DE2018058B2

DE2018058B2 - Biotechnisches verfahren zur herstellung von glucose-isomerase

Info

Publication number: DE2018058B2
Application number: DE19702018058
Authority: DE
Inventors: Charles Edward Elkart Ind. Brownewell (V.StA.)
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1969-04-16
Filing date: 1970-04-15
Publication date: 1973-07-19
Also published as: IT1045522B; IL34186A0; GB1280396A; IL34186A; FR2043399A5; LU60734A1; DE2018058C3; NL7005183A; US3625828A; CA920077A; JPS5538115B1; NO128540B; BE748992A; DE2018058A1; DK128125B

Description

Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, da- Die USA.-Patentschrift 2 950 228 beschreibt ein

durch gekennzeichnet, daß man als Verfahren zur Umwandlung von Dextrose in Läyulose

Mikroorganismus Streptomycss olivaceus NRRL iq (Glucose in Fructose) mit HMe von Mikroorganismen,

3583 einsetzt wozu in den Beispielen 1 bis 3 Pseudomonas hydro-

phila und im Beispiel 4 ein spezieller Bacillus-Stamm genannt werden. Der im Beispiel 4 eingesetzte Bacillus-

Stamm ist nicht genau angegeben und ist daher nicht

15 als zum Stand der Technik gehörend anzusehen. Nach den übrigen Beispielen werden von der eingesetzten

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Dextrose nur 11 bis 33 %, erfindungsgemäß aber mehr von Glucose-Isomerase durch aerobes Züchten eines als 40% in Fructose umgewandelt
Mikroorganismus der Gattung Streptomyces in einem Die britische Patentschrift 1103 394 betrifft die Xylose enthaltenden Nährmedium bei hierfür üblichen ao Umwandlung von Glucose in Fructose mit Hilfe von Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen. Mikroorganismen der Gattung Streptomyces. Dabei Süße Sirupe sind weitverbreitet und werden z. B. ist der Stamm Streptomyces albus YT-Nr. 4 nicht als beim Backen, bei der Herstellung von Konditorei- Stand der Technik anzusehen, da er nicht hinterlegt waren und in der Getränkeindustrie verwendet. Diese worden ist. Mit Streptomyces flavovirens, Strepto-Sirupe bestehen im allgemeinen aus Saccharose (Rohr- 25 myces echinatur und Streptomyces achromogenus zucker) oder Dextrose enthaltenden Produkten, die werden entsprechend Tabelle 1 Umwandlungen von bei der Stärkehydrolyse erhalten werden, als Haupt- allenfalls 20, 24 bzw. 36% erzielt, während die Umsüßungsmittel. Wenn ein Sirup benötigt wird, der Wandlung der Fructose mit Hilfe des erfindungsgesüßer ist als derjenige, der aus Saccharose erhalten mäßen Verfahrens mindestens 40% beträgt,
wird, wird ein Invertzucker-Sirup verwendet. Dieser 30 In der japanischen Patentschrift 7 428-66 sind zur wird durch saure Hydrolyse von Saccharose herge- Herstellung von Glucose-Isomerase verschiedene Arten stellt, wobei ein Gemisch aus ungefähr 50% Glucose von Streptomyces angegeben. Ein hinterlegter Stamm (Dextrose) und ungefähr 50% Fructose (Lävulose) ist nicht angegeben. Aus Tabelle 1 (Beispiel 2) dieser entsteht. Während Glucose etwas weniger süß ist als Patentschrift geht hervor, daß mit Streptomyces Sa-Saccharose, ist die Fructose süßer als Saccharose, so 35 vovirens die besten Ergebnisse erhalten wurden. Aus daß die Gesamtsüße, verglichen mit Saccharose, zu- dem Versuchsbericht (s. unten) ergibt sich, daß unter nimmt. Anwendung eines Mediums, das im wesentlichen dem Es ist bekannt, daß Dextrose unter alkalischen in Beispiel 2 dieser japanischen Patentschrift einge-Bedingungen in Fructose umgewandelt werden kann. setzten entspricht, für die Züchtung des Str. olivaceus Diese Umwandlung hat große potentielle Bedeutung 40 NRRL 3583 bzw. des Stammes Str. flavovirens, welfür die Herstellung von süßem Sirup. Die alkalische eher bei Northern Utilisation Research and Develop-Umwandlung hat jedoch keinen kommerziellen Erfolg ment Division, Agricultural Research Service of the gehabt, da die alkalische Reaktion zu einem uner- United States Department of Agriculture, Peoria, wünscht hohen Gehalt von Aschen in dem entstehen- Illinois, mit der Bezeichnung B 2685 erhältlich ist, im den Sirup führt, der nur unwirtschaftlich zu entfernen 45 Falle des Str. olivaceus NRRL 3583 wesentlich höhere ist. Der Sirup kann, ohne daß diese Aschen entfernt Glucose-Isomerase-Aktivitäten erhalten werden konnwerden, nicht verwendet werden. ten.

