einer weitgehend reinen Arayloglucosi-

! dase fähige Mutanten können durch Sporenselektion naoh

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UV-Bestrahlung von, durch, einen Organismus der Aspergillus nigerreihe erzeugten, Sporen hergestellt werden»

Zur Durchführung dieses Verfahrens läßt man eine Agarkultur das Organismus bis zur guten Sporenbildung wachsen· Die Sporen werden gesammelt, indem man die Oberfläche der Kultur mit sterilem Wasser spült, das vorzugsweise ein Dispergiermittel z.B. Natriumlaurylsulfat.enthält, wobei man einige sterile Glasperlen zusetzt und hierauf mäßig schüttelt, bis eine Dispersion der Sporen erhalten wird. Die Dispersion wird hierauf zusammen mit den Glasperlen in eine sterile Flasche abgezogen, kräftig geschüttelt und hierauf aseptisch in einen sterilen Behälter filtriert. Als Filtermedium kann lose sterile Watte ((Botton) verwendet werden, da diese die gut dispergier-ten Sporen passieren läßt.

In der filtrierten Dispersion werden die Sporen gezählt, indem man in bekannter Weise mehrere aufein-. anderfolgende Verdünnungen der Sporendispersion auf Platten züchtet und hierauf bei einer geeigneten Verdünnung die aus den Sporen gewachsenen Kolonien auszählt. Der Rest der Sporendispersion wird bis zur Beendigung der Sporenzählung unter Kühlung gehalten» Eierauf wird die Sporendispersion mit destilliertem Wasser auf einen Sporengekalt von etwa 500 000 bis etwa

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1 500 000 Sporen je ml verdünnt.

Proben dieser verdünnten Sporenaispersion werden in kleine, sterile Petrischalen gebracht, die man tint er eine UV-Lampe, wie sie z.B. für die UV-Sterilisation verwendet wird, stellt. Die Proben werden verschieden lange bestrahlt und hierauf die nach den Bestrahlungen von verschiedener Dauer überlebenden Sporen wieder nach dem Plattenkulturverfahren gezählt·

Üblicherweise wird zur weiteren Untersuchung eine bestrahlte Probe gewählt, worin 99$ oder mehr der Sporen die Bestrahlung nicht überlebt haben. Die bei dem Plattenkulturverfahren aus den 1$ oder weniger überlebenden Sporen gewachsenen Kolonien werden sofort auf ihre Fähigkeit zur Erzeugung von Amyloglucosidase geprüft, indem man wine Probe jeder Kolonie in einem geeigneten flüssigen Kulturmedium, wie nachstehend genauer beschrieben, wachsen läßt. Es ist empfehlenswert, möglichst viele der aus den überlebenden Sporen gewachsenen Kolonien zu prüfen, um zumindest eine zu erhalten, die eine wesentlich gesteigerte Fähigkeit zur Erzeugung von Amyloglucosidase besitzt, was nur bei einem sehr kleinen Teil der überlebenden Sporen der fall ist.

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Die nach, dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Kulturen läßt man hierauf in einem geeigneten Gärmedium wachsen, um Ämyloglucosidase herzustellen. Im allgemeinen enthält das G-ärmedium ein Gemisch aus einer Kohlenhydrat- und einer Proteinquelle, Die Kohlenhydratquelle kann im allgemeinen ein stärkehaltiges Material oder ein Hydrolyseprodukt desselben sein. Z.B. kann man ein niedrigmolekulares Polysaccharid, wie Maltose oder ein Hydrolysenprodukt von Stärke oder Maisschrot, welches der sauren oder enzymatischen Hydrolyse, z.B. mittels Bakterienamylase unterworfen wurde, verwenden.· Wird das Gärmedium durch enzymatische Behandlung hergestellt, so muß es vor dem Zusatz der die Ämyloglucosidase bildenden Kultur sterilisiert werden, damit eine möglichst geringe Verunreinigung der Ämyloglucosidase durch andere Enzyme erfolgt.

Die Proteinquelle kann irgendein geeignetes proteinhaltiges Material sein, z.B. Maisquellwasser oder ein anderes handelsübliches, proteinhaltiges^ allgemein in Gärmedien verwendetes.Material.

Eine E_egelung des pH-Wertes des Mediums ist im allgemeinen nicht erforderlich, da der pH-Wert des Mediums annähernd dem optimalen pH-Wert für die Amyloglucosidaseproduktion durch den Organismus entspricht.

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Während der Gärung beträgt die Temperatur des Mediums etwa 23°C bis etwa 35°C, vorzugsweise etwa 32⁰C. Mäßiger Überdruck ist erwünscht, z.B. von etwa 1,05 bis 2,1 atü (15 psig bis 30 psig). Kontinuierliche Belüftung und Bewegung während der Gärung, die etwa 72 bis etwa 96 Std. dauern kann, führt zu optimalen Ausbeuten an Amyloglucosidase.

Da die Erfindung eine Amyloglucosidase von hoher Amylogluoosidase-Aktivität und niederer Transglucosidase-^ öO-Amylase und Protease-Aktivität betrifft, werden nachstehend geeignete Verfahren zur Bestimmung dieser verschiedenen Aktivitäten angegeben:

Bestimmung der Amyloglucosidase-Aktivität:

Das Substrat ist eine Lösung, enthaltend 4,0g lösliohe Stärke (Trookengewioht) und 5,6 ml eines 1,1m-Aoetatpuffers (pH-Wert 4,2) je 100 ml Lösung. Genau 50 ml der gepufferten Stärkelösung werden in einen Meßkolben von 100 ml Inhalt pipettiert und in einem Wasserbad 15 Min. bei 6O⁰C äquilibriert. Hierauf werden 1,0 ml einer soweit verdünnten Enzymlösung, daß während der Inoubationsdauer 20$ bis 30$ Hydrolyse erfolgt, zugesetzt.. Nach, genau 60 Min. Inkubieren in dem Wasserbad bei 60 ö wird die Lösung gegen Phenolphthaüein durch Zu satz einer 2n-Natriumhydroxydlösung auf rosa neutralisiert.

