DE2245402C3 - Xyloseisomerase-Enzymzubereitung, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung derselben - Google Patents

Xyloseisomerase-Enzymzubereitung, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung derselben

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DE2245402C3 DE2245402A DE2245402A DE2245402C3 DE 2245402 C3 DE2245402 C3 DE 2245402C3 DE 2245402 A DE2245402 A DE 2245402A DE 2245402 A DE2245402 A DE 2245402A DE 2245402 C3 DE2245402 C3 DE 2245402C3
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Description

>o
Die Erfindung betrifft eine Xyloseisomerase-Enzymzubereitung. ein Verfahren /ur Herstellung einer derartigen Xyloisomerase-Enzymzubereitung durch Züchten eines Streptomyces-Mikroorganismus in einem Nährmedium, die für die Isomerisierung von Glucose w (Dextrose) zu Fructose (Laevulose) geeignet ist, und sie betrifft ferner die Verwendung der Xyloseisomerase-Enzyrruubereitung zum Isomerisieren von Dextrose ?u Laevulose in einer Dextrose enthaltenden Lösung.
Die Herstellung von Glucosesirup und Trockengluco- π sesirup durch Hydrolyse von Stärke hat sich in Richtung zu immer süßeren Erzeugnissen weiterentwickelt. Die Säurehydrolysate, welche die ersten Handelsprodukte darstellten, haben den Weg zu qualitativ besseren, unter Verwendung von Verzuckerungsenzymen gewonnenen bo Erzeugnissen gewiesen, Die Technik ist soweit fortgeschritten, daß es keine Schwierigkeiten bereitet, Enzymhydrolysate mit D, E.-Werten von über 95 zu erzeugen.
Zur Steigerung der Süßigkeit wurden Untersuchungen über die Isomerisierung von Slärkehydrolysalert durchgeführt, um derren Gehalt an Fructose zu erhöhen. Die in der US-PS 23 54 664 beschriebene alkalische Katalyse vermochte diesbezüglich nicht zu befriedigen, und erst seit Entdeckung der Xyloseisomerase (vgl. z. B. Science, 1957. Vol. 125,No. 3249,S. 648-649 und US-PS 29 50 228) sind Fortschritte zu verzeichnen.
Über die Verwendung eines Mikroorganismus der Actinomycetales-Arten zur Gewinnung einer derartigen Isomerase wurde von Sato und Tsumura berichtet, und die von Takasaki und Mitarbeitern unternommenen Arbeiten unter Verwendung von Streptomyces-Mikroorganismen werden z. B. in »Fermentation Advances«, Academic Press-Verlag, New York 1969, S. 561 beschrieben.
Die bekannte Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces zur Gewinnung von Xyloseisomerase erfolgt unter Einsatz von xylose- und -kobalthaltigen Nährmedien, wie dies z. B. in Agr. Biol. Chem, Bd. 30.1966, S. 1247- 1253 beschrieben wird, wo/vch neben Xylose auch Xylan eine mit Erfolg verwendbare Kohlenstoffquelle darstellt.
Xylose und Xylose-Iieferndes Material wurden auch bereits zur Durchführung der aus den DE-US 20 18 058 und 19 34 461 bekannten Verfahren zur Xyloseisomerase-Gewinnung eingesetzt, wobei neben Streptomyces-Stämmen auch deren natürliche oder künstliche Mutanten herangezogen wurden und ein Cobalt-Zusatz erfolgte.
Nachteilig ist jedoch, daß Xylose und das Xylose-liefernde Xylan vergleichsweise teuer sind, und daß der sich als notwendig erweisende Zusatz von Cobalt zusätzliche Probleme bezüglich Abwasserreinigung und Umweltverschmutzung schafft.
Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel und Wege anzugeben für eine auch in technischem Maßstab besonders wirtschaftlich durchführbare Isomerisierung von Dextrose /u Laevulose durch Schaffung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung, die nicht an die Verwendung von Xylose und Cobalt gebunden ist.
Die Lösung dieser Aufgabe gelingt mit Hilfe einer Streptomyces-Mutante bestimmten Typs.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung durch Züchten eines Slreptomyces-Mikroorganismus in einem Nährmedium ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine künstlich hergestellte Streptomyces-Mutante einsetzt, die bei der Züchtung in einem von Xylose und Xylose lieferndem Material und von Cobaltzusatz freiem Medium unter identischen Züchtungsbedingungen mindestens 50% mehr Xyloseisomeraseaktivität als Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 114 bildet.
Die erfindungsgemäße Xyloseisomerase-Enzymzubercicng, die durch Züchten eines Streptomyces-Mikroorganismus i:: einem Nährmedium erhältlich ist, ist dadurch gekennzeichnet, daß sie unter Verwendung einer künstlich hergestellten Streptomyces-Mutante, die bei der Züchtung in einem von Xylose und Xyloselieferndem Material und von Cobaltzusatz freiem Medium unter identischen Züchtungsbedingungen mindestens 50% mehr Xyloseisomeraseaktivität als Streptomyccs olivochromogenes ATCC 21 114 bildet, erhalten worden ist.
Durch die Erfindung wird erreicht, daß eine in sehr einfacher und wirtschaftlicher1 Weise durchzuführende Isomerisierung von Dextrose in Laevulose z. B. bei pH 6,25 und 60 bis 700C innerhalb von 40 bis 48 Stunden ohne Zusatz von Cobalt und ggf. auch ohne Verwendung von Xylose und/oder Xylose-liefernden Materialien bei der Herstellung des Enzyms möglich ist, was insofern überraschehd ist, als sich bisher der Cobaltzu-
Tl 45 402
satz für die Stabilisierung von Xylosejsomerase als unerläßlich erwies, um bei vergleichsweise niedrigen pH-Werten, hohen Temperaturen und langen Reaktionszeiten eine rasche Inaktivierung des Enzyms zu vermeiden.
Die wichtigsten der hier und im folgenden gebrauchten Begriffe sind wie folgt definiert:
D. E-Wert
Der Begriff »D. E« ist eine Abkürzung für »Dextrose-Äquivalent«. Er wird für den Gehalt an reduzierenden Zuckern, berechnet als D-Glucose und bezogen auf Trockensubstanz, verwendet.
