DE2245402B2 - Xyloseisomerase-Enzymzubereitung, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung derselben - Google Patents
Xyloseisomerase-Enzymzubereitung, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung derselbenInfo
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Description
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Die Erfindung betrifft eine Xyloseisomerase-Enzymzubereitung,
ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Xyloisomerase-Enzymzubereitung durch
Züchten eines Streptomyces-Mikroorganismus in einem Nährmedium, die für die Isomerisierung von Glucose
(Dextrose) zu Fructose (Laevulose) geeignet ist, und sie betrifft ferner die Verwendung der Xyloseisomerase-Enzymzubereitung
zum Isomerisieren von Dextrose zu Laevulose in einer Dextrose enthaltenden Lösung.
Die Herstellung von Glucosesirup und Trockenglucosesirup durch Hydrolyse von Stärke hat sich in Richtung
zu immer süßeren Erzeugnissen weiterentwickelt. Die Säurehydrolysate, welche die ersten Handelsprodukte
darstellten, haben den Weg zu qualitativ besseren, unter Verwendung von Verzuckerungsenzymen gewonnenen t>o
Erzeugnissen gewiesen. Die Technik ist soweit fortgeschritten, daß es keine Schwierigkeiten bereitet,
Enzymhydrolysate mit D. E.-Werten von über 95 zu erzeugen.
Zur Steigerung der Süßigkeit wurden Untersuchungen über die Isomerisierung von Stärkehydrolysaten
durchgeführt, um derren Gehalt an Fructose zu erhöhen. Die in Her US-PS 23 54 664 beschriebene alkalische
Katalyse vermochte diesbezüglich nicht zu befriedigen,
und erst seit Entdeckung der Xyloseisomerase (vgl. z. B. Science, 1957, Vol. 125, No. 3249, S. 648 - 649 und US-PS
29 50 228) sind Fortschritte zu verzeichnen.
Über die Verwendung eines Mikroorganismus der Actinomycetales-Arten zur Gewinnung einer derartigen
Isomerase wurde von Sato und Tsumura berichtet, und die von Takasaki und Mitarbeitern
unternommenen Arbeiten unter Verwendung von Streptomyces-Mikroorganismen werden z. B. in »Fermentation
Advances«, Academic Press-Verlag, New York 1969, S. 561 beschrieben.
Die bekannte Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces zur Gewinnung von Xyloseisomerase
erfolgt unter Einsatz von xylose- und -kobalthaltigen Nährmedien, wie dies z. B. in Agr. Biol. Chem., Bd.
30,1966, S. 1247-1253 beschrieben wird, wonach neben
Xylose auch Xylan eine mit Erfolg verwendbare Kohlenstoffquelle darstellt
Xylose und Xylose-Iieferndes Material wurden auch bereits zur Durchführung der aus den DE-OS 20 18 058
und 19 34 461 bekannten Verfahren zur Xyloseisomerase-Gewinnung eingesetzt, wobei neben Streptomyces-Stämmen
auch deren natürliche oder künstliche Mutanten herangezogen wurden und ein Cobalt-Zusatz
erfolgte.
Nachteilig ist jedoch, daß Xylose und das Xylose-liefernde
Xylan vergleichsweise teuer sind, und daß der sich als notwendig erweisende Zusatz von Cobalt
zusätzliche Probleme bezüglich Abwasserreinigung und Umweltverschmutzung schafft.
Aufgabe der Erfindung ist es. Mittel und Wege anzugeben für eine auch in technischem Maßstab
besonders wirtschaftlich durchführbare Isomerisierung von Dextrose zu Laevulose durch Schaffung einer
Xyloseisomerase-Enzymzubereitung, die nicht an die Verwendung von Xylose und Cobalt gebunden ist.
Die Lösung dieser Aufgabe gelingt mit Hilfe einer Streptomyces-Mutante bestimmten Typs.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung durch Züchten
eines Streptomyces-Mikroorganismus in einem Nährmedium ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine
künstlich hergestellte Streptomyces-Mutante einsetzt, die bei der Züchtung in einem von Xylose und
Xylose-lieferndem Material und von Cobaltzusatz freiem Medium unter identischen Züchtungsbedingungen
mindestens 50% mehr Xyloseisomeraseaktivität als Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 114 bildet.
Die erfindungsgemäße Xyloseisomerase-Enzymzubereitung, die durch Züchten eines Streptomyces-Mikroorganismus
in einem Nährmedium erhältlich ist, ist dadurch gekennzeichnet, daß sie unter Verwendung
einer künstlich hergestellten Streptomyces-Mutante, die bei der Züchtung in einem von Xylose und Xyloselieferndem
Material und von Cobaltzusatz freiem Medium unter identischen Züchtungsbedingungen mindestens
50% mehr Xyloseisomeraseaktivität als Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 114 bildet, erhalten
worden ist.
Durch die Erfindung wird erreicht, daß eine in sehr einfacher und wirtschaftlicher Weise durchzuführende
Isomerisierung von Dextrose in Laevulose z. B. bei pH
6,25 und 60 bis 70°C innerhalb von 40 bis 48 Stunden ohne Zusatz von Cobalt und ggf. auch ohne Verwendung
von Xylose und/oder Xylose-Iiefernden Materialien bei der Herstellung des Enzyms möglich ist, was
insofern überraschend ist. als sich bisher der Cobaltzu-
satz für die Stabilisierung von Xyloseisomerase als unerläßlich erwies, um bei vergleichsweise niedrigen
pH-Werten, hohen Temperaturen und langen Reaktionszeiten eine rasche Inaktivierung des Enzyms zu
vermeiden.
Die wichtigsten der hier und im folgenden gebrauchten Begriffe sind wie folgt definiert:
D. E-Wert
Der Begriff »D. EL« ist eine Abkürzung für »Dextrose- ι ο
Äquivalent«. Er wird für den Gehalt an reduzierenden Zuckern, berechnet als D-Glucose und bezogen auf
Trockensubstanz, verwendet
Stärkehydrolysat
Der Begriff »Stärkehydrolysat« wird allgemein für einen Sirup oder ein Trockenprodukt verwendet, die
durch Hydrolyse von Stärke gewonnen werden. Derartige Produkte können durch Hydrolyse von
Stärke mit Säuren oder Enzymen oder durch eine 21) Kombination der Säure- und Enzymhydrolyse erhalten
werden. Ein bevorzugter Typ von Stärkehydrolysat für die Isomerisierung entsprechend der vorliegenden
Erfindung wird durch Vorverzuckerung mit Säure oder Enzym bis zu einem D. E.-Wert von 10 oder weniger und
nachfolgende Verzuckerung mit Enzymen bis zu D. E.-Werten über 95, vorzugsweise über 97 hergestellt.