Es wurde dann versucht, Glucose enzymatisch in Auch in der japanischen Patentschrift 7 430-66 sind Fructose umzuwandeln. Aus der USA.-Patentschrift verschiedene Streptomyces-Stämme bzw. -Arten zur 2 950 228, der britischen Patentschrift 1103 394, den 50 Herstellung von Glucose-Isomerase beschrieben. Aus japanischen Patentschriften 7 428-66,7 430-66,7 832-66, den dort angegebenen Tabellen geht hervor, daß die 13 799-66 und 17 640-66 ist bekannt, daß Mikro- besten Ergebnisse mit Streptomyces achromogenes erorganismen von Pseudomonas hydrophilia, Bacillus, zielt werden. Ein hinterlegter Stamm ist nicht ange-Streptomyces, wie Streptomyces flavovirens, Strepto- geben. Wie aus dem Versuchsbericht (s. unten) hervormyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Strepto- 55 geht, werden mit Hilfe des erfindungsgemäß angewandmyces albus u. ä., sowie von Lactobacillus fermenti in ten Stammes Streptomyces olivaceus NRRL 3583 einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden bessere Ergebnisse erhalten als mit dem zu Streptokönnen, wobei Enzyme gebildet werden, die Glucose- myces achromogenus gehörenden Stamm, der bei Isomerase-Eigenschaften besitzen. Diese bekannten Northern Utilisation Research and Development Divi-Verfahren setzten sich jedoch kommerziell nicht durch, 60 sion, Agricultural Research Service of the United da entweder die Ausbeuten an Enzym während des States Department of Agriculture, Peoria, Illiniois, mit Enzymproduktionsprozesses oder die Ausbeuten an der Bezeichnung B 2120 erhältlich ist, wenn beide in Fructose, wenn das Enzym zur Umwandlung von Xylose enthaltenden Nährmedien gezüchtet werden. Glucose verwendet wurde, zu gering waren. Wie aus den Tabellen der japanischen Patentschrift Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung 65 7430-66 hervorgeht, liefern Xylose-haltige Medien von Glucose-Isomerase durch aerobes Züchten eines bessere Ergebnisse als Medien, die keine Xylose entMikroorganismus der Gattung Streptomyces in einem halten.
Xylose enthaltenden Nährmedium bei hierfür üblichen In der japanischen Patentschrift 17 640-66 sind 7

^ωεβ!^eben- <& ²^ Isomerase verwendet werden. Wahlweise können die

Si ⁸U ^ge^^^{et Sini Eia ZeUen durct} Potion gewonnen und dann durch be-

ist mcht angegeben. Tn den dortigen _kannte Verfahren aufgebrochen werden. Die ent-

^ÄL^nJ^^ £ ^ ^Streptomyces stehenden aufgebrochenen Zellen und ihr freigesetzter

phaeochromogenes emgesetzt. Wie aus dem Versuchs- 5 Zellinhalt können als QueUe für Glucose-Isomerase

beruht (s. unten) hervorgeht, fuhrt ein hinterlegter verwendet werden. Außerdem können die Zellen auch

Vertreter von Stoptomyces phaeochromogenus unter z. B. durch Ultraschall oder Homogenisierungsappa-

Anwendung enteprechender Nahrmedien zu weniger rate aufgebrochen und die Trümmer können durch

guten Ergebnissen als der erfindungsgemäß einge- Zentrifugation entfernt werden. Die überstehende

