DE2351443C2 - - Google Patents

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DE2351443C2
DE2351443C2 DE2351443A DE2351443A DE2351443C2 DE 2351443 C2 DE2351443 C2 DE 2351443C2 DE 2351443 A DE2351443 A DE 2351443A DE 2351443 A DE2351443 A DE 2351443A DE 2351443 C2 DE2351443 C2 DE 2351443C2
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase, die zur Umwandlung von Glucose in Fructose geeignet ist, unter Verwendung von Mikroorga­ nismen.
Fructose wird allgemein als wesentlich süßer eingeschätzt als Glucose. Aber Glucose ist schnell zugänglich aus billigen Quellen. Ein praktisches und wirtschaftliches Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Fructose ist daher wünschenswert. Die Alkali-Isomerierung von Glucose zu Fructose gibt entweder niedrige Ausbeuten oder neigt zur Erzeugung unerwünschter Nebenprodukte in Ausbeuten von mehr als 30%. Eine Alternative zur Verwendung von Alkali ist der Einsatz von Enzymen.
Es gibt mehrere Enzyme, die D-Glucose über eine oder mehrere chemische Zwischenstufen (z. B. D-Glucose-6-phosphat) in D-Fructose überführen. Diese Umsetzungen sind jedoch nicht wirtschaftlich nutzbar.
Erfolgversprechender sind Enzyme, die D-Glucose direkt in D-Fructose umwandeln. Eine Anzahl dieser Enzyme ist aus Mikroorganismen der Gattung Lactobacillus, Pseudomonas, Pasteurella, Leuconostoc, Streptomyces, und Aerobacter hergestellt worden (siehe Zusammenfassung von Yamaka in Biochem. Biophys. Acta 154, 670-680 (1968)). Damit eine bedeutende Menge Glucose-isomerase durch einen der obigen Mikroorganismen gebildet wird, muß jedoch zur Induzierung des Enzyms im Züchtungsmedium Xylose oder Xylan zugegen sein. Reine Xylose ist relativ teuer; wenn Xylan im Züchtungsmedium verwendet wird, muß der Mikroorganismus zusätzlich Enzyme produzieren, die Xylan hydrolysieren können.
Um die Kosten für eine Züchtung des Mikroorganismus in einem Xylose oder Xylan enthaltenden Medium zu vermeiden, sind bereits Anstrengungen unternommen worden, um ein Bakterium zu erhalten, das das Enzym grundsätzlich produziert. Lee, Hayes und Long (US-PS 36 45 848) berichten, daß bestimmte Mikroorganismenstämme der Gattung Arthrobacter zur Erzeugung von Enzymen befähigt sind, welche Glucose oder Xylose direkt in die entsprechende Ketose überführen, wenn sie in einem Medium gezüchtet werden, in dem Xylose oder Xylan fehlt. Dabei werden jedoch nur verhältnismäßig kleine Mengen Glucose-isomerase produziert, und das Züchtungsmedium erfordert verhältnismäßig teure Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt und Fleischprotein. Nach den praktischen Arbeitsbeispielen der US-PS 36 45 848 ist im Kulturmedium sowohl ein Fleischprotein als auch ein Hefeextrakt erforderlich, dennoch reichen die Fructose-Ausbeuten nur bis 46%, und die Glucose-isomerase-Aktivität beträgt maximal nur 0,85 mU/ ml.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase unter Züchten von Mikroorganismen bereitzustellen, die Enzyme zur Umwandlung von Aldosen in Ketosen in hohen Ausbeuten produzieren, ohne daß das Kulturmedium Xylose und/oder Xylan enthalten muß. Mit einem solchen Verfahren ist die Isomerierung von Aldosen, wie Glucose und Xylose, zu den entsprechenden Ketosen wesentlich wirtschaftlicher durch­ führbar.