Stärkehydrolysat
Der Begriff »Stärkehydrolysat« wird allgemein für einen Sirup oder ein Trockenprodukt verwendet, die durch Hydrolyse von Stärke gewonnen werden Derartige Produkte können durch Hydrolyse von Stärke mit Säuren oder Enzymen oder durch eini: Kombination der Säure- und Enzymhydrolyse erhalten werden. Ein bevorzugter Typ von Stärkehydrolysat für die Isomerisierung entsprechend der vorliegenden Erfindung wird durch Vorverzuckemng mit Säure ode,· Enzym bis zu einem D. E.-Wert von 10 oder weniger und nachfolgende Verzuckerung mit Enzymen bis zu D. E.-Werten über 95, vorzugsweise über 97 hergestellt.
Glucose und Dextrose
Stärkehydrolysate mit mittleren D. E.-Werten werden in der Literatur allgemein als »Glucosesirup« bezeich net, was sowohl für Stärkehydrolysate '.n Sirup- als auch in Trockenform gilt. Die Bezeichnung »Dextrose« ist reserviert für das reine kristallisierte ^lonosaccharid D-GIucose. das aus Stärkehydrolysat mit hohem D. E.-Wert gewonnen wird. D-Glucose ist auch Bestandteil von Glucosesirup und Trockcnglucosesirup mit hohem und mittleren D. E-Werten. In den nachfolgen den Ausführungen wird der Begriff «Dextrose« für daireine kristallisierte Monosaccharid D-Glucose und der Begriff »Glucose« als Bestandteil D-Glucose von Stärkehydrolysaten in Sirup- und Trockenform verwendet.
Fructose und Laevulose
Die Begriffe »Fructose« und » Laevulose« werden in der Literatur im allgemeinen synonym angev/endet und beziehen sich auf das Isomere der D-Glucose, das süßer als Dextrose ist. Das Isomere kommt im Honig und im Invertzucker zusammen mit D-Glucose vor, es isl wertvoll wegen seiner großen Süßigkeit. Entsprechend dem Betriff »Dextrose« sollte auch der Begriff »Laevulose« für das reine kristallisierte Monosaccharid D-Fructose reserviert bleiben. In den nachfolgenden Ausführungen wird deshalb die Be2:eichnung »Fructose« für den Gehalt an D-Fructost· in isomerisierten Stärkehydrolysaten angewendet.
Das verwendete Enzym
Das Enzym, welches D=Glucose zu D-Fructose isomerisiert, ist in der Literatur imit verschiedenen Namen bezeichnet worden. In der angegebenen US-PS 29 50 228 ist es als Xylose-Isomerase benannt worden, weil es Xylose zu Xylulose isomerisiert, Es hat aber auch die Eigenschaft, D-Glucose zu D-Fructose zu isomerl· siereti. Aus diesem Gründe ist es in der Literatur auch als Dextrose-isomerase und Glucose^Isomerase bezeichnet Worden. In den folgenden Ausführungen wird aus Gründen der historischen Entwicklung die Bezeichnung »Xylose-Isomerase« verwendet werden.
Enzym-Zubereitung
Die Bezeichnung »Enzym-Zubereitung« wird für jede stoffliche Zusammensetzung verwendet, die sich durch die gewünschte Aktivität an Xylose-Isomerase auszeichnet Es kann sich dabei beispielsweise um lebende Zellen, um getrocknete Zellen, um Zellextrakte und um ίο raffinierte konzentrierte Zubereitungen aus den Zellen handeln. Enzym-Zubereitungen können sowohl in trockener als auch in flüssiger Form vorliegen.
Einheiten
π Alle Teil- und Gewichtsangaben in den folgenden Ausführungen geben Gewichtsprozente an, sofern nicht etwas anderes gesagt wird.
Isomerase-Einheiten
ίο Eine Isomerase-Einheit wird als die Menge Enzymaktivität definiert, die erforderlich ist, um 1 Mikromol Fructose je Minute unter den nachfolgend unter der Überschrift »Bestimmung der Isomerase-Aktivität« beschriebenen Isomerisierungsbedingungen zu erzeugen.
Strcptomyces
Diese Bezeichnung wird für eine Gattung von Mikroorganismen der Actinomycetales-Arten ge-
jo braucht. Bei diesen Miki oorganismen handelt es sich um aerobe mycelbildende Actinomyceten. Die Gattung ist gut definiert. Einige ihrer wichtigen unterscheidenden Eigenschaften werden in dem Buch »The Actinomycetes« von Selman A. Waksman, Verlag The Ronald
r> Press Company. New York 1967, S. 135 u. ff. beschrieben.
Bevorzugte Mikroorganismen sind mutierte Stämme von Streptomyces olivochomogenes, insbesondere S. olivochromogenes ATCC Nos. 21 713, 21 714. 21 715.
•fn Diese Mikroorganismen haben die erforderlichen funktionellen Eigenschaften, beachtliche Mengen Xylose- Isomerase zu erzeugen, wenn sie in einem Nährmedium kultiviert werden, das frei von Xylose und xyloselieferndem Material und frei von zugesetztem
4Ί Kobalt ist. Obwohl diese spezifischen Mikroorganismen bevorzugt werden, wird angenommen, daß sich jeder Mikroorganismus der Gattung Streptomyces mutieren läßt, um einen Stamm mit den gewünschten Eigenschaften gemäß der Erfindungsdefinition gemäß Anspruch 1 zu erhalten.
Obwohl es in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfinuung möglich ist, geeignete Enzymzubereitungen in technischem Maßstab durch Kultivierung von ausgewählten Mikroorganimsen in einem Nährmedium.
das frei von Xylose und xyloselieferndem Material und im wesentlichen frei von Kobalt ist, herzustellen, werden im allgemeinen bessere und wirtschaftlichere Ergebnisse erhalten, wenn Xylose, Kubalt oder beides in dem Nährmedium, in dem der Mikroorganismus kultiviert wird, vorhanden sind.
Herstellung der mutierten Stämme
Es wurde eine Probe von S. olivochromogenes ATCC 21 114 ausgewählt, weil er als gute Quelle für Xylose-Isomerase bekannt war.