^Su- ^Tv.Ai, », a ■ " ^üssigkeit kann direkt als Quelle für die Glucose-Iso-

u% S> S ^ L^na? Japanischen Patent- merase verwendet werden oder sie kann zu einem feinen schnft 7832-66 wird Streptomyces bobdiae emgesetzt. Pulver für spätere Verwendung lyophUisiert werden. Ein hinterlegte- Stamm ist nicht angegeben. Ein Ver- Das Enzym kann aus der oben beschriebenen Übertreter von Streptomyces bobihae führt jedoch nach stehenden Flüssigkeit auch durch bekannte Ausfäll-^Tl *·Λ*Γ ^{Γ obe}P8^enamite^ Japanischen Patent- 15 mittel, wie Methanol oder Ammoniumsulfat, ausgefällt schnft 7 430 zu weniger guten Ergebnissen als der dort werden
eingesetzte Stamm von Streptomyces achrcmogenes. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Glucose-Iso-

Die japanische Patentschrift 13 799-66 betrifft die merase zur Fructoseerzeugung kann duich die fojgen-

Hersiellung von Fructose aus Glucose unter Anwen- den beiden Bestimmungsmethoden bestimmt werden, dung von Lactobacillus fermenti. ₂₀

Dort ist angegeben, daß die Glucose-Isomerase des Bestimmungsmethode 1

Lactobacillus fermenti-Mycels unter bestimmten Be- Es wurde eine 50%ige (Gewicht/Volumen) wäßrige

dingungen nach 72stundiger Inkubation eine Glucose- Lösung von Glucose mit 0,005 m Ammoniumchlorid,

Umwandlung vor1 48% erreicht. Nach dem erfin- 0,1m Magnesiumsulfat und 0,001m Cobaltchlorid

dungsgemaßen Verfahren wird aber eine Glucose-Um- a₅ hergestellt. Diese Lösung besaß einen pH-Wert von

Wandlung zu Fructose m Höhe von mindestens 40% 9,0. 5 ml der oben angegebenen gepufferten Glucose-

bereits innerhalb 1 Stunde erzielt. ]ö_SUng wurden mit 5 ml einer Glucose-Isomerase-

Der fur das erfmdungsgemaße Verfahren geeignete Lösung vermischt. Diese zuletzt genannte Lösung

Stamm gehört zu Streptomyces olivaceus. Er wurde kann eine Suspension von ganzen Bakterienrellen, eine

bei der Northern Utilisation Research and Develop- 30 Suspension von aufgebrochenen ZeUen oder die En-

ment Division, Agricultural Research Service of the zymlösung, die von den aufgebrochenen Zellen ge-

United States Department of Agriculture, Peoria, vrannen worden ist, sein. Das oben angegebene Ge-

Illinois, hinterlegt und erhielt die Nummer NRRL 3583. misch wurde gut geschüttelt und 60 Minuten auf 70° C

Diese Kultur ist für die Öffentlichkeit unbeschränkt erwärmt. 1 ml des entstehenden Reaktionsgemisches

erhältlich. ₃₅ wurde weggenommen und mit 9 ml O,5n-Perchlor-

Der Streptomyces olivaceus NRRL 3583 wird auf säure vermischt. Es wurden mit Wasser weitere Ver-Agarschrägen gehalten und kann in einem Xylose ent- dünnungen hergestellt, wie sie notwendig waren, um haltenden Nährmedium gezüchtet werden. Günstiger- eine geeignete Endfarbe zu ergeben. Zu 1 ml des entweise enthält das Medium außerdem andere Kohlen- stehenden Gemisches wurde 0,2 ml einer l,5gewichtshydrate, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze. 40 prozentigen Lösung von Cysteinhydrochlorid zuge-Typische Kohlenhydratquellen sind Maisstärke, Dex- geben. Hierzu wurden dann 6 ml eines Gemisches von trose, Lactose, Milchfeststoffe, Weizenkleie u. ä. Typi- 190 ml destilliertem Wasser und 450 ml konzentrierter sehe Stickstoffquellen sind Peptone, Hefeextrakt, Schwefelsäure zugegeben. Unmittelbar darauf wurden Fleischextrakt, Aminosäuren u. ä. Typische anorgani- 0,2 ml einer 0,12gewichtsprozentigen alkoholischen sehe Salze sind Natriumchlorid, Magnesiumsulfat u. ä. 45 Lösung von Carbazol zugegeben. Das gesamte Ge-Diese Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorgani- misch wurde dann geschüttelt und 30 Minuten bei sehen Salze sind bekannt. Die in dem Wachstums- 40⁰C stehengelassen. Die optische Dichte der entmedium verwendete Xylose kann in gereinigter Form stehenden purpurroten Farbe wurde dann gemessen, oder in Form eines rohen xylosehaltigen Materials wobei eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge von vorliegen. 50 560 nm verwendet wurde. Die so erhaltenen Meßwerte