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Die lösung wird hierauf auf Baumtemperatur abgekühlt und der Meßkolben mit destilliertem Wasser bis zur Mark© aufgefüllt. Hierauf wird nach dem wohlbekannten Verfahren von Schoorl in der verdünnten Probe und in einer auf gleiche Weise, aber ohne Zusatz von Enzym, behandelten Vergleichsprobe der reduzierende Zucker, als Dextrose berechnet, bestimmt. Die Amyloglucosidase-Aktivität wird nach der Formel

berechnet, worin

A = Amyloglucosidase-Aktivität, E/g (oder ml) Enzymzubereitung,

S = reduzierende Zucker in der durch das Enzym umgesetzten Probe, g/100 ml verdünnter Probe,

B = reduzierende Zucker in der Vergleichaprobe, g/100 ml verdünnter Broben und

E a Menge des verwendeten Enzyms, g(oder ml) je 100 ml verdünnter Probe, iat·

Bestimmung der TransglucosidaBe-AktiTität;

Eine Maltoselösung wird durch Lösen von 200 g C.F Maltose in destilliertem Wassssr und Verdünnen auf 500 ml hergestellt. Genau 50 ml werden in einen Meßkolben von 100 ml abpipettiert mad 5,0 ©1 einer 1,0 m«Ae«tät-«.: pufferlösung mit dem pH-Wert 4,5 hinzugefügt. Nach dem 8098D9/07Ö^:6-'

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Vermengen wird eine Enzymzubereitung mit 2,8 E Amyloglucosidase zugegeben. Der Kolben wird in ein Wasserbad von 6O⁰C gebracht. Nach 72 Std. bringt man des Kolben für 15 Min. in ein siedendes Wasserbad, KüAlt hierauf ab und bringt seinen Inhalt quantitativ in ein Beoherglaa von 150 ml Inhalt. Die Lösung wird mit einer 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 4,8 eingestellt, in einen Erlenmeyerkolben von 500 ml Inhalt gebracht und auf etwa 200 ml verdünnt. Hierauf werden 10 g aktiver Bäokertrockenhefe zugegeben und der Kolben kontinuierlich 5 Std. bei 30⁰C geschüttelt. Der Inhalt wird hierauf in einen Messkolben von 250 ml Inhalt übertragen und bis zur Marke aufgefüllt. 200 ml werden hierauf bei 2 000 UpM 15 Min. zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit in einen trockenen Kolben dekantiert, 50 ml dieser Flüssigkeit werden in ein Proberöhrchen von 70 ml Inhalt pipettiert, 5 ml einer 3,0 n-Chlorwasserstoffsäurelösung zugefügt, das Proberöhrchen lose verschlossen, in einem siedenden Wasserbad 3 Std. erhitzt und hierauf in einem ifiisbad gekühlt. Der Inhalt des PröberÖhrohens wird hierauf quantitativ in einen Me&kolben von 100 ml Inhalt übertragen, mit einer 1 n-Matriusahydroiydlösung gegen Phenolphthalein auf rosa neutralisiert und bis zur Marke aufgefüllt. In einem aliquoten Teil dieser Lösung werden reduzierende Zucker^ als Dextrose berechnet, bestimmt. Um eine Korrektur für durch die Hefe eingebrachten reduzierenden Zucker zu

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erhalten, wird eine Vergleichsprobe mit 20 g reiner Dextrose, anstelle von Maltose und ohne Zusatz eines Enzyms angesetzt. Der Y/ert für den reduzierenden Zucker in der enzymhaltigen Probe, korrigiert für durch die Hefe eingebrachten reduzierenden Zucker, gibt die Menge des durch das Enzympräparat synthetisierten nicht vergärbaren Zuckers an. Die Ergebnisse werden als fö-Mallose die in nichtvergärbaren Zucker umgewandelt wurden, berechnet.

Da die beiden Enzyme Amyloglucosidase und Transglucosidase um dasselbe Substrat, nämlich Maltose, im Wettkampf stehen, können die Ergebnisse als Verhältnis der Transglucosi^dase-Aktivität zur Amyloglueosidase-Aktivität ausgedrückt werden!

TG/AG X " 100 X

worin X = fo in unvergärbaren Zucker umgewandelte Maltose ist.

Bestimmung der QC -Amylase-Aktivität.

<X-Amylasebestimmungen werden nach dem modifizierten Verfahren von Sandstedt, Kneenund Bush in Cereal Laboratory Methods, 7. Aufl., Abschnitt 22-01 durchgeführt. Die Ergebnisse werden als SKB-E je g (oder ml) berechnet.