Die Erfindung schlägt hierzu das Verfahren nach Anspruch 1 mit einer bevorzugten Ausgestaltung nach Anspruch 2 vor. Es wurde gefunden, daß die in Anspruch 1 genannten Mikroorganismen zur Erzeugung von Glucose-isomerase fähig sind, wenn sie in einem Medium auch ohne Xylose oder Xylan gezüchtet werden. Zudem können dabei verhältnismäßig große Mengen an Glucose-isomerase sogar in einem Medium produziert werden, das nur aus Maisquellwasser, Salzen und Leitungswasser besteht.
Das erfindungsgemäß produzierte Enzym zeigt einen hohen Grad an Temperaturstabilität, so daß Temperaturen bis zu 80-85°C bei der Isomerisierung ohne bedeutenden Aktivitätsverlust angewendet werden können. Es können sowohl ganze Zellen als auch zellfreie Extrakte zur Durchführung der Isomerisierung eingesetzt werden.
Die Stämme werden im allgemeinen in einem Medium kultiviert, das Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff (gewöhnlich Maisquellwasser) und anorganische Salze enthält. Die Impfkultur kann hergestellt werden, indem man die Organismen in diesem Medium auf einer Drehschüsselmaschine bei etwa 25-30°C in Gegenwart von Luft 1-2 Tage züchtet. Die Impfkultur, die 3 bis 10% des Endvolumens des Fermenters ausmacht, wird in das sterile, in einem geeigneten Fermenter enthaltene Medium überführt. Das beimpfte Medium wird unter Bewegung bei 16 bis 40°C, vorzugsweise 25-30°C, inkubiert, während ein Luftstrom von ca. 1 Volumen pro Minute 1 bis 7 Tage aufrechterhalten wird. Der Luftstrom kann von 0,3 bis 1,5 Volumina pro Minute reichen. Für maximale Enzymausbeuten sollte das pH der Fermentation zwischen 6,0 und 8,5, vorzugsweise zwischen 6,4 und 7,5 gehalten werden. Eine maximale Isomeraseaktivität wird unter diesen Bedingungen in 3 bis 5 Tagen erreicht. Die ganzen Zellen werden dann gewonnen und als solche verwendet oder das Enzym kann alternativ aus den Zellen unter Anwendung bekannter Techniken extrahiert werden. Die Mikroorganismen selbst sind jedoch nicht Gegenstand der Erfindung.
Aktivitätsspiegel von annähernd 30 Einheiten pro Milliliter Kulturbrühe sind in 3 Tagen erreicht worden. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als jene Enzymmenge, die in 1 Minute bei 75°C 1 Mikromol Fructose aus Glucose in einem Medium aus 1,5 M Glucose, 0,03 M Phosphat-Puffer (pH 7,0) 0,003 M Magnesiumsulfat und 0,0003 M Kobaltsulfat produziert.
Die erfindungsgemäß erhältlichen Isomeraseaktivitätsspiegel variieren je nach dem speziell verwendeten Stamm- und Züchtungsmedium. Aktivitätsspiegel von 50 Einheiten pro ml Kulturbrühe sind im Falle von Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342, kultiviert in Maisquellwasser, gemessen worden.
Beispiel 1 Herstellung von Glucose-isomerase aus Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342, Actinoplanesphilippinensis ATCC 12 427, Streptomyces armeniacus ATCC 15 676 und Actinoplanes sp. ATCC 23 342
Die Mikroorganismen werden jeweils getrennt in Zuchtkulturen auf Schrägen aufbewahrt, welche aus 1,7% Trypton, 0,3% Soyton, 0,25% Glucose und 2,0% Agar zusammengesetzt sind. Die Impfkultur wird durch Überführen der Mikroorganismen von der Zuchtkultur in ein Testrohr hergestellt, das 8 ml sterilisiertes Medium, bestehend aus 1,7% Trypton, 0,3% Soyton, 0,25% K₂HPO₄ und 0,25% Glucose, enthält. Die Impfkultur wird in diesem Testrohr bei 28°C 2-3 Tage unter Schütteln kultiviert. Diese Impfkultur wird dann einem der folgenden Züchtungsmedien eingeimpft, um Glucose-isomerase herzustellen.