Der Streptomyces olivaceus NRRL 3583 wird gün- für die optische Dichte wurden mit den Werten auf

stigerweise unter Bedingungen der submersen Fermen- einer Standardkurve verglichen, auf der die Fructose-

tation ungefähr 20 bis ungefähr 50 h lang bei einer konzentration gegen die optische Dichte aufgetragen

Temperatur von ungefähr 15 bis ungefähr 35⁰C ge- war. Der Prozentsatz von Glucose, die in Fructose

züchtet. Bei Temperaturen unterhalb ungefähr 15°C 55 umgewandelt worden war, wurde angegeben,

und bei Temperaturen oberhalb ungefähr 35⁰C wird .

die Ausbeute an dem gewünschten Enzym ziemlich Bestimmungsmethode 2

niedrig. Die bevorzugte Wachstumstemperatur beträgt Es wurde eine 62,5%ige (Gewicht/Volumen) wäßrige

ungefähr 25 bis ungefähr 35°C. Es wird günstigerweise Lösung von Glucose hergestellt, indem man unter

Atmosphärendruck angewandt, aber Drücke oberhalb 60 Rühren langsam 625 g wasserfreie Glucose zu 300 ml

und unterhalb von Atmosphärendruck können ohne heißem destilliertem Wasser zugab. Die Lösung wurde

besondere Vorteile oder Nachteile angewandt werden. auf Zimmertemperatur abgekühlt und hierzu wurden

Der Anfangs-pH-Wert des Wachstumsmediums sollte 125 ml einer 1 m wäßrigen Lösung von Tris-(hydroxy-

zwischen ungefähr 6,8 und 7,1 liegen. methyl)-aminomethan vom pH-Wert 8,5, 125 ml einer

Die erfindungsgemäße Glucose-Isomerase wird in- 65 1 m wäßrigen Lösung von Magnesiumsulfat und 50 ml nerhalb der Bakterienzellen gebildet, die während ihrer einer 0,025 m wäßrigen Lösung von Cobaltchlorid zuProduktion wachsen. Die Zellen können von der Gär- gesetzt. Das entstehende Gemisch wurde dann mit brühe abfiltriert und direkt als Quelle für die Glucose- destilliertem Wasser auf 11 verdünnt.

10 ml der oben angegebenen Glucoselösung wurden mit 15 000 UpM 20 Minuten zentrifugiert, und die

in einen 25-ml-Meßkolben gegeben. Es wurde eine aus- optische Drehung (in Grad) der überstehenden

reichende Menge des zu untersuchenden Enzyms züge*· Flüssigkeit wurde durch bekannte Verfahren bestimmt,

geben, um zu einer Reduktion der spezifischen Rota- Es wurde eine Blindprobe auf die gleiche Weise, aber

tion von ungefähr 2,9 bis ungefähr 7,5° zu kommen, 5 ohne das Enzym, gemacht. Die optische Drehung der

wie später beschrieben wird, ©er Kolbeninhalt wurde Blindprobe wurde ebenfalls, bestimmt. Die spezifische

dann mit destilliertem Wasser auf 25 ml verdünnt und Rotation [χ]Ή der Probe bzw. der Blindprobe betrug

das entstehende Gemisch wurde 2 Stund«» bei 60⁹e 2« oder den doppelten Wert der beobachteten optir

stehengelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zu- sehen Drehung. Die prozentuale Umwandlung von

satz von 1 ml einer 0,5 m wäßrigen Lösung vo.n Per- io Glucose in Fructose wurde durch die folgende Formel

chlorsäure abgebrochen. Das Gemisch wurde dann ^berechnet:

Prozentuale Umwandlung = , _JQQ

Diese Bestimmungsmethode wurde auch angewandt, Bedingungen in 1 Minute 1 μΜοΙ Glucose in Fructose um die Aktivität in GIucose-Isomerase-Einheiten zu ao umwandelt. Die Enzymaktiwität in Glucose-Iseaneraseberechnen, wobei eine Glucose-Isomerase-Einheit die Einheiten (GIE) der untersuchten Enzymprobe wurde Menge von Enzym bedeutet, die unter den angegebenen nach der folgenden Formel berechnet:

GIE/g oder OIE/1 = ^ gebildete Fructose · 0,0463

mg oder ml verwendetes Enzym

wobei die μg gebildete Fructose durch Multiplikation Fermentation wurde 24 Stunden lang bei 32° C fortgedes oben berechneten Wertes für die prozentuale setzt. Die Gärbrühe wurde mit 40000 UpM zentri-Glucose-Utnwandlung mit dem Faktor 6,25 · IG⁸ be- fugiert, um die Bakterienzellen abzutrennen. Die Zellen rechnet wurde. wurden dann gefroren und lyophilisiert. Die Aktivität Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele 35 des entstehenden Enzympulvers wurde durch die Benäher erläutert. Stimmungsmethode 2 bestimmt. Es ergab sich eine

Aktivität von 42,6% Umwandlung von Glucose in

Beispiel 1 Fructose.

Eine Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 40 B e i s ρ i e 1 3

3583 wurde in einen 250-ml-Kolben gegeben, der

100 ml eines wäßrigen Gemisches mit Γ,0% Xylose, Eine Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 3583

1,0% Pepton, 0,50% Fleischextrakt, 0,25% Hefe- wurde in ein Fermentationsgefäß gegeben, das wie im extrakt, 0,50% Natriumchlorid und 0,05% Magne- Beispiel 2 ausgerüstet war und 101 des im Beispiel 2 siumsulfat mit einem pH-Wert von 6,8 bis 7,0 enthielt. 45 beschriebenen Mediums enthielt. Es wurde mit Alle oben angegebenen Prozentgehalte sind in Ge- 400 UpM gerührt und Luft in einer Menge von wicht/Volumen angegeben. Der mit dem Bakterium 2 l/Minute durchgeleitet. Die Fermentation wurde geimpfte Kolbeninhalt wurde dann auf einem hin- und 48 Stunden bei 21 bis 31⁰C fortgesetzt. Die Ferment hergehenden Schüttler mit einem Ausschlag von 5 cm tationszellen wurden abgetrennt, in einem Homo- und 176 Bewegungen pro Minute 24 Stunden lang bei 50 genisator aufgebrochen, und die Zelltrümmer wurden 30^pC geschüttelt. Die Bakterienzellen wurden von der durch Zentrifugieren entfernt. Die entstehende überentstehenden Gärbrühe abfiltriert. Durch die Bestim-τ stehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert und die Aktimungsmethode 1 wurde eine Umwandlung von minde- vität des Pulvers durch die Bestimmungsmethode 2 stens 40% Glucose in Fructose bestimmt. bestimmt. Man erhielt 320 GIE/g.

55 Die nach dem erfindungsgemäßea Verfahren hergei

^eispjel 2 stellte Glucose-Isomerase ist zur Umwandlung von

Glucose in Fructose unter anderen als den für die Be?

Eine Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 3583 Stimmung angewandten Bedingungen geeignet. Dies wurde unter Rühren in ein Fermentationsgefäß ge- wird im folgenden Beispiel beschrieben,
geben, das 101 eines wäßrigen Gemisches mit 0,7% 60
Xylose, 0,3% raffinierte Maisstärke, 1,0% Pepton,

0,5 % Fleischextrakt, 0,25 % Hefeexttakt, 0,50 % B P i s ρ 1 e 1 4

Natriumchlorid und 0,05% Magnesiumsulfat und

einem pH-Wert von 7,0 enthielt. Alle oben angege- Eine wäßrige QluGose-Lösung, die 25% (Gewicht/

benen Prozentwerte beziehen sich auf Gewicht/Volu- 65 Volumen) Glucose enthielt, wurde mit einigen Bakmen. Es wurde mit 400 UpM gerührt und Luft mit terienzellen vermischt, die entsprechend dem im Bei; einer Geschwindigkeit von 3 Volumina Luft pro spiel 2 angegebenen Verfahren gezüchtet worden Volumen des Mediums pro Minute durchgeleitet. Die waren. Die Aktivität der Bakterienzellen wurde ent