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Bestimmung der Protease-Aktivität:

Das Substrat ist eine 0,1$ige, auf einen pH-Wert von 7,4 gepufferte, Kaseinlösung. Genau 50 ml der gepufferten Kaseinlösung werden in einen E±lenmeyerkolben von 125 ml Inhalt pipettiert und 15 Min. in einem Wasserbad bei 40⁰C äquilibriert. Hierauf werden 1,0 ml einer so verdünnten Enzymlösung zugegeben, daß die Absorption bei 660 m /U in der Endstufe in den Bereich von 0,300 bis 0,500 fällt. Nach genau 35 Min. wird die Reaktion durch Zusatz von 25 ml einer 2m-Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 4,0 und Sohütteln des Flascheninhalts zur rascheren Mischung gestoppt. Das Gemisch wird hierauf durch trockenes filtrierpapier filtriert und ein.; aliquoter Teil von 2,0 ml des Filtrate in ein Colorimeterrohr von 25 mm gebracht. Hierauf werden 3 ml einer 0,8n-NatriumhydroxydlöBung zugegeben und gemischt. 1 ml Folin-Öiooalteu - Phenolreagenz wird hierauf direkt in die Lösung eingeblasen· Das Vermengen wird duroh Umsehütteln des Rohres vervollkommnet. Zumindest 5 Hin., jedooh weniger als 20 Min. nach Zusatz des Phenolreagena wird die Absorption bei 660 myu (Agg₀) in einem photoelektrischen Colorimeter gemessen, nachdem das Instrument mittels einer Vergleichsprobe auf 0 eingestellt wurde. Die Vergleichsprobe wird unter

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Verwendung von 1 ml Wasser, anstelle der Enzym» probe, unter Durchführung aller Stufen der Be- · Stimmung, hergestellt. Willkürliche Proteaseeinheiten werden nach der Formel berechnetί

NU = willkürliche Northrop-E/g Enzymzubereitung,

660 β Absorption bei 660 m/U,

W = mit der Enzymprobe von 1_?0 ml. angegebene Enzymmenges in ig, .

1? *= faktor j abhängig von dem Colorimeter und der Art des untersuchten Enzyms, ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand nach stehender Beispiele näher erläutert.

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Beispiel 1

In diesem Beispiel wird das Verfahren der Bestrahlung und Sporenselektion zur Isolierung von Aspergillus foetidus ATCO 14916 beschrieben. Dieses kann auoh zur Herstellung anderer Mutanten verwendet werden, die weitgehend reine Amyloglucoeidase nach der Erfindung erzeugen können.

Eine Agarkultur eines Organismus der Aspergillus niger-Heihe ließ man bis zur guten Sporenbildung wachsen. Hierauf spülte man unter aseptischen Bedingungen die Oberfläche der Agarkultur mit 10 ml einer sterilen Lösung von 0,001 g Natriumlaurylsulfat in 100 ml Wasser, Dann wurden 3 sterile Glasperlen zugegeben, der Kulturkolben verschlossen und zur besseren Suspendierung der Sporen in der Lösung mäßig geschüttelt. Die Sporensuspension wurde hierauf zusammen mit den Glasperlen in eine kleine Flasche gebracht und verschlossen} die Flasche samt Inhalt 10 Minuten kräftig geschüttelt, die flüssige Sporendispersion über einen kleinen sterilen Wattebausch in eine sterile Flasohe filtriert, der Wattebausch mit 5 ml sterilem Wasser gewaschen und dieses Waschwasser der filtrierten Sporensuspension hinzugefügt.

Die Sporensuspension wurde hierauf mit sterilem lasser im Verhältnis 1 j 10, 1:100 und 1:1000 verdünnt. Mit 3· 1/10 ml dieser Verdünnungen wurden hierauf Gzapek-Agarplatten in Petrischalen von 14 cm Durchmesser beimpft.

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Gzapek-Agar ist ein wohlbekanntes synthetisches Medium aus anorganischen Salzen, Rohrzucker und. Agar» Die Platten wurden 5 Tage bei 3O⁰O inkubiert und die aus den ursprünglichen Sporen gewachsenen Kolonien gezählt* Aus diesen Zählungen wurde der Sporengehalt der ursprünglichen Sporensuspension berechnet und dieser hierauf durch Verdünnen mit sterilem Wasser auf einen Wert von 1,000,000/ml eingestellt« Während der Zählung wurde die Sporensuspension auf 5⁰C gekühlt.

Proben von je 10 ml verdünnter Sporensuspension wurden in Petrischalen von 6 cm Durchmesser verschieden lange, bis zu 10 Min., unter einer UV-Sterilisierlampe bestrahlt. Nach 10 Minuten waren weitgehend alle Sporen getötet. Die Petrischalen wurden, um ihren Inhalt zu bewegen, während der Bestrahlunggeschüttelt.

Von jeder bestrahlten Probe wurden die überlebenden Sporen gezählt, indem man Verdünnungen derselben auf Czapek-Agarplatten in Petrischalen von 14 cm Durchmesser ausgoß und in Platten 5 Tage bei 30⁰O incubierte. So fand man, daß nach 6 Miiw Bestrahlung etwa 99,5 i< > der Sporen getötet waren. Von einer Agarplatte, auf welcher etwa 50 Kolonien aus den nach der Bestrahlung von 6 Min. überlebenden Sporen gewachsen waren, wurden sofort von jeder der Kolonien Kulturen auf je 3 schiefen

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Agarplatten hergestellt, indem man auf Czapek-Agar in Proberöhrehen impfte und 4 Tage bei 30⁰C inkubierte·

Alle Verfahrensstufen, nämlich die Bestrahlung, das Ausgießen auf Platten und Zählen und die Herstellung der ersten Kulturen auf schiefen Agarflächen aus den überlebenden Sporen wurden in einem dunklen Raum, der nur durch eine dunkelrote .Glühlampe erhellt war, ausgeführt.

Bestimmung der Fähigkeit zur Produktion von Amyloglucosidaaet

Von jede^r Kultur auf einer schiefen Agarflache wurden mit einer öse je 100 ml einer hitzesterilisierten verdünnten wässrigen Maiamaische geimpft· Die Maische «rfhielt 25 g vermahlenen gelben Zahnmais (dent corn) und 20 $ konzentriertes Maisquellwasser (mit etwa 50 $> Feststoffen) je Liter und war mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt.(Maiaquellwasser ist die Flüssigkeit,

* in welcher Mais zur Erweichung in den ersten Stufen cfes Haßeahlverfahrens eingeweicht wurde. Diese Flüssigkeit wird IB oh dem Eindampfen als Nährbrüohe für das Waohs-

^ tun von Mikroorganismen vertrieben)· Die geimpften Kornmaiachen von je 100 ml wurden in Kolben bei 30⁰C 72 Std.

gMohüttelt.