Die folgenden Medien wurden mit Leitungswasser auf das Einheitsvolumen aufgefüllt.
Das pH des Kulturmediums wurde auf etwa 7,0 eingestellt. Zucker und andere Nährstoffe wurden getrennt sterilisiert und dann zugemischt.
Medium Nr. 1:
Trypton1,7% Soyton0,3% K₂HOP₄0,25% D-Glucose0,25%
Medium Nr. 3:
Maisquellwasser3% CoSO₄0,1 mM CuSO₄0,05 mM
Die Herstellung des Züchtungsmediums aus Maisquellwasser wird im Beispiel 2 beschrieben.
Das pH der Kultur war in allen Fällen 7,0.
Andere geeignete Medien enthalten lösliche Schlempe, Pepton-Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Sojabohnenhydrolysat und Fischproteinhydrolysat. Auch Gemische der oben beschriebenen Medien können verwendet werden.
Die Züchtung wurde mit der Zugabe von 5 ml der entsprechenden Impfkultur zu 75 ml Trypton-Soyton-Medium bzw. zu 95 ml Maisquellwasser-Medium in einem 250-ml- Erlenmeyer-Kolben begonnen. Die Zellen wurden 96 Stunden bei 28°C unter Schütteln auf einer Schüttelvorrichtung bei 280 Upm inkubiert.
Die Zellen wurden durch 10 min Zentrifugieren von 30 ml Kultur bei 15 000 Upm gesammelt. Die Zellen wurden dann einmal mit Leitungswasser gewaschen und in 14 ml 0,12 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann bei 4°C 4 Minuten mit Ultraschall behandelt und bei 15 000 Upm 15 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde als Rohquelle für die Glucose-isomerase verwendet. Die Aktivität der Glucose-isomerase wurde wie folgt bestimmt: Zu 3,0 ml Lösung aus 2,0 M Glucose, 0,004 M MgSO₄ und 0,0004 M CoSO₄ wurde eine Rohenzymlösung mit 0,12 M Phosphatpuffer (pH 7,0) bis zu einem Endvolumen von 4,0 ml zugegeben. Die Reaktion wurde bei 75°C durchgeführt. Aliquote Teile wurden nach jeweils 10, 15, 20 und 25 Minuten entnommen und mit 0,02 M HCl verdünnt.
Der Fructosegehalt der Proben wurde in einem automatischen Analysator unter Benutzung der Skatol-HCl-Methode bestimmt, die von Pogell beschrieben wird (J. Biol. Chem. 211 : 143 (1954)). Die Farbentwicklung wurde jedoch bei 52°C statt bei 37°C durchgeführt. Die Aktivität der Glucose-isomerase wurde aus der Steigung berechnet und in Einheiten (U) ausgedrückt. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als jene Enzymmenge, welche 1 Mikromol Fructose aus der Glucose in 1 Minute bei 75°C unter den im vorherigen Absatz genannten Bedingungen erzeugt.
Die Herstellung der Glucose-isomerase durch die verschiedenen Mikroorganismen nach Züchtung im Trypton- Soyton-Medium oder in Maisquellwasser ist in Tabelle I wiedergegeben. Die Mikroorganismen produzieren Glucose-isomerase in Abwesenheit von D-Xylose im Züch­ tungsmedium.
Tabelle I
Herstellung von Glucose-isomerase durch Mikroorganismen
Maisquellwasser kann als Züchtungsmedium verwendet werden, um Glucose-isomerase in Abwesenheit von D-Xylose zu produzieren. Die stärkste Produktion an Glucose-isomerase-Aktivität wurde bei dem Stamm Actinoplanes missouriensis NRRL-B3342 beobachtet.