Glucose und Dextrose
Stärkehydrolysate mit mittleren D. E.-Werten werden jo
in der Literatur allgemein als »Glucosesirup« bezeichnet, was sowohl für Stärkehydrolysate in Sirup- als auch
in Trockenform gilt. Die Bezeichnung »Dextrose« ist reserviert für das reine kristallisierte Monosaccharid
D-Glucose, das aus Stärkehydrolysaten mit hohem j-> D. E.-Wert gewonnen wird. D-Glucose ist auch Bestandteil
von Glucosesirup und Trockenglucosesirup mit hohem und mittleren D. E.-Werten. In den nachfolgenden
Ausführungen wird der Begriff »Dextrose« für das reine kristallisierte Monosaccharid D-Glucose und der 4»
Begriff »Glucose« als Bestandteil D-Glucose von Stärkehydrolysaten in Sirup- und Trockenform verwendet.
Fructose und Laevulose
4r:
DieBegriffe»Fructose«und»Laevulose«werdeninder
Literatur im allgemeinen synonym angewendet und beziehen sich auf das Isomere der D-Glucose, das süßer
als Dextrose ist. Das Isomere kommt im Honig und im Invertzucker zusammen mit D-Glucose vor, es ist
wertvoll wegen seiner großen Süßigkeit. Entsprechend dem Betriff »Dextrose« sollte auch der Begriff
»Laevulose« für das reine kristallisierte Monosaccharid D-Fructose reserviert bleiben. In den nachfolgenden
Ausführungen wird deshalb die Bezeichnung »Fructose« für den Gehalt an D-Fructose in isomerisierten
Stärkehydrolysaten angewendet.
Das verwendete Enzym
Das Enzym, welches D-Glucose zu D-Fructose t,o
isomerisiert, ist in der Literatur mit verschiedenen Namen bezeichnet worden. In der angegebenen US-PS
29 50 228 ist es als Xylose-Isomerase benannt worden, weil es Xylose zu Xylulose isomerisiert. Es hat aber auch
die Eigenschaft, D-Glucose zu D-Fructose zu isomeri- b5
sieren. Aus diesem Grunde ist es in der Literatur auch als Dextrose-Isomerase und Glucose-Isomerase bezeichnet
worden. In den folgenden Ausführungen wird aus Gründen der historischen Entwicklung die Bezeichnung
»Xylose-Isomerase« verwendet werden.
Enzym-Zubereitung
Die Bezeichnung »Enzym-Zubereitung« wird für jede stoffliche Zusammensetzung verwendet, die sich durch
die gewünschte Aktivität an Xylose-Isomerase auszeichnet Es kann sich dabei beispielsweise um lebende
Zellen, um getrocknete Zellen, um Zellextrakte und um raffinierte konzentrierte Zubereitungen aus den Zellen
handeln. Enzym-Zubereitungen können sowohl in trockener als auch in flüssiger Form vorliegen.
Einheiten
Alle Teil- und Gewichtsangaben in den folgenden Ausführungen geben Gewichtsprozente an, sofern nicht
etwas anderes gesagt wird.
Isomerase- Einheiten
Eine Isomerase-Einheit wird als die Menge Enzymaktivität
definiert, die erforderlich ist, um I Mikromol Fructose je Minute unter den nachfolgend unter der
Überschrift »Bestimmung der Isomerase-Aktivität« beschriebenen Isomerisierungsbedingungen zu erzeugen.
Streptomyces
Diese Bezeichnung wird für eine Gattung von Mikroorganismen der Actinomycetales-Arten gebraucht.
Bei diesen Mikroorganismen handelt es sich um aerobe mycelbildende Actinomyceten. Die Gattung ist
gut definiert. Einige ihrer wichtigen unterscheidenden Eigenschaften werden in dem Buch »The Actinomycetes«
von Selman A. W a k s m a n, Verlag The Ronald Press Company, New York 1967, S. 135 u. ff. beschrieben.
Bevorzugte Mikroorganismen sind mutierte Stämme von Streptomyces olivochomogenes, insbesondere S.
olivochromogenes ATCC Nos. 21 713, 21 714, 21 715. Diese Mikroorganismen haben die erforderlichen
funktioneilen Eigenschaften, beachtliche Mengen Xylose-Isomerase zu erzeugen, wenn sie in einem Nährmedium
kultiviert werden, das frei von Xylose und xyloselieferndem Material und frei von zugesetztem
Kobalt ist. Obwohl diese spezifischen Mikroorganismen bevorzugt werden, wird angenommen, daß sich jeder
Mikroorganismus der Gattung Streptomyces mutieren läßt, um einen Stamm mit den gewünschten Eigenschaften
gemäß der Erfindungsdefinition gemäß Anspruch 1 zu erhalten.
Obwohl es in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung möglich ist, geeignete Enzymzubereitungen
in technischem Maßstab durch Kultivierung von ausgewählten Mikroorganimsen in einem Nährmedium,
das frei von Xylose und xyloselieferndem Material und im wesentlichen frei von Kobalt ist, herzustellen,
werden im allgemeinen bessere und wirtschaftlichere Ergebnisse erhalten, wenn Xylose, Kobalt oder beides in
dem Nährmedium, in dem der Mikroorganismus kultiviert wird, vorhanden sind.
Herstellung der mutierten Stämme
Es wurde eine Probe von S. olivochromogenes ATCC 21 114 ausgewählt, weil er als gute Quelle für
Xylose-Isomerase bekannt war.
Dieser Mikroorganismus wurde im Sporenzustand mit einer Dosis ultravioletten Lichts bestrahlt, die
ausreichend war. um 97% der bestrahlten Mikroorffa-
nismen abzutöten. Die bestrahlten Sporen wurden auf einer Platte ausgestrichen, und jede Kolonie wurde
hinsichtlich ihrer Enzymaktivität geprüft Da das Medium, auf dem die Kolonien gewachsen waren, keine
Xylose enthielt, um die Bildung des Isomerase-Enzyms
zu induzieren, zeigte lediglich die Kolonie, die die gewünschten Eigenschaften hatte, eine positive Enzymreaktion.
Diese Kolonie wurde isoliert und eingehend geprüft, um zu zeigen, daß der neue mutierte Stamm
tatsächlich beachtliche Mengen Xylose-Isomerase produzierte, ohne daß er im Nährmedium Xylose als
Induktionsmittel benötigte.