Dieser Mikroorganismus wurde im Sporenzustand mit einer Dosis ultravioletten Lichts bestrahlt, die ausreichend war, um 97% der bestrahlten Mikroorga-
nismen abzulöten. Die bestrahlten Sporen wurden auf einer Platte ausgestrichen, und jede Kolonie wurde hinsichtlich ihrer Enzymaktivität geprüft. Da das Medium, auf dem die Kolonien gewachsen waren, keine Xylose enthielt, um die Bildung des Isomerase-Enzyms zu induzieren, zeigte lediglich die Kolonie, die die gewünschten Eigenschaften hatte, eine positive Enzymreaktion. Diese Kolonie wurde isoliert und eingehend geprüft, um zu zeigen, daß der neue mutierte Stamm tatsächlich beachtliche Mengen Xylose-Isomerase produzierte, ohne daß er im Nährmedium Xylose als Induktionsmittel benötigte.
Die Schritte, die im einzelnen bei diesem Verfahren vollführt wurden, waren im einzelnen wie folgt: S. olivochromogenes ATCC 21114 wurde auf Difco-Stärke-Agar mit 2% Agar gezüchtet, bis die Kultur völlig in den Sporenzusland übergegangen war. Diese Sporen wurden dann gewonnen und in 20 ml einer 0,l%igen Lösung des oberflächenaktiven Mittels Tween 80 (Handelsname für ein Polyoxyalkylen-Derivat von Sorbitanoleal. Hersteller Atlas Powder Co.) suspeudiert. Dann wurde 0.1% eines Dispersionsmittels, Marasperse C (Handelsname für ein Ligninsulfonsäure-Uispersionsmittel. Hersteller Marathon Paper Mills Co.), zugesetzt, und die Suspension wurde mit zwei Stoßen von 15 Sekunden beschallt, um Ketten und Klumpen der Sporen /u zerteilen. Die erhaltene Sporensuspension wurde untersucht und erwies sich als relativ frei von Sporenketten.
Die Sporensuspension wurde in einer flachen Schale unter Rühren den Strahlen einer ultravioletten Lichtquelle, einer WeMinghouse Sterilamp 782H-10 ausgesetzt, und zwar in einem Abstand von 10.16 cm für etwa 8 Minuten. Durch die Bestrahlung wurden 97% der Sporen abgetötet. Die Suspension wurde dann verdünnt, und bei einer geeigneten Verdünnung, die etwg 100 Kolonien je Platte ergab, auf Petrischalen übertragen, die das folgende Medium enthielten:
in
20
25
30
Tabelle 1
Agar-Mcdium
15 D. E.-Trockenglucosesirup 1.0%
Difco-Hefeextraki 0.05%
Difco-Bactopepton 0,05%
Difco-Ba:totrypton 0.05%
Agar 1.5%
pH auf 7.5 mit NaOH
Je Platte wuchsen etwa 40 bis 80 Kolonien, die daraufhin isoliert wurden. Die isolierten Kolonien wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Xylose zu isomerisieren, geprüft, nach dem sie auf einem Medium gewachsen waren, das weder Xylose noch ein xyloselieferndes Material enthielt.
Isolierung und Fermentation mit der Mulante
Es wurde eine Kolonie isoliert, welche während des Wachstums in Abwesenheit von Xylose Isomerase-Aktivität produzierte. Die erzeugte Isomerase-Aktivität wurde zu 0,155 Einheiten je ml ermittelt. Nach einer zweiten Übertragung war die Aktivität auf 0,6 Einheilen/ml angestiegen.
Die Kultur wurde dann mehrmals übertragen und zur erneuten Isolierung ausgestrichen. Elf Kolonien wurden ausgewählt, auf Schrägplalten wachsen gelassen und dann über zwei Impfstufen wachsen gelassen. Die elf Kolonien wurden dawn dazu verwendet, um zwei Kulturmedien, die weiter unten näher definiert und als Medium A und Medium B bezeichnet werde, damit zu beimpfen. Vergleichsweise wurde auch ein Impfmaterial von der Stammkultur S. olivochromogenes ATCC 21 114 dafür verwendet, um damit die gleichen beiden Kulturmedien zu beimpfen. .
Das angewandte Verfahren und die Beobachtungen, die dabei gemacht wurden, werden nachfolgend im einzelnen beschrieben.
Das für die beiden Impfstufen verwendete Medium hatte die in Tabelle 2 angegebene Zusammensetzung:
Tabelle 2
Medium für die erste und zweite Impfstufe
15 D. E.-Trockenglucosesirup 1,0%
Maisquellwasser (55% Feststoffe) 3,6%
MgSO1 · 7 H2O 0,05%
CoCI2 · 6 H2O 0,024%
pH auf 7,0 mit NaOH, 1 Tropfen Antischaummittel je Kolben
Die erste Impfstufe wurde zwei Tage lang mit 100 ml des Mediums in jedem der erforderlichen Anzahl an 500 ml-Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, wobei eine gelegentlich schüttelnde Apparatur bei 28° C verwendet wurue. Es wurden Sporen von jeder einzelnen Schrägplatte dazu verwendet, um jeden dieser Kolben anzuimpfen.
Die zweite Impfstufe wurde dann einen Tag lang mit 200 ml des Mediums in jedem der erforderlichen Anzahl an 1000 ml-Hinton-KoIben durchgeführt, wobei ein Gump-Drehshaker bei 28°C verwendet wurde. Mengen von 10 ml der ersten Impfstufe wurden zum Beimpfen der Kolben der zweiten Impfslufe verwendet.
Je 5 ml des Materials von den zweiten Impfstufen wurden dann zum Beimpfen von Kulturmedien der folgenden Zusammensetzung verwendet (Tabelle 3):
Tabelle 3
Kulturmedien A und B
Medium A
15 D. E.-Trockenglucosesirup 2.0%
Maisquellwasser (55% Feststoffe) 3.6%
NH4NO, 0.2%
Glycin 0,3%
MgSO4 ■ 7 H2O 0.05%
CoCb · 6 H2O 0.024%
pH auf 7.0 mit NaOH
50
55 Medium B
Xylose 2.2%
15 D. E.-Trockenglucosesirup 1,2%
Maisquellwasser (55% Feststoffe) 3.6%
NHiNO1 0,2%
Glycin 0,2%
MgSO4 · 7 H2O 0,05%
CoCI2 · 6 H2O 0,024% pH auf 7,0 mit NaOH
Für die Fermentation wurden je 100 ml des jeweiligen Kulturmediums in jeden der erforderlichen 1-Liter Hinton-Kolben gegeben. In jeden Kolben wurde I Tropfen Antischaummittel gegeben. Danri wurden die Kolben sterilisiert und gekühlt. Nach dem Beimpfen gelangten die Kolben in einen Gump-Drehshaker und wurden 2 Tage lanj bei 28" C gehalten.
