DE3505353C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Serin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-SerinInfo
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Abstract
Diese Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin durch Umsetzen von Glycin mit Formaldehyd unter Verwendung der Kulturlösung oder der Mikrobenzellen eines zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus mit Vermögen zur Produktion von Serin-Hydroxymethyltransferase und praktisch ohne Vermögen zur Produktion von L-Serin aus Glycin alleine oder durch Behandeln der obigen Kulturlösung oder Mikrobenzellen erhaltenen Enzymmaterials. Erfindungsgemäß kann die Ausbeute an L-Serin erhöht werden, entweder indem die Reaktion unter Halten der Aldehyd-Konzentration bei 20 mM oder darunter durchgeführt wird oder indem Mikrobenzellen des erwähnten Mikroorganismus verwendet werden, nachdem sie mit Glycin in Berührung gekommen sind.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf das im Oberbegriff des Anspruchs 1 genannte Verfahren zur Herstellung von
L-Serin.
L-Serin ist als Aminosäure sowie Wirkstoff, Kosmetikum, Futterzusatz und Zwischenstufen für Wirkstoffe
von Bedeutung.
Serin-Hydroxymethyltransferase (E.C.2.1.2.1.), auch
entweder als Serin-Transhydroxymethylase oder Serin-Aldolase bezeichnet, kommt verbreitet in Tieren, Vögeln,
höheren Pflanzen, Mikroorganismen usw. vor. Es ist bereits bekannt, die Reaktion der Synthese einer ß-Hydroxyaminosäure
aus Glycin und einem Aldehyd unter Verwendung von Pyridoxalphosphat als Coenzym zu katalysieren (s. z. B. Advances in Enzymology 53,
83-112(1982)).
Herkömmlicherweise war als Methode zur Herstellung von L-Serin nach einer enzymatischen Methode
unter Nutzung der Serin-Hydroxymethyltransferase eines Mikroorganismus ein Verfahren zur Herstellung
von L-Serin aus entweder Glycin alleine oder der Kombination von Glycin und einer geringen Menge Formaldehyd
unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Proteus (Patentveröffentlichung Nr. 58-2677
(1983)), Sarcina, Flavobacterium, Pseudomonas oder Microbacterium (offengelegtes Patent Nr. 53-81691
(1978)) bekannt. Jeder bei einer solchen Methode eingesetzter Mikroorganismus besitzt eine starke Aktivität
der Erzeugung von L-Serin aus Glycin selbst. Selbst wenn Formaldehyd zur Herstellung der Reaktionslösung
zugesetzt wird, ist das Molverhältnis von erzeugtem L-Serin zu der Reaktion zugesetztem Formaldehyd
nur etwa 10:1. Dies wird als Hinweis darauf verstanden, daß nicht nur Serin-Hydroxymethyltransferase, sondern
auch ein die Reaktion intensiver Spaltung von Glycin katalysierendes Enzym an der Reaktion teil hat, was zu
einer extrem niedrigen Ausbeute an L-Serin relativ zu Glycin von 10 Mol-/Mol-% oder weniger führt. Da die
Konzentration des angesammelten L-Serins höchstens etwa 5 g/l ist, kann man hier kaum sagen, daß diese
Methode praktisch ist.
Die vorliegende Erfindung ergab sich nach intensiven Bemühungen um ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin
in hoher Konzentration in Reaktionslösung in hoher Ausbeute relativ zu Glycin unter Verwendung von
durch einen Mikroorganismus produzierter Serin/Hydroxymethyltransferase in Gegenwart von Glycin durch
wirksamen Einsatz von Formaldehyd. Als Ergebnis wurde nun gefunden, daß L-Serin wirksam produziert und
angereichert werden kann durch gesteuerte Reaktion unter Verwendung der Kulturlösung oder der Mikroorganismenzellen
von Escherichia coli FERM BP-793 oder FERM BP-794.