Beispiel 2
Das Verfahren zur Herstellung des Maisquellwassers hat eine gewisse Wirkung auf die Produktion des Enzyms mit Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342. Es wurden verschiedene Methoden zur Neutralisierung des Maisquellwassers untersucht. Nach Neutralisierung auf pH 7,0 mit Alkali wurde das Maisquellwasser filtriert, um den Schlamm zu entfernen, der größtenteils aus Phytaten bestand. Dann wurde nach dem Verfahren von Beispiel 1 unter Zugabe von Kobaltsulfat und Kupfer(II)sulfat in entsprechenden Konzentrationen von 0,1 mM und 0,05 mM gezüchtet.
Die Verwendung von Natriumhydroxid ergibt gegenüber Calciumhydroxid oder Ammoniumhydroxid die beste Enzymproduktion, wie Tabelle II ausweist. Kaliumhydroxid ist ebenfalls gut brauchbar.
NeutralisierungsmittelEnzymproduktion (U/ml Kulturbrühe) Calciumhydroxid17,2 NH₃23,3 NaOH27,8
Die Entfernung des Schlamms nach Neutralisation ist wesentlich, wie man aus Tabelle III ersieht. Maisquellwasser wurde auf ein pH von 7,0 neutralisiert und in einem 1-Liter-Erlenmeyerkolben auf 500 ml aufgefüllt, was 3% Feststoffen äquivalent war. Die Berechnung der Prozent Feststoffe basiert auf den ursprünglichen Feststoffen, wie sie vom Hersteller angegeben sind. Feststoffe, die durch Filtration entfernt werden können, sind bei Berechnung des Endfeststoffgehaltes nicht berücksichtigt. Kobalt- und Kupfersalze wurden wie oben zugegeben. Die Zellen wurden bei Umgebungstemperaturen 4 Tage auf einer Schüttelvorrichtung bei 280 Upm gezüchtet.
ZüchtungsmediumEnzymproduktion (U/ml Kulturbrühe) Schlamm nicht entfernt 2,5 Schlamm entfernt23,2
Beispiel 3
Die Menge der durch den Mikroorganismus erzeugten Glucose- isomerase wird auch durch die organische Stickstoffquelle beeinflußt, wie man aus Tabelle IV ersieht. Die Werte in Tabelle IV wurden bei Züchten des Mikroorganismus in 100 ml Brühe in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben für 3 Tage auf der Schüttelvorrichtung bei 28°C und 280 Upm erhalten. Die Konzentration an organischen Stickstoff-Feststoffen wurde auf 2% eingestellt, dann wurde neutralisiert und filtriert und mit 250 mg Glucose, 22 mg K₂HPO₄ und 11 mg MgSO₄ · 7H₂O versetzt und mit Leitungswasser auf Einheitsvolumen aufgefüllt. Das Medium wurde 15 Minuten bei 121°C sterilisiert. Die Zellen wurden gewonnen, sonifiziert und die Aktivität des Enzyms gemessen. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in Aktivitätseinheiten pro Milliliter Kulturbrühe.
Maisquellwasser ergibt die höchste Aktivität und ist die bevorzugte organische Stickstoffquelle.
Tabelle IV
Effekt der organischen Stickstoffquelle bei Produktion von Glucose-isomerase
Beispiel 4
Die optimale Konzentration an Maisquellwasser, aus der neutralisierter Schlamm (als Feststoff) entfernt wurde, zur Herstellung von Enzym lag bei 3%, wie Tabelle V zeigt. Die Konzentration kann von 0,5% bis etwa 7% Gew.-% des Mediums variieren. Die Züchtungsbedingungen waren wie in Beispiel 3 mit der Ausnahme, daß das Züchtungsmedium keine Glucose enthielt, sondern mit 2,5 mg CoSO₄ · 7H₂O ergänzt wurde. Die Zellen wurden 4 Tage gezüchtet, gewonnen und nach der Prozedur von Beispiel 1 analysiert.