Die Schritte, die im einzelnen bei diesem Verfahren vollführt wurden, waren im einzelnen wie folgt: S.
olivochromogenes ATCC 21 114 wurde auf Difco-Stärke-Agar
mit 2% Agar gezüchtet, bis die Kultur völlig in den Sporenzustand übergegangen war. Diese Sporen
wurden dann gewonnen und in 20 ml einer 0,1 %igen Lösung des oberflächenaktiven Mittels Tween 80
(Handelsname für ein Polyoxyalkylen-Derivat von Sorbitanoleat, Hersteller Atlas Powder Co.) suspendiert.
Dann wurde 0,1% eines Dispersionsmittels, Marasperse C (Handelsname für ein Ligninsulfonsäure-Dispersionsmittel,
Hersteller Marathon Paper Mills Co.), zugesetzt, und die Suspension wurde mit zwei Stößen von 15
Sekunden beschallt, um Ketten und Klumpen der Sporen zu zerteilen. Die erhaltene Sporensuspension
wurde untersucht und erwies sich als relativ frei von Sporenketten.
Die Sporensuspension wurde in einer flachen Schale unter Rühren den Strahlen einer ultravioletten Lichtquelle,
einer Westinghouse Sterilamp 782H-10 ausgesetzt, und zwar in einem Abstand von 10,16 cm für etwa
8 Minuten. Durch die Bestrahlung wurden 97% der Sporen abgetötet. Die Suspension wurde dann verdünnt,
und bei einer geeigneten Verdünnung, die etwa 100 Kolonien je Platte ergab, auf Petrischalen
übertragen, die das folgende Medium enthielten:
Tabelle 1
Agar-Medium
Agar-Medium
15 D. E.-Trockenglucosesirup 1,0%
Difco-Hefeextrakt 0,05%
Difco-Bactopepton 0,05%
Difco-Bactotrypton 0,05%
Agar 1,5%
pH auf 7,5 mit NaOH
pH auf 7,5 mit NaOH
Je Platte wuchsen etwa 40 bis 80 Kolonien, die daraufhin isoliert wurden. Die isolierten Kolonien
wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Xylose zu isomerisieren, geprüft, nach dem sie auf einem Medium
gewachsen waren, das weder Xylose noch ein xyloselieferndes Material enthielt.
Isolierung und Fermentation mit der Mutante
Es wurde eine Kolonie isoliert, welche während des Wachstums in Abwesenheit von Xylose Isomerase-Aktivität
produzierte. Die erzeugte Isomerase-Aktivität wurde zu 0,155 Einheiten je ml ermittelt. Nach einer
zweiten Übertragung war die Aktivität auf 0,6 Einheiten/ml angestiegen.
Die Kultur wurde dann mehrmals übertragen und zur erneuten Isolierung ausgestrichen. Elf Kolonien wurden
ausgewählt, auf Schrägplatten wachsen gelassen und dann über zwei Impfstufen wachsen gelassen. Die elf
Kolonien wurden dann dazu verwendet, um zwei Kulturmedien, die weiter unten näher definiert und als
Medium A und Medium B bezeichnet werde, damit zu beimpfen. Vergleichsweise wurde auch ein Impfmaterial
von der Stammkultur S. olivochromogenes ATCC 21 114 dafür verwendet, um damit die gleichen beiden
Kulturmedien zu beimpfen.
Das angewandte Verfahren und die Beobachtungen, die dabei gemacht wurden, werden nachfolgend im
einzelnen beschrieben.
Das für die beiden Impfstufen verwendete Medium
Das für die beiden Impfstufen verwendete Medium
ι ο hatte die in Tabelle 2 angegebene Zusammensetzung:
Medium für die erste und zweite Impfstufe 15 D. E.-Trockenglucosesirup 1,0%
Maisquellwasser (55% Feststoffe) 3,6%
MgSO4 ■ 7 H2O 0,05%
CoCl2 · 6 H2O 0,024%
pH auf 7,0 mit NaOH, 1 Tropfen Antischaummittel je Kolben
Die erste Impfstufe wurde zwei Tage lang mit 100 ml des Mediums in jedem der erforderlichen Anzahl an
500 ml-Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, wobei eine
gelegentlich schüttelnde Apparatur bei 28°C verwendet wurde. Es wurden Sporen von jeder einzelnen
Schrägplatte dazu verwendet, um jeden dieser Kolben anzuimpfen.
Die zweite Impfstufe wurde dann einen Tag lang mit 200 ml des Mediums in jedem der erforderlichen Anzahl
an 1000 ml-Hinton-Kolben durchgeführt, wobei ein Gump-Drehshaker bei 28°C verwendet wurde. Mengen
von 10 ml der ersten Impfstufe wurden zum Beimpfen der Kolben der zweiten Impfstufe verwendet.
Je 5 ml des Materials von den zweiten Impfstufen wurden dann zum Beimpfen von Kulturmedien der
folgenden Zusammensetzung verwendet (Tabelle 3):
Kulturmedien A und B
Medium A
Medium A
15 D. E.-Trockenglucosesirup 2,0%
Maisquellwasser (55% Feststoffe) 3,6%
NH4NO3 0,2%
Glycin 0,3%
MgSO4 · 7 H2O 0.05%
CoCI2 ■ 6 H2O 0,024%
pH auf 7,0 mit NaOH
Medium B
Xylose 2,2%
15 D. E.-Trockenglucosesirup 1,2%
Maisquellwasser (55% Feststoffe) 3,6%
NH4NO3 0,2%
Glycin 0,2%
MgSO4 · 7 H2O 0,05%
CoCl2 · 6 H2O 0,024%
pH auf 7,0 mit NaOH
Für die Fermentation wurden je 100 ml des jeweiligen
Kulturmediums in jeden der erforderlichen 1-Liter Hinton-Kolben gegeben. In jeden Kolben wurde
1 Tropfen Antischaummittel gegeben. Dann wurden die Kolben sterilisiert und gekühlt. Nach dem Beimpfen
gelangten die Kolben in einen Gump-Drehshaker und wurden 2 Tage lang bei 28°C gehalten.
Isolierung der Enzymzubereitung
Nach der Fermentation wurde der Inhalt jeden Kolbens 15 Minuten lane bei der lOOOOfachen
Dann wurde die und zur Lagerung
Erdbeschleunigung zentrifugiert.
Zellmasse abgetrennt, gewogen
eingefroren.