Isolierung der Enzymzubereitung
Nach der Fermentation wurde der Inhalt jeden Kolbens 15 Minuten lantr hei Her lonnnfarhpn
Erdbeschleunigung zentrifugiert. Dann wurde die Zellmasse abgetrennt, gewogen und zur Lagerung eingefroren.
Zur Untersuchung öder zur Verwendung wurde die Zellmasse oder eine bestimmt« Menge von ihr mit destilliertem Wasser auf ihr Originalvolumen verdünnt, und die Zellen wurden erneut suspendiert, Nachdem sie sich rekonstituiert hatten, wurde die Zellsuspension in der nachfolgend beschriebenen Weise untersucht.
10
Überführung der Zellsuspension in löslichen Zustund
Um das Enzym für die Untersuchung brauchbar zu machen, ist es zunächst erforderlich, es in löslichen Zustand zu überführen. Eine geeignete Methode, um dies zu erreichen, ist die Beschallung.
Prüfung der Isomerase-Aktivität
Tabelle 4
Stammlösung für die Prüfung
Bestandteile
Menge
/H2O
0,01-171-CoCI2 '6H2O
l-nvPhosphatpuffer, pH 7,5
Dextroseänhydrid
Destilliertes Wasser
1 ml
1 ml
O^ ml
1,44 g
um auf ein
Gesamtvolumen von 7,5 ml aufzufüllen
werden erneut suspendiert in O.OSmolarer Khosphatpufferlösung (pH 7JS). Die Suspension wird dann unter Verwendung eines Branson Soinifiers, Modell 185-D (20 kc) beschallt, bis die mikrobiologischen Zellen der Probe genügend zerstört sind, um das Isomerase-Enzym im wesentlichen in Freiheit gesetzt ist. Durch Kühlen des Probenrohres in einem Eisbad während der Beschallung wird ein Oberhitzen und eine Inaktivierung des Enzyms vermieden.
Die erhaltene Enzymzubereitting war eine Lösung von in Lösung gebrachter Xylose-Isomerase.
30
Das Prüfungsverfahren beruhte auf einer spektrophotometrischen Bestimmung der Ketosen, die aus einer Glucoselösung unter standardisierten Bedingungen gebildet wurden.
Es wurde eine Stammlösung folgender Zusammensetzung angesetzt (Tabelle 4).
Zunächst wurde die Enzymzubereitung, die untersucht werden sollte, soweit verdünnt, daß sie 1 bis 6 Isomerase-Einheiten je ml enthielt.
Es wurde eine enzymatische Isomerisierung in der Weise durchgeführt, daß I ml der Enzymzubereitung zu 3 ml der Stamrnlösung hinzugefügt wurde. Dann wurde 30 mirrüicfi bei 60"C inkubiert. Bei Beendigung der inkubalinszeit, wurde 1 ml durch 9 ml einer 0,5-n-Perchlorsäure inaktiviert. Die aliquote inaktivierte Menge wurde dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Als Kontrolle wurde für Vergleichszwecke auch eine reine Glucoselösung untersucht, wobei zu Beginn der Inkubationszeit anstelle der Enzymzubereitung 1 ml Wasser zugesetzt wurde.
Dann wurde der Gehalt an Ketosen nach einer Cystein-Sci.wefelsäure-Methode bestimmt. Bei der Auswertung der Ergebnisse wurde eine !somerase-Einheit als die Menge Enzym-Aktivität definiert, die erforderlich ist, um unter den beschriebenen Isornerisierungsbedingungen ein Mikromol Fructose je Minute zu erzeugen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt worden.
Für die weitere Untersuchung wurden die Mutanten-Stämme CPC3 (Hinterlegungs-Nr. ATCC 21713), CPC 4 (Hinterlegungs-Nr. ATCC 21714) und CPC 8 ausgewählt. Eine Woche nachdem die erwähnten Ergebnisse vorlagen (Tabelle 5), wurde jede dieser 3 Mutanten dazu verwendet, um erneut die beiden Kulturmedien zu beimpfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle fi 7iiSflmmeniTPfaßt wnrdpn
Tabelle 5
Versuchsergebnisse
Kultur
Ausgangsstamm
Ausgangsstamm
Mutante
Mutante
Mutante
Mulante
Mutante
Mutante
Mutante
Mutante
Mutante
Mutante
Mutante
CPC3
CPC4
CPC6
CPC7
CPC8
CPC9
CPClO
CPCIl
CPC12
CPC13
CPC14
Medium A (ohne Xylose) Medium B (mit Xylose)
Isomerase- Trocken- Isomerase- Trocken-
Aktivität zellgewicht Aktivität zellgewicht
(E/ml) (g/Liter) (E/ml) (g/Liter)
0,24 6,45 7,46 8,75
0,04 6,56 6,63 9,32
5,48 6,87 2,73 8,81
2,06 6,44 5,51 5,82
3,02 5,87 3,72 5,39
1,45 6,66 3,00 9,58
3,11 6,45 5,37 8,08
1,95 6,52 3,54 6,93
2,14 6,72 2,70 7,17
1,58 6,33 3,46 5,99
2,88 7,27 5,50 8,08
2,05 7,33 2,16 10,27
2,37 7,17 6,05 7.14
Tabelle 6
Versuchsergebnisse nach nochmaligem Beimpfen
Kultur
Medium A (ohne Xylose) Medium B (mit Xylose)
Isomerase- Trocken- Isomerase- Trocken-Aktivität zellgewichl Aktivität zellgewicht
(E/ml)
(g/Liter) (E/ml)
(g/Liter)
Mutante CPC3
Mutante CPC4
Mutante CPC8
Diese Untersuchungsergebnisse bestätigten, daß die Mutanten die Fähigkeit hatten, Xylose-Isomerase zu produzieren, ohne daß als Bestandteil des Nährmedium:; Xylose erforderlich war. Wie außerdem beobachtet wurde, produzierten einige Kulturen deutlich mehr Enzym als der Ausgangsstamm, wenn sie in einem xylosehaltigen Kulturmedium zum Wachsen gebracht wurden. Diese Eigenschaft ist für die technische Herstellung äußerst wichtig, weil größere Produktivität bedeutet, daß weniger Fermenter-Kapazität für eine; bestimmte Menge Enzymproduktion erforderlich ist.