sprechend Methode 2 bestimmt, und die Zellen wurden in einer Menge von 1,5 GIE pro g Glucose in der Glucose-Lösung verwandt. Man ließ das entstehende Gemisch mit einem pH-Wert von 8,0 72 Stunden bei 60⁰C reagieren. Die entstehende Lösung wurde entsprechend der Methode 2 untersucht, und es zeigte sich, daß eine Umwandlung von Glucose in Fructose von 40,7 % stattgefunden hatte.

Kultur

B 2120

B 2208

B 2685

B 3559

NRRL 3583

Versuchsbericht

Es wurden Versuche durchgeführt, um die Wirksamkeit verschiedener bekannter Streptomycesstämme bzw. der von ihnen produzierten Enzyme mit der erfindungsgemäß erhaltenen Glucose-Isomerase zu vergleichen. Dabei wurden neben dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm Streptomyces olivaceus NRRL 3583 die folgenden bei der Northern Utilisation F-esearch and Development Division, Agricultural Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegten Stämme untersucht.

B 2120 Streptomyces achromogenes,

B 2208 Streptomyces albus,

B 2685 Streptomyces flavovirens,

B 3559 Streptomyces phaeochromogenes.

Diese Kulturen wurden alle unter bekannten Bedingungen bei Raumtemperatur auf Agar gehalten, bis sie ausreichend Sporen gebildet hatten. Die Kulturen wurden dann im Kühlschrank bei 4° C aufbewahrt.

A. Es wurde ein erstes Wachstumsmedium hergestellt, bestehend aus einer wäßrigen Lösung von 1 % Xylose, 1% Polypepton, 0,3% K_SHPO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7 H₈O.

Außerdem wurde ein erstes Fermentationsmedium hergestellt, bestehend aus einer wäßrigen Lösung von 3% Weizenkleie, 4% Maiswasser, 0,1% MgSO₄-7H₁O und 0,025% CoCIjS-OH₂O. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,5 eingestellt

100 ml des oben angegebenen Wachstumsmediums wurden in fünf einzelne 250-ml-Weithals-Erlenmeyer-Kolben gegeben, und die Kolben und der Inhalt wurden 20 Minuten mit Dampf von 1,4 atü sterilisiert. Dann wurden Anteile der oben angegebenen Kulturen in die einzelnen Kolben gegeben und die beimpften Kolben 48 Stunden bei 30°C auf einem Rotationsschüttler mit 275 UpM inkubiert.

100 ml des oben angegebenen Fermentationsmediums wurden jeweils in fünf einzelne 250-ml-Weithals-Erlenmeyer-Kolben gegeben and die Kolben und der Inhalt 20 Minuten mit Dampf von 1,4 atü sterilisiert. Es wurden jeweils Anteile des oben angegebenen inkubierten Wachstumsmediums in einet Menge von 1 Volumenprozent in die einzelnen Kolben gegeben, und die so beimpften Kolben wurden 24 Stunden bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler mit 270 UpM inkubiert. Dann wurden gleiche Anteile der einzelnen Kolbeninhalte entnommen und untersucht. Die Fermentation wurde dann unter den oben angegebenen Bedingungen bis zu einer Gesamtzeit von 48 Stunden fortgesetzt

Die Glucose-Isomerase-Aktrvität jedes Anteils der entstehenden Bakterienzellen wurde nach der Methode 2 bestimmt Man erhielt die folgenden Ergebnisse.

Glucose-Isomerase-	(GIE/1.)
Aktivitä	48 Stunden
24 Stunden	0
0	0
0	0
0	79
0	263
0

B. Es wurde ein zweites Fermentationsmedium her gestellt, bestehend aus einer wäßrigen Lösung voi 0,5% Xylan, 1% Polypepton, 0,3% K₈HPO₄ um 0,1% MgSO₄-7 H₂O.