Zellmasse abgetrennt, gewogen
eingefroren.
Zur Untersuchung oder zur Verwendung wurde die Zellmasse oder eine bestimmte Menge von ihr mit
destilliertem Wasser auf ihr Originalvolumen verdünnt, und die Zeilen wurden erneut suspendiert. Nachdem sie
sich rekonstituiert hatten, wurde die Zellsuspension in der nachfolgend beschriebenen Weise untersucht.
Überführung der Zellsuspension in
löslichen Zustand
löslichen Zustand
Um das Enzym für die Untersuchung brauchbar zu machen, ist es zunächst erforderlich, es in löslichen
Zustand zu überführen. Eine geeignete Methode, um dies zu erreichen, ist die Beschallung.
Zellen von bekanntem Volumen der Kulturbrühe werden erneut suspendiert in 0,05molarer Phosphatpufferlösung
(pH 7,5). Die Suspension wird dann unter Verwendung eines Branson Sonifiers, Modell 185-D
(20 kc) beschallt, bis die mikrobiologischen Zellen der Probe genügend zerstört sind, um das Isomerase-Enzym
im wesentlichen in Freiheit gesetzt ist. Durch Kühlen des Probenrohres in einem Eisbad während der
Beschallung wird ein Überhitzen und eine Inaktivierung des Enzyms vermieden.
Die erhaltene Enzymzubereitung war eine Lösung von in Lösung gebrachter Xylose-isomerase.
Prüfung üer Isomerase-Aktivität
Das Prüfungsverfahren beruhte auf einer spektrophotometrischen
Bestimmung der Ketosen, die aus einer Glucoselösung unter standardisierten Bedingungen
gebildet wurden.
Es wurde eine Stammlösung folgender Zusammensetzung angesetzt (Tabelle 4).
Zunächst wurde die Enzymzubereitung, die untersucht werden sollte, soweit verdünnt, daß sie 1 bis 6
Isomerase-Einheiten je ml enthielt.
Tabelle 5
Versuchsergebnisse
Versuchsergebnisse
Stammlösung für die Prüfung
Bestandteile
Menge
0,1-m-MgSO4 ■ 7 H2O
0,01-IT1-CoCI2 -6H2O
1-rn-Phosphatpuffer, pH 7,5
Dextroseanhydrid
Destilliertes Wasser
0,01-IT1-CoCI2 -6H2O
1-rn-Phosphatpuffer, pH 7,5
Dextroseanhydrid
Destilliertes Wasser
1 ml
I ml
0,5 ml
1,44 g
um auf ein
Gesamtvolumen von 7,5 ml aufzufüllen
I ml
0,5 ml
1,44 g
um auf ein
Gesamtvolumen von 7,5 ml aufzufüllen
20
Es wurde eine enzymatische Isomerisierung in der Weise durchgeführt, daß 1 ml der Enzymzubereitung zu
3 ml der Stammlösung hinzugefügt wurde. Dann wurde 30 Minuten bei 60cC inkubiert. Bei Beendigung der
Inkubatinszeit, wurde 1 ml durch 9 ml einer 0,5-n-Perchlorsäure inaktiviert. Die aliquote inaktivierte Menge
wurde dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Als Kontrolle wurde für Vergleichszwecke
auch eine reine Glucoselösung untersucht, wobei zu Beginn der Inkubationszeit anstelle der Enzymzubereitung
1 ml Wasser zugesetzt wurde.
Dann wurde der Gehalt an Ketosen nach einer Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Bei der
Auswertung der Ergebnisse wurde eine Isomerase-Einheit als die Menge Enzym-Aktivität definiert, die
erforderlich ist, um unter den beschriebenen Isomerisierungsbedingungen ein Mikromol Fructose je Minute zu
erzeugen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt worden.
Für die weitere Untersuchung wurden die Mutanten-Stämme CPC 3 (Hinterlegungs-Nr. ATCC 21713),
CPC 4 (Hinterlegungs-Nr. ATCC 21 714) und CPC 8 ausgewählt. Eine Woche nachdem die erwähnten
Ergebnisse vorlagen (Tabelle 5), wurde jede dieser 3 Mutanten dazu verwendet, um erneut die beiden
Kulturmedien zu beimpfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt worden.
Kultur
Medium A (ohne Xylose) Medium B (mit Xylose)
Isomerase- Trocken- Isomerase- Trocken-
Aktivität zellgewicht Aktivität zellgewicht
(E/ml) (g/Liter) (E/ml) (g/Liter)
Ausgangsstamm
Ausgangsstamm
Ausgangsstamm
Mutante CPC3
Mutante CPC4
Mutante CPC6
Mutante CPC7
Mutante CPC8
Mutante CPC9
Mutante CPClO
Mutante CPCl 1
Mutante CPC12
Mutante CPCl 3
Mutante CPC14
Mutante CPC4
Mutante CPC6
Mutante CPC7
Mutante CPC8
Mutante CPC9
Mutante CPClO
Mutante CPCl 1
Mutante CPC12
Mutante CPCl 3
Mutante CPC14
| 0,24 | 6,45 | 7,46 | 8,75 |
| 0,04 | 6,56 | 6,63 | 9,32 |
| 5,48 | 6,87 | 2,73 | 8,81 |
| 2,06 | 6,44 | 5,51 | 5,82 |
| 3,02 | 5,87 | 3,72 | 5,39 |
| 1,45 | 6,66 | 3,00 | 9,58 |
| 3,11 | 6,45 | 5,37 | 8,08 |
| 1,95 | 6,52 | 3,54 | 6,93 |
| 2,14 | 6,72 | 2,70 | 7,17 |
| 1,58 | 6,33 | 3,46 | 5,99 |
| 2,88 | 7,27 | 5,50 | 8,08 |
| 2,05 | 7,33 | 2,16 | 10,27 |
| 2,37 | 7,17 | 6,05 | 7,14 |
Versuchsergebnisse nach nochmaligem Beimpfen
Kultur
Medium A (ohne Xylose) Medium B (mit Xylose)
Isomerase- Trocken- Isomerase- Trocken-
Aktivitat zellgewicht Aktivität zellgewicht
(E/ml) (g/Liter) (E/ml) (g/Liter)
Mutante CPC3
Mutante CPC4
Mutante CPC8
Mutante CPC4
Mutante CPC8
Diese Untersuchungsergebnisse bestätigten, daß die Mutanten die Fähigkeit hatten. Xylose-Isomerase zu
produzieren, ohne daß als Bestandteil des Nährmediums Xylose erforderlich war. Wie außerdem beobachtet
wurde, produzierten einige Kulturen deutlich mehr Enzym als der Ausgangsstamm, wenn sie in einem
xylosehaltigen Kulturmedium zum Wachsen gebracht wurden. Diese Eigenschaft ist für die technische
Herstellung äußerst wichtig, weil größere Produktivität bedeutet, daß weniger Fermenter-Kapazität für eine
bestimmte Menge Enzymproduktion erforderlich ist.