480 5,39 11,42 7,53
5,70 6,44 9,68 7,30
2,97 6,10 4,43 6,39
Wirkung der Kohlenhydratquelle im Kulturmedium
Um die Wirkung der Kohlenhydratquelle im Kulturmedium zu zeigen und gleichzeitig die Fähigkeit des mutierten Stammes CPC 3, Enzym zu produzieren, «Venn er in Gegenwart verschiedener Kohlenhydrate ais einziger Kohlenstoffquelle kultiviert wird, zu demonstrieren, wurden verschiedene ausgewählte Stämme von Streptomyces kultiviert Das Kulturmedium war in jedem Fall identisch, mit Ausnahme des Kohlenhydrats. Alle übrigen Bedingungen wurden konstant gehalten. Über die Ergebnisse wird in Tabelle 7 berichtet
Tabelle 7
Wirkung der Art des Kohlenhydrats auf die Isomeraseproduktion mit Streptomyces-Kulturen
Organismus
Glycerin Mannose Glucose 15D.E.- GIucosc-Isomerase-Aktivität (Einheiten/ml) - 0,3 0,2 15D.E.-
(2%) (2%) (1,5%) Stärke- - - 0,3 0,2 Stärke-
hydrolysat - 0,4 0,2 0,2 hydrolysat
(2%) 0,4 1,9 2,2 2,3 0%)
1,3 Xylose (2%)
1,4
4,5
3,4
6,3
S. phaeochromogenes NRRL B 2119
S. griseoruber
S. olivochromogenes ATCC 21 114
S. olivochromogenes Mutante CPC3
Wie diese Beobachtungen zeigen, produzierten die Stämme mit Ausnahme des mutierten Stammes CPC 3-sehr wenig Enzym, wenn sie in den Medien, die keine Xylose enthielten, kultiviert wurden. Demgegenüber produzierte die Mutante in Abwesenheit von Xylose reichliche Mengen Enzym und ebenfalls größere Mengen in Gegenwart von Xylose.
50
Kennzeichnung der Mikroorganismen
Um die Mikroorganismen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, im Detail zu kennzeichnen, werden die folgenden Einzelheiten mitgeteilt Dabei erfolgt die Beschreibung der Eigenschaften in einer Form, die ähnlich ist der Beschreibung der Gattung Streptomyces der Actinomycetales in Berge^s »Manual of Determinative Microbiology«, 7. Auflage. ω
Die erste Beschreibung bezieht sich auf den Ausgangsstamm, von dem die Mutanten abstammea Die weiteren Beschreibungen betreffen zwei mutierte Stämme, CPC 3 (Hinterlegungs-Nr. ATCC 21 713) und CPC 15 (Hinterlegungs-Nr. ATCC 21 715), die bevorzugt für die Verwendung im Rahmen der Erfindung geeignet sind. Stamm CPC 15 stellt eine Einzelkolonie dar, die aus Stamm CPC 3 isoliert wurde.
Streptomyces olivochromogenes ATCC 21114
(Ausgangsstamm)
Luftmycel:
Fäden mit mittleren bis geschlossenen Spiralen.
Conidien ellipsoidisch bis sphärisch.
Gelatine-Stichkultur:
Gutes Wachstum. Verflüssigung innerhalb von 10
Tagen.
Agar:
Runzeliges, bräunliches bis graues Wachstum.
Bildung von braunem bis braun-schwarzem löslichem Pigment
Synthetischer Agar:
Weißes Luft- und Oberflächenmycei. Keine Pigmentbildung.
Stärkeagar:
Reichliches Wachstum in gelber Farbe. Stärke wird
hydrolysiert
Glucoseagar:
Reichliches Wachstum in bräunlicher bis grauer bis
dunkelgrauer Farbe.
Lackmusmilch:
Dunkelbrauner Ring; schnelle Ausflockung.
Kartoffelscheiben:
Reichliches Wachstum in weißer Farbe. Bildung
von löslichem braunem bis schwarzem i
Bildet Nitrite aus Nitraten.
Aerob.
Gutes Wachstum bei 28 bis 37° C.
Streptomyces olivöchromogenes, Mutante GPC 3
Luftmycel:
Fäden mit mittleren bis geschlossenen Spiralen. Conidien ellipsoidisch bis sphärisch.
Gelatine-Stichkultur:
Geringes Wachstum in 30 Tagen; anscheinend keine Verflüssigung.
Agar:
Runzeliges, bräunliches bis graues Wachstum. Bildung von braunem bis braun-schwarzem löslichem Pigment.
Synthetischer Agar:
Weißes Luft- und Gberfiächenrriycei. Keine Pigmentbildung.
Stärkeagar:
Kein Wachstum; Stärke wird nicht hydrolysiert.
Glucoseagar:
Reichliches Wachstum in bräunlicher, grauer bis dunkelgrauer Farbe.
Glucosebouillon:
Dünnes braunes Wachstum, flockiges Sediment.
Lackmusmilch:
Dunkelbrauner Ring; Ausflockung bei 37"C1 geringe Ausflockung bei 28° C
Kartoffelscheiben:
Reichliches Wachstum. Bildung von löslichem braunem bis schwarzem Pigment
Bildet Nitrite aus Nitraten.
Aerob.
Gutes Wachstum bei 28 bis 37°C.
Streptomyces olivöchromogenes, Mutante CPC 15
Luftmycel:
Fäden mit mittleren bis geschlossenen Spiralen. Conidipn ellinsnidiech bis vf'härisch.
Gelatine-Stichkultur:
Geringes Wachstum in 30 Tagen; anscheinend keine Verflüssigung.