% MaisquellwasserEnzymproduktion (U/ml Kultur)
0,5 9,6 1,022,3 2,023,6 3,029,4 4,023,4 5,023,4 6,021,8
Beispiel 5
Die Wirkung verschiedener Kohlenhydratquellen bei der Erzeugung von Glucose-isomerase aus Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342 wurde untersucht. Ein mäßig stimulierender Effekt wurde im Falle der Fructose beobachtet. Etwa 0,1 bis 2 Gew.-% Fructose des Mediums ist der bevorzugte Bereich, wenn Fructose zugegeben wird. Die Werte in Tabelle VI wurden bei Zugabe von 0,25% w/v Kohlenhydrat zum Züchtungsmedium, das 3% Maisquellwasser und andere Nährstoffe enthielt, unter den Bedingungen wie in Beispiel 1 erhalten.
KohlenhydratquelleEnzymaktivität (U/ml Kultur)
keine28,0 D-Fructose35,2 D-Galactose31,5
Beispiel 6
Der Zusatz verschiedener Metallionen zu den Züchtungsmedien von Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342 beeinflußt ebenfalls die Produktion von Glucose-isomerase. Zellen wurden nach der Prozedor in Beispiel 4 in 3%igem Maisquellwasser gezüchtet, mit der Ausnahme, daß zusätzlich Salze zugegeben wurden.
ZusatzEnzymproduktion (U/ml Kulturbrühe)
kein22,8 Co++(0,1 mM)27,3 Co++(0,1 mM) Mg++(0,45 mM)27,0 Co++(0,1 mM) Cu++(0,05 mM)30,0
Etwa 0,05 mM bis etwa 0,5 mM Kobaltionen und etwa 0,01 mM bis etwa 0,1 mM Kupferionen können zugegeben werden.
Beispiel 7
Es wurde gefunden, daß die Herstellung von Glucose- isomerase durch das Anfangs-pH des Züchtungsmediums beeinflußt wird. Das optimale Anfangs-pH ist 7,0, wie Tabelle VIII zeigt. Das Züchtungsmedium wurde zubereitet durch Neutralisierung des Maisquellwassers mit NaOH, Filtrieren und nachfolgendes Einstellen auf das gewünschte pH und nach den Bedingungen in Beispiel 4 verwendet.
Tabelle VIII
Effekt des Anfangs-pH des Züchtungsmediums bei der Züchtung und Enzymproduktion
Die Proteinbestimmungen erfolgten nach der Methode von Lowery (J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)) an Enzym­ extrakten.
Beispiel 8
Es wurde gefunden, daß Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342 über einen breiten Temperaturbereich Glucose- isomerase-Aktivität erzeugt. Die optimale Züchtungstemperatur ist 28°C, wie Tabelle IX zeigt. Die Werte für Tabelle IX wurden erhalten, indem der Mikroorganismus 2-4 Tage bei 16°-45°C in dem in Beispiel 1 beschriebenen Maisquellwassermedium gezüchtet wurde.
Tabelle IX
Effekt der Züchtungstemperatur bei der Enzymproduktion
Beispiel 9
Die Enzymproduktion aus Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342 wird in einem Fermenter mit automatischer pH- und Schaumkontrolle durchgeführt. 10 Liter Medium wurden unter Verwendung von Maisquellwasser hergestellt, die auf pH 7,0 mit NaOH eingestellt war, filtriert und mit Leitungswasser auf Einheitsvolumen gebracht. Genügend Maisquellwasser (50% Feststoffe) wurde verwendet, um eine Endkonzentration von 4% zu erhalten. Ein Verlust an Feststoffen bei Neutralisation und Filtration wurde nicht in Rechnung gestellt, wenn der Endfeststoffgehalt berechnet wurde. Das Medium wurde ergänzt mit 0,1 mM Kobaltsulfat und 0,05 mM Kupfer(II)sulfat und bei 121°C 30 Minuten sterilisiert. Die Züchtung erfolgte 5 Tage bei 30°C mit einem auf 7,0 durch die automatische Zugabe von 2 M H₂SO₄ geregelten pH. Die Rührung betrug 200 Upm und die Belüftung 1 Volumen pro Minute. Die Fermentation wurde gestartet durch Zugabe von 10% einer 24-Stunden-Impfkultur, die aus dem gleichen Medium aufgebaut war. Am Ende der Züchtungsperiode enthielt die Kulturbrühe 56 Aktivitätseinheiten pro Milliliter.