| 480 | 5,39 | 11,42 | 7,53 |
| 5,70 | 6,44 | 9,68 | 7,30 |
| 2,97 | 6,10 | 4,43 | 6,39 |
Wirkung der Kohlenhydratquelle im Kulturmedium
Um die Wirkung der Kohlenhydratquelle im Kulturmedium zu zeigen und gleichzeitig die Fähigkeit des
mutierten Stammes CPC 3, Enzym zu produzieren, wenn er in Gegenwart verschiedener Kohlenhydrate als
einziger Kohlenstoffquelle kultiviert wird, zu demonstrieren, wurden verschiedene ausgewählte Stämme von
Streptomyces kultiviert. Das Kulturmedium war in jedem Fall identisch, mit Ausnahme des Kohlenhydrats.
Alle übrigen Bedingungen wurden konstant gehalten. Über die Ergebnisse wird in Tabelle 7 berichtet.
Wirkung der Art des Kohlenhydrats auf die Isomeraseproduktion mit Streptomyces-Kulturen
Organismus
S. phaeochromogenes NRRL B 2119
S. griseoruber
S. griseoruber
S. olivochromogenes ATCC 21114
S. olivochromogenes Mutante CPC3
S. olivochromogenes Mutante CPC3
Wie diese Beobachtungen zeigen, produzierten die Stämme mit Ausnahme des mutierten Stammes CPC 3
sehr wenig Enzym, wenn sie in den Medien, die keine Xylose enthielten, kultiviert wurden. Demgegenüber
produzierte die Mutante in Abwesenheit von Xylose reichliche Mengen Enzym und ebenfalls größere
Mengen in Gegenwart von Xylose.
Kennzeichnung der Mikroorganismen
| Glycerin | Mannose | Glucose | 15D.E.- | Glucose-Isomerase-Aktivität (Einheiten/ml) | - | 0,3 | 0,2 | 15D.E.- |
| (2%) | (2%) | (1,5%) | Stärke- | - | - | 0,3 | 0,2 | Stärke- |
| hydrolysat | - | 0,4 | 0,2 | 0,2 | hydrolysat | |||
| (2%) | 0,4 | 1,9 | 2,2 | 2,3 | (1%) | |||
| 1,3 | Xylose (2%) | |||||||
| 1,4 | ||||||||
| 4,5 | ||||||||
| 3,4 | ||||||||
| 6,3 |
45
50
Um die Mikroorganismen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, im Detail
zu kennzeichnen, werden die folgenden Einzelheiten mitgeteilt Dabei erfolgt die Beschreibung der Eigenschaften
in einer Form, die ähnlich ist der Beschreibung der Gattung Streptomyces der Actinomycetales in
Bergey's »Manual of Determinative Microbiology«, 7. Auflage. eo
Die erste Beschreibung bezieht sich auf den Ausgangsstamm, von dem die Mutanten abstammen.
Die weiteren Beschreibungen betreffen zwei mutierte Stämme, CPC 3 (Hinterlegungs-Nr. ATCC 21 713) und
CPC 15 (Hinterlegungs-Nr. ATCC 21 715), die bevorzugt für die Verwendung im Rahmen der Erfindung
geeignet sind. Stamm CPC 15 stellt eine Einzelkolonie
dar. die aus Stamm CPC 3 isoliert wurde.
Streptomyces olivochromogenes ATCC 21114
(Ausgangsstamm)
(Ausgangsstamm)
Luftmycel:
Fäden mit mittleren bis geschlossenen Spiralen.
Conidien ellipsoidisch bis sphärisch.
Gelatine-Stichkultur:
Gelatine-Stichkultur:
Gutes Wachstum. Verflüssigung innerhalb von 10
Tagen.
Agar:
Agar:
Runzeliges, bräunliches bis graues Wachstum.
Bildung von braunem bis braun-schwarzem löslichem Pigment.
Synthetischer Agar:
Synthetischer Agar:
Weißes Luft- und Oberfiächenmycel. Keine Pigmentbildung.
Stärkeagar:
Stärkeagar:
Reichliches Wachstum in gelber Farbe. Stärke wird
hydrolysiert
Glucoseagar:
Glucoseagar:
Reichliches Wachstum in bräunlicher bis grauer bis
dunkelgrauer Farbe.
Lackmusmilch:
Lackmusmilch:
Dunkelbrauner Ring; schnelle Ausflockung.
Kartoffelscheiben:
Kartoffelscheiben:
Reichliches Wachstum in weißer Farbe. Bildung
von löslichem braunem bis schwarzem Pigment
Bildet Nitrite aus Nitraten.
Aerob.
Gutes Wachstum bei 28 bis 37ÜC.
Streptomyces olivochromogenes, Mutante CPC 3
Luftmycel:
Fäden mit mittleren bis geschlossenen Spiralen. Conidien ellipsoidisch bis sphärisch.
Gelatine-Stichkultur:
Geringes Wachstum in 30 Tagen; anscheinend keine Verflüssigung.
Agar:
Runzeliges, bräunliches bis graues Wachstum. Bildung von braunem bis braun-schwarzem löslichem
Pigment.
Synthetischer Agar:
Weißes Luft- und Oberflächenmycel. Keine Pigmentbildung.
Stärkeagar:
Kein Wachstum; Stärke wird nicht hydrolysiert.
Glucoseagar:
Reichliches Wachstum in bräunlicher, grauer bis dunkelgrauer Farbe.
Glucosebouillon:
Dünnes braunes Wachstum, flockiges Sediment.
Lackmusmilch:
Dunkelbrauner Ring; Ausflockung bei 37°C, geringe Ausflockung bei 28° C.
Kartoffelscheiben:
Reichliches Wachstum. Bildung von löslichem braunem bis schwarzem Pigment.
Bildet Nitrite aus Nitraten.
Aerob.
Gutes Wachstum bei 28 bis 37° C.
Streptomyces olivochromogenes, Mutante CPC 15
Luftmycel:
Fäden mit mittleren bis geschlossenen Spiralen. Conidien ellipsoidisch bis sphärisch.