Agar:
Runzeliges, bräunliches bis graues Wachstum. Bildung von braunem bis braun-nchwarzem löslichem Pigment
Synthetischer Agar:
Weißes Luft- und Oberflächenmycel. Keine Pigmentbildung.
Stärkeagar:
Reichliches Wachstum; Stärke wird hydrolysiert
Glucoseagar:
Reichliches Wachstum in bräunlicher, grauer bis dunkelgrauer Farbe.
Glucosebouillon:
Dünnes braunes Wachstum, flockiges Sediment
Lackmusmilch:
Dunkelbrauner Ring; Ausflockung bei 37° C, geringe Ausflockung bei 28° C
Kartoffelscheiben:
Reichliches Wachstum. Bildung von löslichem schwarzem Pigment
Bildet Nitrite aus Nitraten.
Aerob.
Gutes Wachstum bei 28 bis 27° Q
Die nachfolgend aufgeführten mutierten Stämme wurden bei der American Type Culture Collection hinterlegt und werden dort auf Grund eines Vertrags zwischen der Collection und der Anmelderin dieses Patentes aufbewahrt (Tabelle S).
Tabelle 8
Hinterlegte Stämme
Multiertcr Kultur-Stamm Nr. Hinterlcgungs. Nr.
CPC3 21713
CPC4 21714
CPC15 21715
Die American Type Culture Collection hat die folgende Anschrift:
American Type Culture Collection 12 301 ParkJawn Drive
Rockville, Maryland 20 8"52
Der Vertrag mit der Cultur Collection sieht vor, daß die Kulturen der Öffentlichkeit ständig zur Verfugung stehen, wenn das Patent erteilt wird. Die Anmelderin des Patents hat zugestimmt, während der Laufdauer des Patents die Kulturen durch lebende Kulturen der gleichen Organismen zu ersetzen, sofern eine der Kulturen während der Lagerung abstirbt
Kennzeichnung des Enzyms
Es wurde eine Bestimmung der Michaelis-Konstanten (Km) für die Umsetzung von Xylose und von Glucose durchgeführt
Es war beabsichtigt, zu zeigen, welche relativen Affinitäten der Enzymzubereitung für diese Substrate vorhanden sind. Bisher sind alle Isomerasen, die untersucht wurden und die Glucose direkt in Fructose umwandeln, Xylose-Isomerasen. Die Bestimmung wurde unter Verwendung beschauter Extrakte der Kulturen durchgeführt
Wie gefunden wurde, war die erhaltene Km nieuriger.
Xylose einwiikie ais
wenn sie auf Glucose einwirkte. Hierdurch wurde sichergestellt daß Xylose das natürliche Substrat der Isomerase, und daß das Enzym eine echte Xylose-Isomerase ist
Die Eigenschaft der Xytose-Isomerase, die von den Mutanten der vorliegenden Erfindung gebildet wird. Glucose als Substrat anzunehmen, ist vermutlich auf die strukturelle Ähnlichkeit der Xylose und Glucose zurückzuführen. Da die Mutanten das Isomerase-Enzym sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Xylose produzieren, wird die Enzymbildung eher konstitutionellbedingt als notwendig in dem Kulturmedium durch Xylose induziert. Wenn das Kulturmedium Xylose enthält, kann die Enzymbildung sowohl konstitutionsbedingt als auch induziert sein.
Die folgenden Bespiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie hierdurch zu beschränken.
Beispiel 1
Enzymproduktion durch den mutierten Stamm CPC 3 Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von Isomerase entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßeii Verfahrens.
Sporen von einer Sehrägknltur des mutierten Stammes CPC 3 wurden anf einen 500 ml-Ertenmever-
kolben Oberimpft, der 100 ml eines sterilen Mediums enthielt, das in Tabelle 9 beschrieben wird.
Das pH des Kulturmediums wurde auf etwa 7,1 mit Natriumhydroxid eingestellt und 30 Minuten bei 121° C sterilisiert. Der Kolben wurde beimpft und dann etwa 60 Stunden bei einer Temperatur von etwa 28°C bebrütet und gleichzeitig auf einer Schüttelmaschine mit 120 Perioden je Minute geschüttelt
Tabelle 9
Zusammensetzung des Mediums für die Impfmasse*)
Bestandliüp
15 D. R-Trockenglucosesirup
Maisquellwasser(55% Feststoffe)
Magnesiumsulfat (MgSO4 · 7 H2O)
Desiiliieriey Wasser auf
*) Das Kunnrmedium ist eine wäßrige Lösung, bei der sich alle Prozentangaben einschließlich des Wassers auf Gewicht beziehen.
Für die zweite Entwicklungsstufe wurde eine Menge von etwa 200 ml eines sterilen Kulturmediums, das die Zusammensetzung entsprechend Tabelle 9 hatte, in je 1000 ml nach Hinton modifizierte Erlenmeyer-Kolben gegeben. Es wurde dann eine Menge von 10 ml dem 500 ml-Erlenmeyerkolben entnommen und auf den Hinton-Kolben übertragen. Der beimpfte Kolben wurde auf einem Gump-Drehshaker bei 224 Perioden je Minute und bei einer Temperatur von etwa 28° C 48 Stunden lang bebrütet
In einer dritten Entwicklungsstufe wurden 4 Liter des in Tabelle 9 beschriebenen Kulturmediums in einen 7l/2-Liter-Tischfermenter eingebracht und etwa 30 Minuten bei etwa 121°C sterilisiert Der Tischfennenter wurde mit Material aus dem 1000 ml-Schüttelkolben beimpft und mit 4,0 Standardlitern Luft je Minute beschickt Der Fenr.enter war einem Rührwerk mit zwei Impellern von je 7,62 cm Durchmesser ausgerüstet Das Rührwerk arbeitete mit einer Geschwindigkeit von 500 Upm. Die Fermentation wurde 48 Stunden bei 28° C durchgeführt
Schließlich wurde ein 40 Liter-Versuchsfermenter mit 30 Litern eines Kulturmediums beschickt das entsprechend Tabelle 10 zusammengesetzt war, und es wurde 30 Minuten bei etwa 121 "C sterilisiert
Fermentation wurde 48 Stunden bei etwa 28° C durchgeführt.