Die fermentierten, verdünnten Maismaieohen, die wachsende Organieaen aus den Sf·*·* nach der Bestrahlung überlebenden Silieren-enthielten, wurden ale Impfmaterial

ORIGINAL INSPECTED

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zum Fermentieren konzentrierter Maismaischen verwendet, Hierzu wurden je 15 ml fermentierte, verdünnte Maische zum Impfen einer hitzesterilisierten Maismaiaohe verwendet, die aus 20 g vermahlenem gelbem Zahnmaie, 4 g konzentriertem Maisquellwasser, 0,1 g (MU^)₂SO₊ und 0,1 g K₂HPO^ in 185 ml Wasser bestand und mit NaOH auf eine» pH-Wert von 6,0 tingestellt war. Sie Kulturkolben wurden mit Watte leicht verschlossen und 96 Std. bei 3O⁰O unter Schütteln mit 250 Schwingungen/Hinute inkubiert· Die Kulturen wurden hierauf duroh Filtrierpapier filtriert und die Kulturfiltrate duroh Zusatz von Toluol und

bis ■ ' -

Kühlen auf 5 C konserviert,/nach der Bestimmung der Amyloglucosidase-Aktivität, wie oben beschrieben.

Durch die in diesem Beispiel beschriebene Bestrahlung und Züchtung erhielt man ein· Kultur» worin die für die Amylogluooeidaee-Erzeugung verantwortlichen Gene duroh die U7-Bestrahlung so mutiert waren, dai¹ der Organismus unter den Standardbedingungen für dl* fermentation das 2,1-fache an Amyloglucoeidaee-Ein-

erzeugte * _f

heiten/im Vergleich sur ursprünglichen, nicht bestrahlten

Kultur, ,

Aub aer to^sprilnglichsn Mitooorganisieinka^tür wtt de daher nach dea erfindung8g«Biäß*n Verfahr·» tin _{

ORIGINAL

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mutanter Stamm, Aspergillus foetidus ATCC H916» erhalten, der unter den gleichen Fermentationsbedingungen etwa die doppelte Fähigkeit zur Produktion von Amyloglucosidase, im Vergleich zum Mutterstamm.besaß.

Beispiel 2

Man verfuhr nach Beispiel 1, wobei man ala Testorganismus den beschriebenen Mutanten Aspergillus foetidus ATCO 14916 verwendete.

Der so hergestellte Mutant wurde nacheinander auf ein· Reihe schiefer Agarflächen übertragen und in diesen wachsen gelassen, wobei man das Wachstum auf der vorhergehenden Kultur zur Impfung der nächsten schiefen Agarflache und so der Eeihe naoh verwendete. Die 20-igste Kultur auf der schiefen Agarfläche des Mutanten von Aspergillus foetidus ATCC H916 erzeugte bei ihrer Prüfung die 3,9-fache Menge Amyloglucosidas« -B, im Vergleich zur nichtbeatrählten Mutterkuliiir und die 1,9-fache Menge im Vergleich zu Aapergi^ius foetidus ATCC H916» woraus hervorging, daß li· Mutation bei diesem Stamm in Bezug auf die Fähigkeit but Amylogluooeidaseproduktion stabil war.

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lin anderer mutanter Stama von Aspergillus foetidus erhalten nach dem Verfahren von Beispiel 2, besaß die

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Fähigkeit zur Produktion der 5,3-fachen Menge Amyloglucosidase - B, im Vergleich zur nichtbestrahlten Mutterkultur, wenn ctie erste Kultur der Sporen nach der Bestrahlung auf einer schiefen Agarflache geprüft wurde. Dieser Stamm wurde der Reihe nach im Verlaufe von 4 Monaten in 19 weiteren Kulturen auf schiefen Agarflachen fortgepflanzt. Jede der Kulturen dieser Reihe wurde auf.ihre Fähigkeit zur Amyloglucosidase-Produktion geprüft: Diese nahm bis zur zehnten Agarkultur in der Reihe zu, mit welcher man das 4,1-fache der Amyloglucosidase-Aktivität des Mutterstammes erhielt»

In anderen, nicht zu seltenen Fällen, wurden Mutanten beobachtet, die eine beträchtliche Zunahme der Fähigkeit zur Amyloglueosidaseproduktion aufwiesen, doch nahm nach mehreren aufeinanderfolgenden Übertragungen auf schiefe Agarflachen diese Fähigkeit ab, bis sie schließlich auf das Niveau des nicht bestrahlten Mutterstammes abfiel. In diesen Fällen war die Mutation offenbar unstabil} diese Mutanten wurden verworfen.

Um daher durch Bestrahlung einen stabilen Mutanten mit einer möglichst hohen Fähigkeit zur Amyloglucosidase-Erzeugung zu erhalten, empfiehlt es sich, den Mutanten unter günstigen Bedingungen so rasch als möglich und durch mehrere Generationen fortzupflanzen, bevor man eine endgültige Auswahl trifft.