Gelatine-Stichkultur:
Geringes Wachstum in 30 Tagen; anscheinend keine Verflüssigung.
Agar:
Runzeliges, bräunliches bis graues Wachstum. Bildung von braunem bis braun-schwarzem löslichem
Pigment.
Synthetischer Agar:
Weißes Luft- und Oberflächenmycel. Keine Pigmentbildung.
Stärkeagar:
Reichliches Wachstum; Stärke wird hydrolysiert.
Glucoseagar:
Reichliches Wachstum in bräunlicher, grauer bis dunkelgrauer Farbe.
Glucosebouillon:
Dünnes braunes Wachstum, flockiges Sediment
Lackmusmilch:
Dunkelbrauner Ring; Ausflockung bei 37° C, geringe
Ausflockung bei 28° C.
Kartoffelscheiben:
Reichliches Wachstum. Bildung von löslichem schwarzem Pigment
Bildet Nitrite aus Nitraten.
Aerob.
Gutes Wachstum bei 28 bis 27° C
Die nachfolgend aufgeführten mutierten Stämme wurden bei der American Type Culture Collection
hinterlegt und werden dort auf Grund eines Vertrags zwischen der Collection und der Anmelderin dieses
Patentes aufbewahrt (Tabelle 8).
| Tabelle 8 | Kultur- |
| Hinterlegte Stämme | Hinterlegungs. Nr. |
| Multierter | 21 713 |
| Stamm Nr. | 21 714 |
| CPC 3 | 21 715 |
| CPC 4 | |
| CPC 15 | |
Die American Type Culture Collection hat die folgende Anschrift:
American Type Culture Collection 12 301 Parklawn Drive
Rockville, Maryland 20 852
Der Vertrag mit der Cultur Collection sieht vor, daß die Kulturen der Öffentlichkeit ständig zur Verfügung
stehen, wenn das Patent erteilt wird. Die Anmelderin 2ri des Patents hat zugestimmt, während der Laufdauer des
Patents die Kulturen durch lebende Kulturen der gleichen Organismen zu ersetzen, sofern eine der
Kulturen während der Lagerung abstirbt.
Kennzeichnung des Enzyms
Es wurde eine Bestimmung der Michaelis-Konstanten (Km) für die Umsetzung von Xylose und von Glucose
durchgeführt.
Es war beabsichtigt, zu zeigen, welche relativen υ Affinitäten der Enzymzubereitung für diese Substrate
vorhanden sind. Bisher sind alle Isomerasen, die untersucht wurden und die Glucose direkt in Fructose
umwandeln. Xylose-Isomerasen. Die Bestimmung wurde unter Verwendung beschallter Extrakte der Kulturen
durchgeführt.
Wie gefunden wurde, war die erhaltene Km niedriger, wenn die Enzymzubereitung auf Xylose einwirkte als
wenn sie auf Glucose einwirkte. Hierdurch wurde sichergestellt, daß Xylose das natürliche Substrat der
Isomerase, und daß das Enzym eine echte Xylose-Isomerase
ist.
Die Eigenschaft der Xylose-Isomerase, die von den Mutanten der vorliegenden Erfindung gebildet wird,
Glucose als Substrat anzunehmen, ist vermutlich auf die so strukturelle Ähnlichkeit der Xylose und Glucose
zurückzuführen. Da die Mutanten das Isomerase-Enzym sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von
Xylose produzieren, wird die Enzymbildung eher konstitutionellbedingt als notwendig in dem Kulturmedium
durch Xylose induziert Wenn das Kulturmedium Xylose enthält, kann die Enzymbildung sowohl konstitutionsbedingt
als auch induziert sein.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie hierdurch zu beschränken.
Beispiel 1 Enzymproduktion durch den mutierten Stamm CPC 3
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von Isomerase entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Sporen von einer Schrägkultur des mutierten Stammes CPC 3 wurden auf einen 500 ml-Erlenmever-
kolben überimpft, der 100 ml eines sterilen Mediums enthielt, das in Tabelle 9 beschrieben wird.
Das pH des Kulturmediums wurde auf etwa 7,1 mit Natriumhydroxid eingestellt und 30 Minuten bei 121°C
sterilisiert. Der Kolben wurde beimpft und dann etwa 60 Stunden bei einer Temperatur von etwa 28°C bebrütet
und gleichzeitig auf einer Schüttelmaschine mit 120 Perioden je Minute geschüttelt.
Zusammensetzung des Mediums für die Impfmasse*)
Bestandteile
Gew.-%
15 D. E.-Trockenglucosesirup
M aisquell wasser (55% Feststoffe)
Magnesiumsulfat (MgSO4 ■ 7 H2O)
Destilliertes Wasser auf
M aisquell wasser (55% Feststoffe)
Magnesiumsulfat (MgSO4 ■ 7 H2O)
Destilliertes Wasser auf
2,0
3,6
0,05
100
3,6
0,05
100
Zusammensetzung des Kulturmediums
Bestandteile
Gew.-%
Xylose
15 D. R-Trockenglucosesirup
Glycin
NH4NO3
MgSO4 · 7 H2O
3,6
1,0
2,0
0,1
0,2
0,05
JO
*) Das Kulturmedium ist eine wäßrige Lösung, bei der sich alle Prozentangaben einschließlich des Wassers auf Gewicht
beziehen.
Für die zweite Entwicklungsstufe wurde eine Menge von etwa 200 ml eines sterilen Kulturmediums, das die
Zusammensetzung entsprechend Tabelle 9 hatte, in je 1000 ml nach Hinton modifizierte Erlenmeyer-Kolben
gegeben. Es wurde dann eine Menge von 10 ml dem 500 ml-Erlenmeyerkolben entnommen und auf den
Hinton-Kolben übertragen. Der beimpfte Kolben wurde auf einem Gump-Drehshaker bei 224 Perioden je
Minute und bei einer Temperatur von etwa 280C 48 Stunden lang bebrütet.
In einer dritten Entwicklungsstufe wurden 4 Liter des
in Tabelle 9 beschriebenen Kulturmediums in einen 7'/2-Liter-Tischfermenter eingebracht und etwa 30
Minuten bei etwa 121°C sterilisiert. DerTischfermenter
wurde mit Material aus dem 1000 ml-Schüttelkolben
beimpft und mit 4,0 Standardlitern Luft je Minute beschickt. Der Fermenter war einem Rührwerk mit
zwei Impellern von je 7,62 cm Durchmesser ausgerüstet. Das Rührwerk arbeitete mit einer Geschwindigkeit von
500 Upm. Die Fermentation wurde 48 Stunden bei 28° C
durchgeführt.