Nach Beendigung der Fermentation wurde in der Fermentationsbrühe die Isomerase-Ak'ivifät bestimmt und zu 10 bis 11 Einheiten/ml ermittelt.
Der Enzym-HerstellungspfoieB wurde dann wiederholt, wobei das Medium in dem 40 Liter-Fermenter in der Weise modifiziert wurde, daß es an Stelle von 15 D. R-Trockenglucosesirup Stärke enthielt Dabei wurde Stärke in der gleichen Menge angewendet wie Trockenglucosesirup. Dieses Nährmedium produzierte
etwas geringere Mengen Enzym, weil der Organismus
Gew.-% Stärke hydrolysieren mußte. Die Endergebnisse zeigten
— hinsichtlich der Verwendung von Stärke an Stelle von Trockenglucosesirup keine Vorteile, soweit es die Enzymproduktion betrifft
Beispiel 2
Enzymproduktion durch den mutierten Stamm CPC 4
Das Verfahren zur Erzeugung von Enzym wurde entsprechend Beispiel 1, wie für die Mutante CPC 3 beschrieben, durchgeführt Es wurde eine vergleichbare Menge Enzym gebildet, und es waren keine Anzeichen dafür vorhanden, daß der Ersatz von Trockenglucosesirup durch Stärke im Nährmedium eine andere Wirkung auf die Enzymerzeugung ausübte als diejenige, daß in dem Nährmedium mit dem Trockenglucosesirup eine größere Menge Enzym produziert wurde, wobei der Peak etwa 8 Stunden eher erreicht wurde. Bei allen 4 Fermentationen lag die Aktivität der Kulturbrühe im Bereich von etwa 10 bis etwa 11 Einheiten/ml.
2,0
3,6
0,05
iöü
Tabelle 10
Zusammensetzung des Kulturmediums
Bestandteile
50
Beispiel 3
Enzymproduktion bei Änderung des Kulturmediums
und anderer Versuchsparameter
Um Kulturbrühen mit Isomerase-Aktivität zu erhalten, wurden weitere Fermentationsversuche durchgeführt
Bei einigen dieser Versuche wurde das Kulturmedium in den 7'/2- und 40-Liter-Stufen modifiziert Für diese Versuchsreihe wurde ein Fermentationsmedium entsprechend der in Tabelle 11 angegebenen Zusammensetzung verwendet
Tabelle 11
Zusammensetzung des Fermentationsmediums B
Gew.-Ψ
Bestandteile
Gew.-%
Maisquellwasser (55% Feststoffe) 3,6
Xylose 1,0
15 D. R-Trockenglucosesirup 2,0
Glycin 0,1
NH4NO3 0,2
MgSO4 · 7 H:O 0,05
Der Versuchsfermenter wurde dann mit Material von dem Tisch-Feirmenter beimpft und bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 kontinuierlich mit 24,0 Standardlitern Luft je Minute beschickt. Der Fermenter war mit einem Rührwerk mit zwei Impellern ausgerüstet, deren Blattdurchmesser 11,43 cm betrug. Das Rührwerk arbeitete mit einer Geschwindigkeit von 485 Upm. -Die Maisquellwasser
Xylose
Glycin
NH4NO3
MgSO4 · 7 H2O
Dextrose
Stärke
4,0
1,0
0,1
0,2
0,05
0,2
2,0
65
Bei verschiedenen Fermentationsversuchen wurde das Medium in der Weise verändert, daß geringe Mengen Zusatzstoffe, wie Maisquellwasser und Trokkenglucosesirup, zusätzlich hinzugefügt wurden.
Bei allen diesen Fermentationen wurden Kul.'urbrü-
hen mit zufriedenstellenden Mengen an Isonerase-Aktivität erhalten, und zwar wurden dabei die beiden mutierten Stämme CPC 3 und CPC 4 verwendet. Kein Stamm benötigte Kobalt im Medium, um die Enzymerzeugung zu vermehren, und beide Stämme produzierten Glucose-Isomerase in wesentlich größeren Mengen als der Ausgangsstamm. Es wurden Enzymaktivitäten in Höhe von 15 Einheiten/ml erreicht, was wesentlich höher ist als die Aktivität, die im allgemeinen bei der Fermentation mit dem Ausgangsstamm zu erhalten ist.
Beispiel 4
Enzymatische Isomerisierung
Um die Wirtcungsweise der Isomerase, die durch die mutierten Stämme produziert wird, hinsichtlich der Umwandlung von Glucose in Fructose zu demonstrieren, wurden verschiedene Konversionen durchgeführt. Die verwendete Enzymzubereitung bestand aus gefrorenen ganzen Zellen entweder der Mutante CPC 3 oder der Mutante CPC 4. Wie sich ergeben hat, bestehen hinsichtlich dieser beiden Enzymzubereitungen keine merklichen Unterschiede.
Es wurden Serien von Konversionen von 95 D E.-Maisstärkehydrolysaten durchgeführt, wobei verschiedene Enzymdosierungen vorgenommen wurden. Die Konversionen wurden bei 700C und bei einem pH von 6.25 durchgeführt. Dem Hydrolysat, wurde Magnesiumsulfat in einer 0.01 m-Menge zugesetzt. Der Trockensubstanzgehalt des Hydrolysats lag bei etwa 600 mg/ml. Während der Isomerisierung wurde das Hydrolysat unter Stickstoffatmosphäre gehalten, und das pH wurde erforderlichenfalls durch Titration aufrechterhalten. In dem Konversionsreaktor wurde das Hydrolysat durch Stäbe gerührt, die durch einen magnetischen Rührmotor angetrieben wurden. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 12 zusammengestellt.
Tabelle 12 % Umwandlung des 95 D E.-Stärkehydroiysats 64-66 88-90
in Ketosiü n, Konvcrsionszsit in Stunden 35,2 38.1
40.4 43,0
16-18 40-44 41,3 42.0
Versuche mit verschiedenen Enzyrnmengen 17.7 30.2 43.4
ohne Kobalt 21,9 35.6 43.2 -
Zusatz 24,7 37.5 45,2 -
menge 26.0 40.1
Einheiten/g 28.1 41.0
33,4 43,2
0.8
1,0
1,2
1,4
1.6
2.0
Tabelle 13
Konversion bei 65 C" ohne Kobalt
pH Zusatzmenge % Umwandlung des 95 D.E.