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Das erfindungsgemäße Verfahren hat eine "beträchtliche wirtschaftliche Bedeutung, da bei einem gegebenen Kapitalaufwand für eine Anlage zur Enzymproduktion, einem 'gegebenen Kostenpunkt der Eohstoffe und einem gegebenen Aufwand für Arbeit und Kraft Amyloglucosidase mit standardisierter Aktivität zu einem bestimmten Kilogramm-Preis hergestellt werden kann. Wird, wie in Beispiel 3_f ein Mutant mit etwa der vierfachen Fähigkeit zur Amyloglucosidase-Erzeugung im Vergleich zu anderen, üblicherweise verwendeten Organismen hergestellt, so betragen die Kosten der Herstellung des Enzyms in der gleichen Anlage, mit dem gleichen Materialverbrauch und dem gleichen Arbeite- und Kraftaufwand nur etwa 1/4. Für viele technische Verwendungszwecke, bei welchen dieses Enzym verwendet werden kann, z.B. gegebenenfalls der technischen Herstellung von Dextrose durch enzymatisch« Hydrolyse von Stärke oder anderem stärkehaltigem Material, wie Mais kann diese 75 $ige Kosteneinsparung für das Enzym ein entscheidender Faktor dafür sein, ob das Verfahren wirtschaftlich möglich ist.

Während in den vorstehenden Beispielen gezeigt wurde, daß Aapergillus foetidua ATCO 14916 und dessen Mutanten Amyloglucosidase in hohen, wirtschaftlichen Auebeuten liefern können und das Verfahren zur Gewinnung dieser Mutanten beschrieben wurde, besteht

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ein noch größerer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß dia hierbei erzeugte Amyloglucosidase weitgehend rein ist. Die Brauchbarkeit einer Amyloglucosidaseproduktion·hängt nicht nur davon ab, wieviel AmyloglucosidaseVon einem gegebenen Organismus erzeugt werden kann, sondern auch davon, wie wenig verunreinigend© Enzyme zusammen mit der Amyloglucosidase erzeugt werden« Ferner ist das Ausmaß der Reinigungsoperationen, die zur Herstellung einer Amyloglucosidase des gewünschten Reinheitsgrades erforderlich sind, ein wichtiger Faktor«

Durch die erfindungsgemäße Verwendung von Kulturen des Aspergillus foetidus ATCO 1491 β und seiner Mutanten kann man, ohne zusätzliche Reini^ungj, eine weitgehend reine Amyloglucosidase, di© weitgehend frei van verunreinigenden Enzymen ist, herstellen. Diese verunreinigenden Enzyme würden zu niedrigeren Ausbeuten an Dextrose bei der Umwandlung von Stärke mit Hilfe soleher verunreinigter Amyloglucοsidas©-Präparate führen· Dies wird in den nachfolgenden Beispielen gezeigtι

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird die deutliche Verminderung der üiransglücoeidase undoi-Amylaee-Äktlvität bei der erfindungsgemäßen Amylöglacesiiaee-Herstellung gezeigt·

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Durch submerse Kultur von Aspergillus niger NRRI 330, AapergilluB foetidue ATCC H916 und eines nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellten Mutanten von Aspergillus foetldus ATCC 14916 wurden Amyloglueosidasepräperate hergestellt. Aspergillus niger NRRIi ist ein bekannter Stamm zur Herstellung von AmyIoglueοsidase* Man ließ die Kulturen unter andauernder Belüftung und Bewegung bei 32⁰C wachsen. Das Gärmedium wurde durch Vermengen der Bestandteile in den nachstehenden Verhältniesen hergestellt: 25 g eines Maisquellwasser-Konsentrats wurden 1 000 ml Wasser zugegeben, der pH-Wert duroh Zusatz einer Natriumüydroxydlösung auf 6,0 eingestellt und hierauf 150 mg handelsübliche Bakterienamylaee und 150 g vermahlener gelber Mais zugegeben. Das Gemisch wurde hierauf in einem geschlossenen Grärgefäß unter andauernder Bewegung bis zu einem Dampfdruck von 1,05 atü (15 psig) (121⁰C) erwärmt, 30 Min. bei diesem Druck gehalten und hierauf auf 32⁰C abgekühlt. Die abgekühlte Maische wurde mit etwa 5 # ihres Volumens einer 24· etündigen vegetativen Kultur des betreffenden Organismus, der in einer submersen Kultur auf einem ähnlichen Medium gewachsen war, geimpft und unter einen Druck von 1,05 atü (15 psig) bei 32 C unter andauernder Belüftung und Bewegung inkubiert, bis eine maximale Anylogluoosidaseproduktion erzielt war, wie

dies durch Untersuchung

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von Proben der. fermentierenden Würze festgestellt wurde. Das erforderte gewöhnlich 72 bis 96 Std. Das Myzel wurde hierauf abfiltriert und das Enzym aus dem klaren Piltrat durch Zusatz von Alkohol gefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Die aus den verschiedenen Kulturen auf diese Weise erhaltenen gefällten Enzymprodukte wurden auf ihre enzymatische Aktivität untersucht, wobei nachstehende Ergebnisse erhalten wuruen:

Tabelle 1

	A.	niger	,6 E/g	A.	foetidus	,3 E/ml	Mutant· von	foetidus	Vg	,8	■	,95
Amyloglucosidase- BeStimmung	NRRL 330		Ä~TCC 1.4916		A.	ATCC Ί4916	,04
Transglucosidase,fo au Maltose entstandene unvergärbare Substanz						,8
-^.-Amyläse, SKB-E/g	55	,30	28	,0	160
Protease, N-E/g	3 23 sn	,30	15	,171	3
Tß/AG-Verhältnis	1018	,3	124	,3	128
SKB/AG-Verhältnis	3	1	1
0	0	0
18	4	0

Beispiel 5

Durch submerse Kultur von Aspergillus niger URRL 330 und eines nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellten Mutanten von Aspergillus foetidus ATCC 14916 erhaltene Amyloglucosidasepräparate wurden auf ihre Transglucosidase-Aktivität unter Verwendung C -markierter radioaktiver