Die Figur ist eine graphische Darstellung, die die Be-Ziehung
zwischen der Konzentration von Glycin, verwendet für die in Beispiel 4 durchgeführte Glycinbehandlung,
und der Menge an produziertem Serin angibt. Erfindungsgemäß kann L-Serin in bemerkenswert
hoher Ausbeute und in einer besonders hohen Konzentration produziert und angesammelt werden, indem
Formaldehyd kontinuierlich oder intermittierend so zugesetzt wird, daß seine Konzentration bei 20 mM oder
darunter bleibt. Weiter kann erfindungsgemäß L-Serin wirksam produziert und angesammelt werden, indem
man die Mikrobenzellen des Mikroorganismus mit Glycin in Kontakt gelangen läßt, bevor man Glycin mit
Formaldehyd reagieren läßt, unter Verwendung der obigen Mikrobenzellen. Eine solche erfindungsgemäße
Reaktionssteuerung kann alleine oder in Kombination von zwei oder mehr durchgeführt werden, um eine bemerkenswerte
Menge an L-Serin zu produzieren und anzusammeln.
Insbesondere bleibt beim erfindungsgemäßen Verfahren am Ende der Reaktion eine bemerkenswert geringe
Menge an Glycin, und dies lindert die Mühe des Isolierens und Reinigens von L-Serin aus der Reaktionslösung bemerkenswert, was anzeigt, wie hervorragend
das erfindungsgemäße Verfahren als industrielles enzymatisches Verfahren zur Herstellung von L-Serin ist.
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind Bakterienstämme, die zur Gattung Escherichia
gehören, mit der Fähigkeit, Serin-Hydroxymethyltransferase zu produzieren, und praktisch ohne die Fähigkeit,
L-Serin aus Glycin alleine zu produzieren. Es sind die Stämme Escherichia coli MT-10350 (FERM BP-793)
und Escherichia coli MT-10351 (FERM BP-794).
Der hier verwendete Begriff »praktisch ohne Fähigkeit« schließt den Fall völligen Fehlens von Aktivität
sowie den Fall einer so schwachen Aktivität ein, daß die praktische Durchführung der Erfindung nicht gehindert
wird, da die Erzielung des erfindungsgemäßen Effekts in einem solchen Falle nicht speziell gehindert wird.
Der Ausdruck »ein behandeltes enzymatisches Material« bezeichnet jedes Material, das durch Behandeln
des Mikroorganismus selbst oder seiner Kulturlösung so erhalten wird, daß die Aktivität der vom Mikroorganismus
stammenden Serin-Hydroxymethyltransferase nicht beeinträchtigt wird, da dieses Enzym die Hauptrolle
bei der praktischen Durchführung der Erfindung spielt.
Beim Kultivieren eines Mikroorganismus im Rahmen der praktischen Durchführung der Erfindung bestehen
keine speziellen Beschränkungen der Kulturbedingungen einschließlich des Mediums, und sowohl ein synthetisches
als auch ein natürliches Medium können verwendet werden, so lange sie eine Quelle für Kohlenstoff, für
Stickstoff, anorganische Salze, organischen Nährstoff und dergleichen, die von dem verwendeten Bakterienstamm
genutzt werden können, enthalten. Vorzugsweise wird die Kultur unter aerober Bedingung bei einem
pH von 5 bis 9 und bei einer Temperatur von 25 bis 40° C
durchgeführt.
Die so erhaltene Kulturlösung selbst kann als enzy-
matische Quelle verwendet werden. Daneben können auch lebensfähige Mikroorganismenzellen, aus der Kulturlösung
gewonnen durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergleichen, und durch Trocknen od»;r Behandeln
dieser Zellen erhaltenes Material (z. B. Material, erhalten durch Behandeln dieser Zellen durch Vermählen,
Ultraschallwellen, Autolyse oder dergleichen, Eluat dieser Zellen und aus dem obigen Extrakt erhaltene enzymatische
Fraktion) verwendet werden.