Einheiten/g Stärkehydrolysais in Ketosen,
Konversionszeit in Stunden
22 43 69 88
6,25 0,7
6,25 1,0
6,50 0,7
6,50 1,0
6,75 0,7
6,75 1,0
16,5 24,1 30,0 36,9
20,3 30,0 36,6 42,1
16,9 25,9 31,9 36,3
23,4 33,3 38,8 42,6
18,9 28,2 33,6 37,2
22,1 30,1 36,0 39,5
Die erhaltenen Ergebnisse lassen erkennen, daß die Anwendung der höheren Konversionstemperatur von 70 C vorteilhafter ist, während die höheren pH-Werte offenbar keine Vorteile bringen.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß sich sehr zufriedenstellende süße Sirup-Erzeugnisse herstellen lassen, wenn die Konversionen bei 70*C. bei einem pH von etwa 6.25 und bei einem Trockensubstanzgeh alt der Hydrolysate irr Bereich >/on etwa 600 mg/ml bis 800 mg/ml mit einer Enzymmen,ge von etwa 1,2 bis 1.4 Einheiten je Gramm bei einer Reaktionszeit von 40 bis 48 Stunden und in Gegenwart von etwa 0.01 m
so Magnesiumsulfat bei Abwesenheit von Kobalt unter Einleiten von Stickstoff durchgeführt werden. Es werden Zusammensetzungen der in Tabelle 14 angegebenen Art erhallen:
r. Tabelle 14
Süße Sirup-Erzeugnisse
Bestandteile
Gew.-°/o. bezogen
auf Trockensubstanz
Fructose
Glucose
Höhere Saccharide
40-44
45-50
7- 8
Wie aus diesen Daten zu ersehen ist. reicht eine Enzymmenge von 1,0 Einheilen je Gramm aus, um ohne Kobalt in 66 Stunden soviel Fructose zu bilden, wie es 40% Ketosen entspricht, und eine Enzymmenge von 1.4 Einheiten je Gramm ist ausreichend, um in 42 Stunden Konversionszeit 40% Ketosen zu erzeugen.
Weitere erfolgreiche Konversionsversuche wurden bei 65°C durchgeführt und bei etwas höheren pH-Werten. Über die· Ergebnisse berichtet Tabelle 13.
V/ie diese Daten zeigen, läßt sich ein Sirup mit 40% Fructose in wirtschaftlicher Weise aus einem 95 D. E.-Stärkehydrolysat hen.tellen. wenn man Enzymzu bereitungen verwendet, die sich von den erfindungsgemäßen Mutanten ableiten, ohne daß dabei Kobalt
in zugesetzt werden muß.
Die Enzymzubercitung. welche von den mutierten Stämmen von Mikroorganismen erzeugt wird, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, kann im wesentlichen in jeder gewünschten
γ, form vorliegen. Gute Isomerisierungsergebnisse wurden beobachtet, wenn mit Alkohol entwässerte Zellen in einer Menge von etwa IJ Aktivitälseinheiten je Gramm Trockensubstanz für die Durchführung der Konversion verwendet wurden Wenn beispielsweise ein 30° Be-Maisstärkehvdrolysat mit 95 D. E. mit einer Enzymmenge von 1,3 Aktivitätseinheiten je Gramm Trockensubstanz bei 7O0C unter Verwendung von mit Alkohol dehydralisieften Zellen 46 Stunden bei pH 6,25 konvertiert wurde, konnte in 37 Stunden ein Fructösegehalt von 40% erreicht werden, und am Ende der Konversionszeit betrug der Fructosegehalt etwa 41%. Das erhaltene süße Siruperzeugnis ließ sich leicht filtrieren und gut raffinieren.
9Ö9 647/t61
Auch andere Formen von Enzymzubereitungen können wirksam eingesetzt werden. Eine bevorzugte Form von Enzymzubereitung ist die Kulturbrühe, die auf kontinuierlichem Wege während der kontinuierlichen Konversion aus einem Fermenter abgezogen wird. Auf diese Weise läßt sich eine sehr wirtschaftliche Produktion technisch durchführen.
Die erfmdungsgemäß erhaltenen Enzymzubereitungen werden im allgemeinen dafür verwendet, um Glucose bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis etwa 7 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 60 bis etwa 700C zu isomerisieren. Sie üben aber auch außerhalb dieser Bereiche eine wirksame isomerisierende Wirkung aus.

Claims (6)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung durch Züchten eines Streptomyces-Mikroorganismus in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man eini; künstlich hergestellte Streptomyces-Mutante einsetzt, die bei der Züchtung in einem von Xylose und Xylose-lieferndem Material und von Koblatzusaut freiem Medium unter identischen Züchtungsbedingungen mindestens 50% mehr Xyloseisomeraseaktivität als Streptomyces oüvochrornogenes ATCC 21 114 bildet.
Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante mit den im Anspruch 1 angegebenen Fähigkeiten eine Mutante von St. olivochromogenes einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Mutante von St. olivochromogenes St. olivochromogenes AICC 21713,
ATCC 21 714 oder- ATCC 21 715 einsetzt.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährmedium für die Züchtung der Mutanten ein Xylose· und/oder Cobalt enthaltendes Nährmedium einsetzt.
5. Verwendung der nach den Ansprüchen 1 bis 4 hergestellten Xyloseisomerase-Enzymzubereitungen zum Isomerisieren von Dextrose zu Laevulose in einer Dextrose enthaltenden Lösung.
6. Xyloseisomerase-Enzymzubereitung, die durch Züchten eines Streptomyces-Mikroorganismus in ■Hnem Nährmedium erhältlich ist. dadurch gekennzeichnet, daß sie unter Verwendung einer künstlich hergestellten Streptomyces-Mutante. die bei der Züchtung in einem von Xylose und Xylose-lieferndem Material und von Kobaltzusatz freiem Medium unter identischen Züchtungsbedingungen mindestens 50% mehr Xyloseisomeraseaktivität als Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 114 bildet, erhalten worden ist.
io
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