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Maltose geprüft. Getrennte Lösungen, enthaltend 0,2 m ΰ , iY-markierte Maltose und etwa 2E Amylogluoosidase je ml Enzym-Zubereitung wurden 4 Std. "bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zucker in den Lösungen wurden hierauf durch aufsteigende Papierchromatographie getrennt und quantitativ durch Zählung der Radioaktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Enzymproduzierender Organismus	Hydrolysierte Maltose, #	Entstandene Panose, io der hydrolysier- ten Maltose
A. ni«er NRRL 330	41 55	28 1,9
Mutant von A.foetidus
ATCC 14916

Beispiel 6

In einem Gärkessel von 9460 1 (2500 gallons) Inhalt wurden 7570 1 (2000 gallons) Wasser mit 188 kg (415 lbs) Maisq.uellwasserkonzentrat unter Rühren mit 172 TJpM vermengt. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 13,6 kg (30 lbs) einer 50$igen Natriumhydroxydlösung auf 6,0 eingestellt. Dann wurden 1520 kg (3350 lbs) vermahlener gelber Mais und hierauf 765,4 g (27 ounoes) einer handelsüblichen Bakterienamylase, die in 3,79 Litern (1 gallon) Wasser suspendiert

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war und 500 ml eines handelsüblichen Entschäumers zugegeben. Der Gärkessel wurde verschlossen und sein Inhalt durch Einleiten von Dampf in die Doppelwand auf 1,05 atü (15 psig) (121⁰C) erwärmt und bei diesem Druck 30 Minuten zur Sterilisierung der Maische gehalten. Hierauf wurde die Maische auf 32⁰O abgekühlt und mit 662 1 (175 gallons) einer Impfkultur eines Mutanten von Aspergillus foetidus ATCC 14916 geimpfte Dieser war nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt und 24 Std. auf einem Medium ähnlicher Zusammensetzung in einem Tank zur Herstellung der Impfkultur unter andauernder Belüftung und Bewegung gewachsen. Man ließ bei 32⁰C und 1,05 atü (15 psig) Druck unter Rühren mit 172 UpM und Belüftung mit 1,70 m³/min (606)<FM) fermentieren, bis nach 86 Std. eine maximale Amyloglucosidase-Aktivität von 5,5 E/ml erzielt war. Das Myzel wurde hierauf über ein vorbeechichtetes Vakuumfilter(precoat filter) filtriert und das klare Filtrat im Vakuum bei einer Temperatur von unter 35⁰C eingeengt, wobei man ein flüssiges Konzentrat mit 30 E/ml Amyloglucosidase erhielt. Uach dem Verfahren zur Bestimmung der Transglucosidase-Aktivität fand man bei diesem Produkt, daß 2,3 9& Maltose in unvergärbare Zucker umgewandelt waren. Die ck-Amylase-Bestimmimg ergab 25,2 SKB-E/ml und die Proteasebestimmung ergab einen so niedrigen Wert, daß keine Berechnung der Einheiten möglich war«

Beispiel 7

Ein in einem ffroßansatz nach dem Verfahren von Beispiel 6 hergestelltes amyloglucosidasehaltiges Material,

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das als Enzym D bezeichnet wurde, wurde mit einem ebenfalls in einem Großansatz durch. Fermentation mit einem ausgewählten Rriizopus-Stamm hergestellten Material verglichen, das als Enzym R bezeichnet wurde. Die Ergebnisse der Enzymbestimmungen sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Enzymprä parat	Amyloglu- cosidaee E/g	Transgluco- sidase: Entstandene unvergärbar' Substanzen,^	QO -Amyl- ase, SKB- E/g f°	Enzym	- Verhältnif
D R	26,3 50,2	1,99 34	29 633	TG/AG	SKB/AG
0,002 0,515	1,1 12,6

Beispiel 8

Es wurde ein Schlamm aus 35 ψ Maisstärke in Wasser hergeetellt und 0,05 $, auf das Stärkegewicht bezogen, einer handelsüblichen Bakterienamylase zugesetzt. Das Gemisoh wurde allmählich auf 85⁰C erwärmt und 10 Min. bei dieser Temperatur gehalten, «fahrend des Erwärmens gelatinierte die Stärice und verflüssigte sich unter der Wirkung der Bakterienamylase. Das Gemisch wurde hierauf auf 60⁰O abgekühlt und der pH-Wert mit Chlorwasserstoff säure auf 4,3 eingestellt. Getrennten Mengen der flüssigen Stärke wurde soviel eines jeden aer Enzympräparate

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aus Beispiel 7 zugegeben, daß 176 Amyloglucosidase-E je kg Stärke (80 E/Tb) vorhanden waren. Nach 72 und 96 Std. Inkubieren bei 6O⁰O wurden Proben genommen und der Zucker bestimmt. In nachstehender Tabelle 4 sind die Ergebnisse als Dextroseäauivalente (DE) ausgedrückt, Diese sind definiert als gesamte reduzierende Zucker, ausgedrückt als Dextrose und berechnet als $ der gesamten Trockensubstanz. ·

Tabelle 4

; Snzympräparat	DE nach	Inkubation von
	72 h	92 h
D	99,4	100,1
R	80,2	78,7

Wie man aus vorstehendem Beispiel ersehen kann, empfiehlt sich vor aer Anwendung von Amyloglucosidase auf das stärkehaltige, in Dextrose umzuwandelnde, Material die Verwendung einer kleinen Menge einer verflüssigend wirkenden Amyläse, z.B. einer Bakterienamylase. Die Amylase kann in einer Konzentration von etwa 0,05 G-ew.-^o bis etwa 0,15 Grew«-?&, auf die Stärke bezogen, verwendet werden. Am günstigsten erfolgt die Behandlung mit der Amylase bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 7,5 und

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einer Temperatur von etwa bO°C bis etwa 9O⁰C.