Schließlich wurde ein 40 Liter-Versuchsfermenter mit
30 Litern eines Kulturmediums beschickt, das entsprechend Tabelle 10 zusammengesetzt war, und es wurde
30 Minuten bei etwa 12ΓC sterilisiert.
Fermentation wurde 48 Stunden bei etwa 28° C durchgeführt.
Nach Beendigung der Fermentation wurde in der Fermentationsbrühe die Isomerase-Aktivität bestimmt
und zu 10 bis 11 Einheiten/ml ermittelt.
Der Enzym-Herstellungsprozeß wurde dann wiederholt, wobei das Medium in dem 40 Liter-Fermenter in
der Weise modifiziert wurde, daß es an Stelle von 15 D. E.-Trockenglucosesirup Stärke enthielt. Dabei wurde
Stärke in der gleichen Menge angewendet wie Trockenglucosesirup. Dieses Nährmedium produzierte
etwas geringere Mengen Enzym, weil der Organismus Stärke hydrolysieren mußte. Die Endergebnisse zeigten
hinsichtlich der Verwendung von Stärke an Stelle von Trockenglucosesirup keine Vorteile, soweit es die
Enzymproduktion betrifft.
Beispiel 2 Enzymproduktion durch den mutierten Stamm CPC 4
Das Verfahren zur Erzeugung von Enzym wurde entsprechend Beispiel 1, wie für die Mutante CPC 3
beschrieben, durchgeführt. Es wurde eine vergleichbare Menge Enzym gebildet, und es waren keine Anzeichen
dafür vorhanden, daß der Ersatz von Trockenglucosesirup durch Stärke im Nährmedium eine andere Wirkung
auf die Enzymerzeugung ausübte als diejenige, daß in dem Nährmedium mit dem Trockenglucosesirup eine
größere Menge Enzym produziert wurde, wobei der Peak etwa 8 Stunden eher erreicht wurde. Bei allen 4
Fermentationen lag die Aktivität der Kulturbrühe im Bereich von etwa 10 bis etwa 11 Einheiten/ml.
Enzymproduktion bei Änderung des Kulturmediums und anderer Versuchsparameter
Um Kulturbrühen mit Isomerase-Aktivität zu erhalten, wurden weitere Fermentationsversuche durchgeführt.
Bei einigen dieser Versuche wurde das Kulturmedium in den 7'/2- und 40-Liter-Stufen modifiziert. Für diese
Versuchsreihe wurde ein Fermentationsmedium entsprechend der in Tabelle 11 angegebenen Zusammensetzung
verwendet
Zusammensetzung des Fermentationsmediums B
Bestandteile
Der Versuchsfermenter wurde dann mit Material von dem Tisch-Fermenter beimpft und bei einem Druck von
1,05 kg/cm2 kontinuierlich mit 24,0 Standardlitern Luft je Minute beschickt. Der Fermemer war mit einem
Rührwerk mit zwei Impellern ausgerüstet, deren Blattdurchmesser 11,43 cm betrug. Das Rührwerk
arbeitete mit einer Geschwindigkeit von 485 Upm. Die Gew.-0,
Xylose
Glycin
NH4NO3
MgSO4 · 7 H2O
Dextrose
Dextrose
Stärke
4,0
1,0
0,1
0,2
0,05
0,2
2,0
Bei verschiedenen Fermentationsversuchen wurde das Medium in der Weise verändert, daß geringe
Mengen Zusatzstoffe, wie Maisquellwasser und Trokkenglucosesirup, zusätzlich hinzugefügt wurden.
hen mit zufriedenstellenden Mengen an Isomerase-Aktivität
erhalten, und zwar wurden dabei die beiden mutierten Stämme CPC 3 rjnd CPC 4 verwendet Kein
Stamm benötigte Kobalt im Medium, um die Enzymerzeugung zu vermehren, und beide Stämme produzierten
Glucose-Isomerase in wesentlich größeren Mengen als der Aüsgangsstamm. Es wurden Enzymaktivitäten in
Höhe von 15 Einheiten/ml erreicht, was wesentlich höher ist als die Aktivität, die im allgemeinen bei der
Fermentation mit dem Ausgangsstamm zu erhalten ist.
Beispiel 4
Enzymatische Isomerisierung
Enzymatische Isomerisierung
Um die Wirkungsweise der Isomerase, die durch die mutierten Stamme produziert wird, hinsichtlich der
Umwandlung von Glucose in Fructose zu demonstrieren, wurden verschiedene Konversionen durchgeführt.
Die verwendete Enzymzubereitung bestand aus gefrorenen ganzen Zellen entweder der Mutante CPC 3 oder
der Mutante CPC 4. Wie sich ergeben hat, bestehen hinsichtlich dieser beiden Enzymzubereitungen keine
merklichen Unterschiede.
Es wurden Serien von Konversionen von 95 D. E.-Maisstärkehydrolysaten durchgeführt, wobei verschiedene
Enzymdosierungen vorgenommen wurden. Die Konversionen wurden bei 700C und bei einem pH
von 6,25 durchgeführt. Dem Hydrolysat wurde Magnesiumsulfat in einer 0,01 m-Menge zugesetzt. Der Trockensubstanzgehalt
des Hydrolysats lag bei etwa 600 mg/ml. Während der Isomerisierung wurde das Hydrolysat
unter Stickstoffatmosphäre gehalten, und das pH wurde erforderlichenfalls durch Titration aufrechterhalten. In
dem Konversionsreaktor wurde das Hydrolysat durch Stäbe gerührt, die durch einen magnetischen Rührmotor
angetrieben wurden. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 12 zusammengestellt.
Versuche mit verschiedenen Enzymmengen
ohne Kobalt
ohne Kobalt
Zusatz- % Umwandlung des 95 D.E.-Stärkehydrolysats
menge in Ketosen, Konversionszeit in Stunden
Einheiten/g
16-18 40-44 64-66 88-90
| 0,8 | 17,7 | 30,2 | 35,2 | 38,1 |
| 1,0 | 21,9 | 35,6 | 40,4 | 43,0 |
| 1,2 | 24,7 | 37,5 | 41,3 | 42,0 |
| 1,4 | 26,0 | 40,1 | 43,4 | - |
| 1,6 | 28,1 | 41,0 | 43,2 | - |
| 2,0 | 33,4 | 43,2 | 45,2 | - |
Konversion bei 65 C ohne Kobalt
Wie aus diesen Daten zu ersehen ist, reicht eine Enzymmenge von 1,0 Einheiten je Gramm aus, um ohne
Kobalt in 66 Stunden soviel Fructose zu bilden, wie es 40% Ketosen entspricht, und eine Enzymmenge von 1,4
Einheiten je Gramm ist ausreichend, um in 42 Stunden Konversionszeit 40% Ketosen zu erzeugen.