Einzelne Anteile des oben angegebenen erstei Wachstumsmediums wurden mit den fünf Kulturei beimpft und 48 Stunden bei 3O⁰C inkubiert. Danr wurden jeweils 100 ml des zweiten Fermentations'

_₀ mediums in einzelne Kolben gegeben und mit Anteiler des inkubierten Wachstumsmediums beimpft und 2A bzw. 48 Stunden wie oben angegeben inkubiert. Die Glucose-Isomerase-Aktivität der einzelnen Probet wurde wie oben angegeben bestimmt. Man erhielt die

_as folgenden Ergebnisse.

Kultur

B 2120

B 2208

B 2685

B 3559

NRRL 3583

Glucose-Isomerase-	(Gffi/1.)
Aktivität	48 Stunden
24 Stunden	346
230	0
0	164
218	0
0	250
113

C. Es wurde ein zweites Wachstumsmedium hergestellt, bestehend aus einer wäßrigen Lösung von 1 % Xylose, 1% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,25% Hefeextrakt, 0,5% NaQ und 0,05% MgSO₄ · 7H₁O. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt

Es wurde ein drittes Fermentationsmedium hergestellt, das in seiner Zusammensetzung dem oben angegebenen zweiten Wachstumsmedium entsprach, mit der Ausnahme, daß an Stelle von 1 % Xylose ein Gemisch aus 0,7% Xylose und 0,3% Maisstärke verwendet wurde. Der pH-Wert wurde ebenfalls auf 7,0 eingestellt
Einzelne Anteile des oben angegebenen zweiten

-_o Wachstumsmediums wurden mit den verschiedenen Kulturen beimpft und 24 Stunden bei 3O⁰C auf einem Rotationsschüttler mit 275 UpM inkubiert Jeweils 100 ml des oben angegebenen dritten Fermentationsmediums wurden in einzelne Kolben gegeben und nut

_₅ 2 Volumprozent des inkubierten Wachstumsmediunis beimpft und wie oben beschrieben 24 bzw. 48 Stunden inkubiert Die Glucose-Isomerase-Aktivität der einzelnen Proben wurden wie oben bestimmt

60	Gfacose-Isomerase- Aktivitäl (GIE/1.) 24 Stunden \| 48 Stunden	1112 390 1344 1064 1953
B 2120 .. -.. 6₅ B2208 .. B2685	1022 0 1757 892 2779
B3559
NRRL3583

309529/402

D. Es wurde ein viertes Fermentationsmedium hergestellt, bestehend aus einer wäßrigen Lösung von 0,7% Xylose, 0,3% Maisstärke, 0,25% Hefehydrolysat und 2% Maiswasser. Der pH-Wert wurde mit Natriumhydroxid auf 7,2 eingestellt.

Es wurden einzelne Anteile des oben angegebenen vierten Fermentationsmediums mit den einzelnen Kulturen beimpft und 24 Stunden bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler mit 275 UpM inkubiert. Es wurden nochmals jeweils 100 ml des oben angegebenen Fermentationsmediums in einzelne Kolben gegeben und mit 1 Volumenprozent des inkubierten Mediums beimpft und wie oben beschrieben 24 bzw. 48 Stunden inkubiert. Die Glucose-Isomerase-Aktivität der einzelnen Proben wurde wie oben beschrieben bestimmt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse.

Kultur

Glucose-Isomerase-	(GIE/1.)
Aktivität	48 Stunden
24 Stunden	1341
1300	0
0	1456
279	664
1000	3517
2674

B 2120

B 2208

B 2685

B 3559

NRRL 3583

Aus diesen Versuchsergebnissen geht hervor, daß Streptomyces olivaceus NRRL 3583 als einziger der hier eingesetzten Streptomycesstämme in allen angewandten Medien Glucose-Isomerase-Aktivität erzeugte und daß in nahezu allen Fällen eine höhere Glucose-Isomerase-Aktivität erhalten werden konnte als mit den übrigen Stämmen.

Claims

1 , 2

Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, das da-

Patentanspruch: durch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Streptomyces olivaceus NRRL 3583 einsetzt. Das

Verfahren zur Herstellung von Glucojse-Iso- dabei gebildete Enzym kann in guten Ausbeuten ermerase durch aerobes Züchten eines" Mikroprganis- 5 halten werden und besitzt bessere Eigenschaften für raus der Gattung Streptomyces in einem Xylose die Umwandlung von Glucose in Fructose als die bisenthaltenden Nährmedium bei hierfür üblichen her bekannten Enzyme.