Beispiel 10
Die Isomerierung von Glucose zu Fructose erfolgt unter Verwendung zellfreier Extrakte. Das pH der Isomerisierung kann von etwa 5,5 bis 9 variieren, jedoch wurde das optimale pH bei 7,0 gefunden (Tabelle X). Das Enzym ist bemerkenswert temperaturbeständig, wobei noch eine merkliche Aktivität bei 90°C verbleibt. Das bei diesen Versuchen verwendete Enzym stammte von Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342, das in dem Trypton-Soyton-Medium ohne D-Xylose, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet wurde.
Die Enzymaktivität wurde ausgedrückt in Einheiten pro ml Rohenzymlösung, die nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt war. Die Versuchsbedingungen entsprachen der Aktivitätsanalyse, abgesehen von dem geeigneten Phosphatpuffer, wenn das in Tabelle X angegebene pH erhalten wurde, und der variierten Temperatur. Die Werte aus Tabelle X sind um die nichtenzymatische Umwandlung korrigiert worden. Die Glucosekonzentration ist größer als 0,1 M.
Tabelle X
Effekt des pH auf die Aktivität von Glucose-isomerase
Temperatur (°C)Aktivität (U/ml)
40  4,5 50  9,1 60 20,7 70 43,5 75 57,5 80 74,5 85127,0 90158,4
Beispiel 11
Zweiwertige Kationen haben eine tiefgreifende Wirkung auf die Aktivität von Glucose-isomerase, die wie in Beispiel 10 hergestellt worden war. Der größte Effekt wurde bei Magnesium und Kobalt festgestellt. Die Tabellen XII und XIII beschreiben die Ergebnisse bei Zugabe von Magnesium zu einem zellfreien Enzymextrakt sowie die zusätzliche Aktivitätserhöhung, die durch Kobalt ausgelöst wird. Die Bedingungen der Analyse entsprechen mit Ausnahme der Konzentration der zweiwertigen Kationen denen der Aktivitätsbestimmung.
Mg++ wird im Bereich von 0,1 mM bis etwa 9 mM, vorzugsweise 0,3 mM, zugegeben, Co++ von etwa 0,05 bis 0,6 mM, vorzugsweise von 0,1 bis 0,3 mM, zugefügt.
Konzentration von MgSO₄(mM)Enzymaktivität (U/ml)
0 4,8 0,525,0 1,041,2 2,044,3 3,043,5 4,043,5 Konzentration von COSO₄Enzymaktivität (U/ml)
044,0 0,249,0 0,354,0 0,454,0

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase mit Hilfe eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus aus der Gruppe Actinoplanes missou­ riensis NRRL B-3342, Actinoplanes philippinensis ATCC 12 427, Streptomyces armeniacus ATCC 15 676 und Actino­ planes sp. ATCC 23 342 in einem Züchtungsmedium, das frei von Xylose und/oder Xylan ist, gezüchtet und hieraus die Glucose-isomerase gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Züchtungsmedium zusätzlich 0,05 bis 0,5 mM Kobaltionen und 0,01 bis 0,1 mM Kupferionen zugesetzt werden.
DE19732351443 1972-10-10 1973-10-10 Verfahren zur herstellung von glucoseisomerase und zur verwendung derselben zwecks umwandlung von glucose in fructose Granted DE2351443A1 (de)

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