Weitere erfolgreiche Konversionsversuche wurden bei 65°C durchgeführt und bei etwas höheren
dH-Werten. Über die Ereebnisse berichtet Tabelle 13.
| pH | Zusatzmenge | % Umwandlung des 95 D.E.- | 43 | : in Stunden | 88 |
| Einheiten/g | Stärkehydrolysats in Ketosen, | 24,1 | 69 | 36,9 | |
| Konversionszeil | 30,0 | 30,0 | 42,1 | ||
| 22 | 25,9 | 36,6 | 36,3 | ||
| 6,25 | 0,7 | 16,5 | 33,3 | 31,9 | 42,6 |
| 6,25 | 1,0 | 20,3 | 28,2 | 38,8 | 37,2 |
| 6,50 | 0,7 | 16,9 | 30,1 | 33,6 | 39,5 |
| 6,50 | 1,0 | 23,4 | 36,0 | ||
| 6,75 | 0,7 | 18,9 | |||
| 6,75 | 1,0 | 22,1 |
Die erhaltenen Ergebnisse lassen erkennen, daß die Anwendung der höheren Konversionstemperatur von
70°C vorteilhafter ist. während die höheren pH-Werte offenbar keine Vorteile bringen.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß sich sehr zufriedenstellende *üße Sirup-Erzeugnisse herstellen
lassen, wenn die Konversionen bei 700C, bei einem pH
2) von etwa 6,25 und bei einem Trockensubstanzgehalt der
Hydrolysate im Bereich von etwa 600 mg/ml bis 800 mg/ml mit einer Enzymmenge von etwa 1,2 bis 1,4
Einheiten je Gramm bei einer Reaktionszeit von 40 bis 48 Stunden und in Gegenwart von etwa 0,01 m
jo Magnesiumsulfat bei Abwesenheit von Kobalt unter
Einleiten von Stickstoff durchgeführt werden. Es werden Zusammensetzungen der in Tabelle 14 angegebenen
Art erhalten:
s-, Tabellen
Süße Sirup-Erzeugnisse
Gew.-%, bezogen
auf Trockensubstanz
| Fructose | 40-44 |
| Glucose | 45-50 |
| Höhere Saccharide | 7- 8 |
Wie diese Daten zeigen, läßt sich ein Sirup mit 40% Fructose in wirtschaftlicher Weise aus einem 95
D. E.-Stärkehydrolysat herstellen, wenn man Enzymzubereitungen verwendet, die sich von den erfindungsgeiTiäßen
Mutanten ableiten, ohne daß dabei Kobalt zugesetzt werden muß.
Die Enzymzubereitung, welche von den mutierten Stämmen von Mikroorganismen erzeugt wird, die im
Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, kann im wesentlichen in jeder gewünschten
Form vorliegen. Gute Isomerisierungsergebnisse wurden beobachtet, wenn mit Alkohol entwässerte Zellen in
einer Menge von etwa 1,3 Aktivitätseinheiten je Gramm Trockensubstanz für die Durchführung der Konversion
verwendet wurden. Wenn beispielsweise ein 30° Be-Maisstärkehydrolysat mit 95 D. E. mit einer Enzymmenge
von 1,3 Aktivitätseinheiten je Gramm Trockensubstanz bei 700C unter Verwendung von mit Alkohol
dehydratisierten Zellen 46 Stunden bei pH 6,25 konvertiert wurde, konnte in 37 Stunden ein Fructosegehalt
von 40% erreicht werden, und am Ende der Konversionszeit betrug der Fructosegehalt etwa 41%.
Das erhaltene süße Siruperzeugnis ließ sich leicht filtrieren und gut raffinieren.
909 513/142
Auch andere Formen von Enzymzubereitungen können wirksam eingesetzt werden. Eine bevorzugte
Form von Enzymzubereitung ist die KulturbrOhe.die auf kontinuierlichem Wege während der kontinuierlichen
Konversion aus einem Fermenter abgezogen wird. Auf diese Weise läßt sich eine sehr wirtschaftliche
Produktion technisch durchführen.
Dio erfindungsgemäß erhaltenen Enzymzubereitungen werden im allgemeinen dafür verwendet, um
Glucose bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis etwa 7 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 60 bis
etwa 700C zu isomerisieren. Sie üben aber auch
außerhalb dieser Bereiche eine wirksame isomerisierende Wirkung aus.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung einer Xyloseisomerase-Enzymzubereitung
durch Züchten eines Streptomyces-Mikroorganismus
in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man eine künstlich hergestellte Streptomyces-Mutante einsetzt,
die bei der Züchtung in einem von Xylose und Xylose-lieferndem Material und von Koblatzusatz
freiem Medium unter identischen Züchtungsbedingungen mindestens 50% mehr Xyloseisomeraseaktivität
als Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 114 bildet
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Mutante mit den im Anspruch 1 angegebenen Fähigkeiten eine Mutante von St
olivochromogenes einsetzt
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante von St. olivochromogenes
St. olivochromogenes ATCC 21 713, — ATCC 21 714 oder - ATCC 21 715 einsetzt.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährmedium für die
Züchtung der Mutanten ein Xylose- und/oder Cobalt enthaltendes Nährmedium einsetzt.
5. Verwendung der nach den Ansprüchen 1 bis 4 hergestellten Xyloseisomerase-Enzymzubereitungen
zum Isomerisieren von Dextrose zu Laevulose in einer Dextrose enthaltenden Lösung.
6. Xyloseisomerase-Enzymzubereitung, die durch Züchten eines Streptomyces-Mikroorganismus in
einem Nährmedium erhältlich ist dadurch gekennzeichnet, daß sie unter Verwendung einer künstlich
hergestellten Strepiomyces-Mutante, die bei der Züchtung in einem von Xylose und Xylose-lieferndem
Material und von Kobaltzusatz freiem Medium unter identischen Züchtungsbedingungen mindestens
50% mehr Xyloseisomeraseaktivität als Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 114 bildet,
erhalten worden ist.
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