Die Verflüssigung der Stärke in dem zu verarbeitenden stärkehaltigen Material wird leicht in etwa 10 Min. bis etwa 40 Min. unter den obigen bevorzugten Bedingungen erzielt.

Statt mit einer Amyläse, kann man die Verflüssigung auoh duroh eine Säurehydrolyse herbeiführen. Die Verwendung von Chlorwasserstoffsäure für diesen Zweck ist wohlbekannt. Hierzu setzt man Chloreewasserstoffsäure bis zu einem pH-Wert von etwa 1,5 bis 2,0 zu. Die Temperatur wird hierauf auf etwa 130⁰C bis etwa 135⁰C, bei einem Druck von etwa 2,46 Wi etwa 2,81 atü (35-400 gebracht, wozu etwa 17 bis 20 Minuten erforderlich sind. Das Erwärmen erfolgt vorzugsweise unter Druck, da so der erwünschte Hydrolysengrad in kürzerer Zeit erreicht wird; Nach Erreichen der gewünschten Temperatur muß man im allgemeinen das Gemisch nur kurze Zeit auf dieser Temperatur halten, z.B. 1 Minute, um einen Hydrolysengrad zu erreichen, der etwa 15 bis 18 DE entspricht.

Naoh der Verflüssigung der Stärke des stärkehaltigen zur Dextroseerzeugung verwendeten Materials kann die Behandlung der verflüssigten Stärke mit der oben beschriebenen, weitgehend reinen Amyloglucosidase nach der Erfindung vorteilhafterweise durchgeführt werden,

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indem man etwa 154 bis etwa 198 E Amyloglucosidase je kg Stärke (70 - 90 11/Ib) verwendet. Der pH-Wert wird durch Zusatz einer geeigneten Säure, z.B. Chlorwasserstoff säure, nach der Vorbehandlung mit einer Amylase, vorzugsweise auf etwa 3,8 bis etwa 5,5 eingestellt oder, bei Anwendung einer Säurehydrolyse, wird der pH-Wert durch Zusatz einer geeigneten Base z.B. Calciumhydroxyd, auf die gewünschte Höhe gebracht. Die Temperatur wird zunächst auf etwa 50°ö bis etwa 65⁰C erniedrigt und dann während der gesamten Umsetzung auf etwa derselben Temperatur gehalten. Die für diese Umwandlung erforderliche Zeit beträgt etwa 24 bis etwa 136 Std., insbesondere bevorzugt etwa 45 bis etwa 90 Std..

Beispiel 9

Die Enzympräparate aus Beispiel' 7 wurden unter Verwendung von mit Säuren verflüssigter (thinned) Stärke verglichen. Die Maisstärkesuspension mit 35 # Peststoffen wurde durch Zusatz von Chlorwasserstoffsäure und Erhitzen unter Überdruck bis auf 15 DE verflüssigt und hydrolysiert. Der pH-Wert wurde auf 4,3 eingestellt und verschiedenen Portionen der verflüssigten Stärke je eines der Enzympräparate bis zu einem Gehalt von 176 E Amyloglucosidase je kg Stärke zugegeben. Bach 72 Std. Inkubieren bei 60⁰C wurden Proben jedes der G-äraneätze filtriert und

so
Zuckerbestimmungen/wohl an filtrierten, als auch an unfiltrierten Proben vorgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.

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	Tabelle	4	1A-28	,3	935	1	442060	9
	5		,2				1
enzympräparat	Nicht filtrierter Gäransatz, DE		Filtrierter Gäransatz, DE
D	93
R	88
Beispiel 10
	96
92

Einem Schlamm, enthaltend 35 Gew.-?*> Maisstärke (Pearl Corn Starch^ wurden 0,05 y>, auf das Gewicht aer Stärke bezogen, einer handelsüblichen Bakterienamylase zugegeben. Das Gemisch wurde allmählich auf 85⁰O erwärmt und 10 Min. bei dieser Temperatur gehalten. Hierauf wurde auf 6O⁰C abgekühlt, der pH-Wert auf 4,0 eingestellt und ein nach Beispiel 6 hergestelltes flüssiges Amyloglucosidasepräparat in einer Menge, entsprechend 176 E Amyloglucosidase je kg Stärke, zugegeben. Das Gemisch wurde bei 6O⁰C gehalten. Zur Analyse wurden nach je 24 Std. Proben entnommen. Nach 24- Std. war die DE 93, nach 48 Std. 100 und nach 72 Std. 100. Nach 72 Std. wurde der Gäransatz mit Kohle Gehandelt und filtriert. Die DE des Filtrates betrug 100. Das Filtrat wurde auf einen Feetstoffgehalt von 80 fi eingedampft und der Syrup in eine Pfanne gegossen, worin man ihn in einem kalten Raum erstarren ließ. Die Analyse des festen Produktes ergab 9,1 # ieuehtig-

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keit und in der Trockensubstanz 99,89 % Ge samt zucker, 99,23 ^c/o Dextrose und 0,13 ^ Asche.

Beispiel 11

Ein weiterer Abbau von Maisstärke wurde nach Beispiel 10 durchgeführt. Die fermentierte Flüssigkeit wurde mit Kohle behandelt und filtriert und das . Filtrat durch Kationen- und Änionenaustauscherharze enthaltende Säulen geleitet. Die Lösung wurde hierauf auf einen Feststoffgehalt von 80 °/o eingedampft und der Syrup in einer Pfanne in einem kalten Raum erstarren gelassen. Analytisch wurde in dem Produkt ein Feuchtigkeitsgehalt von y γ<> iestgestellt und ein Gehalt von 99,0 fo Gesamtzucker und 98,4 i° Dextrose in der Trockensubstanz, während keine Asche und kein Stickstoff gefunden wurden.

Beispiel 12

Ein Schlamm mit etwa 35 i» naßvermahlenem, entkeimtem Mais wurde durch Zusatz von Oalciumhydroxyd auf einen pH-Wert von 6,1 eingestellt. Die Stärke wurde durch Zusatz von 0,08 ^ einer handelsüblichen Bakterienamylase, allmähliches Erwärmen auf 85°C und 10 Minuten Erhalten auf dieser Temperatur verflüssigt.

Hierauf wurde das Gemisch auf 6O⁰C abgekühlt, der

nach pH-Wert auf 4,2 eingestellt und ein/dem "Verfahren

von Beispiel 6 erhaltenes flüssiges Amyloglucosidase-

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präparat in einer Menge, entsprechend 176 E Amyloglucosidase je kg trockener· Feststoffe zugegeben. Das Gemisch wurde "bei 60⁰C gehalten und in Abständen Proben zur Analyse entnommen. Hach 24 Std. war die DE 75, nach 48 Std. 77, nach 110 Std. 78 und nach 136'Std. 79. Die fermentierte Flüssigkeit wurde filtriert. Die DE des filtrates wurde zu 98 gefunden. Nach zweimaliger Behandlung mit Kohle, der beide Male eine Filtration folgte, wurde das Filtrat auf einen Feststoff gehalt von 77 f> konzentriert. Der Syrup wurde in eine Pfanne gegossen und in einem kalten Kaum erstarren gelassen.

Aus den Ergebnissen geht klar hervor, daß man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren weitgehend reine Amyloglucosidase herstellen und zur Umwandlung von Stärke in Dextrose verwenden kann.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung weitgehend reiner Amylogluoosidase, die nur mit ungewöhnlich kleinen

* Mengen Transglucosidase, CG-Amylase und andereajverunreinigender Enzyme verunreinigt ist und zur Umwandlung von in stärkehaltigen Substanzen enthaltener Stärke in Dextrose ergibt, Erfindungsgemäß wird die Fermentation eines geeigneten kohlenhydrathaltigen Mediums unter Verwendung einer neuen Pilzkultur von Aapergillus foetidua ■

OFUGINAL INSPECTED 809809/0706

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ATCC 14916 oder eines Mutanten derselben durchgeführt»

Patentansprüche

954023

80980S/0706

Claims (10)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Amyloglucosidase, dadurch gekennzeichnet , daß man ein kohlenhydrathaltiges Medium mit einer Kultur von Aspergillus foetidus ATOC 14-916 oder einem Mutanten desselben fermentiert·

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man in dem kohlenhydrathaltigen Medium eine Quelle für Protein mitverwendet·

3· Verfahren zur Herstellung von Amyloglucosidase, dadurch gekennzeichnet , daß man ein, eine Quelle von Kohlenhydraten und eine Quelle von Proteinen

von enthaltendes, Medium mit einer Kultur/ (Aspergillus foetidus ATCC 14-916 ] oder einem Mutanten desselben impft und das Medium bei einer Temperatur von etwa 20⁰C bis etwa 35⁰C und einem Druck von etwa 1,05 bis etwa 2,10 atü etwa 72 bis etwa 96 Std· fermentiert·

4· Verfahren zur Umwandlung in stärkehaltigen Substanzen enthaltener Stärke in Dextrose, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stärke verflüeaigt und die verflüssigte Stärke mit einer weitgehend reinen Amyloglucosidase behandelt, die durch Fermentation eines kohlen-

809809/0706

hydrathaltigen Mediums mit einer Kultur von Aspergillus foetidus ATGO 14916 oder eines Mutanten derselben erzeugt wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man die Stärke durch Säurehydrolyse verflüssigt.

6β Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man die Stärke durch enzymatisch^ Hydrolyse mit einer Amylase verflüssigt,

7· Verfahren zur Umwandlung von, in stärkehaltigen Substanzen enthaltener , Stärke zu Dextrose, dadurch gekennzeichnet , daß man einen wässrigen Schlamm des stärkehaltigen Meterials herstellt, die in diesem anwesende Stärke verflüssigt und die verflüssigte Stärke bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 5,5 und einer Temperatur von etwa 5O⁰O bis etwa 65⁰C etwa 24 bis etwa 136 Std. der enzymatischen Hydrolyse mit einer weitgehend reinen Amyloglucosidase unterwirft, die durch Fermentation eines kohlenhydrathaltigen Mediums mit einer Kultur von

Aspergillus foetidus ATGC 14916 oder eines Mutanten desselben hergestellt wurde·

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß man die Stärke durch Säurehydrolyse verflüssigtο

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ST-

9. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet , daß man die Stärke durch enzymatisch^ Hydrolyse mit einer Amylase verflüssigt»

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e k e η η -

ze ichne.t , daß man die Stärke durch Zusatz von Chlorwasserstoff säure bis zu einem pH-Wert von etwa 1,5 bis 2,0, Erhöhen der Temperatur des Gemisches auf etwa 13O⁰C bis 135⁰O bei einem Druck von etwa 2,53 bis etwa 2,81 atü und Erhalten der Temperatur des Gemisches auf dieser Höhe während etwa 1 Minute verflüssigt und so eine teilweise hydrolysierteStärke mit etwa 15 DE bis etwa 18 DE herstellt»

11· Verfahren nach Anspruch 7 $ dadurch gekennzeichnet , daß man die Stärke verflüssigt,indem man «ie mit etwa 0, 05 Gew.-^ bis etwa 0,15 Gew.-^ einer Bakterienamylase bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 7»5 und einer Temperatur von etwa 60⁰C bis etwa90°C etwa 10 Hinuten bis etwa 40 Hinuten behandelt«

ORIGINAL INSPECTED

809809/0706