Vorzugsweise werden die Mikroorgaiiismenzellen
mit Glycin (Glycinbehandlung) in Kontakt gebracht bevor man Glycin mit einem Aldehyd unter Verwendung
der obigen Mikrobenzellen reagieren läßt. Wenn die Kulturlösung selbst ais enzymatische Quelle verwendet
wird, wird empfohlen, die Glycinbehandlung durch GIycin-Zusatz
zur Kulturlösung nach beendeter Kultur durchzuführen. Wenn durch Zentrifugieren, Filtrieren
odsr dergleichen gesammelte Mikroorganismenzellen als Enzymquelle verwendet werden, wird er..pfohlen, die
gesammelten Zellen in einer geeigneten Glycinlösung zu suspendieren. Die Glycinbehandlung, wenngleich sie
entweder unter Ruhebedingungen oder unter Rühren erfolgen kann, wird erwünschtermaßen im pH-Bereich
von 6 bis 9 und im Temperaturbereich von 20 bis 7O0C
durchgeführt. Wenngleich eine ausreichende Wirkung mit 4 Gew.-% Glycin-Konzentrat.ion erwartet werden
kann, ist die übliche in diesem Falle verwendete Konzentration etwa 7 bis 23%. Die Dauer der Glycin-Behandlung
ist, wenngleich sie mit der Konzentration der Zellen, der Glycin-Konzentration, der Temperatur usw.
zu variieren scheint, gewöhnlich 30 min bis 24 h. Der Glycin-Behandlung unterworfene Zellen können als Enzymquelle
für die Reaktion verwendet werden.
Es ist wünschenswert, daß die Reaktion zwischen Glycin und Formaldehyd gemäß der Erfindung in Gegenwart
der so erhaltenen, Glycin-behandelten Zellen bei einem pH von 6 bis 9 und bei einer Temperatur von
20 bis 600C unter Schütteln oder Rühren durchgeführt wird.
Für die Konzentration des als Reaktionssubstrat verwendeten Glycins ist ein großer Bereich möglich. Da die
übliche G!y_cin-Kqnzentration im Bereich von 1 bis 40%
ist, kann als Reaktionssubstrat verwendetes Glycin in seiner Gesamtmenge zu Beginn der Reaktion oder nach
und nach in verschiedenen Portionen mit Fortschreiten der Reaktion zugesetzt werden.
Andererseits sollte Formaldehyd in einer solchen Konzentration verwendet werden, daß die enzymatische
Aktivität nicht gehemmt wird. Es kann nach und nach in mehreren Portionen mit Fortschreiten der Reaktion
zugesetzt werden.
L-Serin kann in hoher Ausbeute produziert und angesammelt werden, indem die Formaldehyd-Konzentration
bei 20 mM oder darunter bei Durchführung der Reaktion gemäß der Erfindung gehalten wird.
Da Serin-Hydroxymethyltransferase Vitamin Be als
Coenzym erfordert, wird die Reaktion durch Zugabe von Pyridoxalphosphat zum Reaktionssystem in manchen
Fällen beschleunigt.
In manchen Fällen wird die Reaktion durch Zugabe von Tetrahydrofolsäure, als Coenzym verwendet, zum
Reaktionssystem beschleunigt.
Diese Reaktion wird durch Zugabe eines Reduktionsmittels oder durch die Durchführung unter Stickstoff-Zuführung
in manchen Fällen beschleunigt. In solchen Fällen seien als Reduktionsmittel Ascorbinsäure, Dithiothreit,
2-Mercaptoethanol, Dithioerythrit, reduzierendes Glutathion, Cystein und Natriumsulfit aufgeführt.
Zum Isolieren des in dar Reaktionslösung produzierten
L-Serins kann eine herkömmliche Methode, wie Konzentrieren oder Adsorptions- und Desorptionsbehandlung
mit einem Anionenausüiuscherharz oder Aktivkohle, angewandt werden.
Die qualitative Identifizierung des produzierten L-Serins kann durch Ninhydrin-Farbentwicklung auf einem
Papierchromatogramm erfolgen. Die quantitative Anaiyse kann entweder durch Flüssigchromatographie oder
ίο durch Ausschneiden eines Ninhydrin-Farbentwicklungsflecks
auf dem Papierchromatogramm erfolgen, bevor das Eluat des Flecks der kolorimetrischen Bestimmung
unterworfen wird. Die quantitative Analyse von L-Serin kann durch einen mit Leuconostoc mesenteroides
durchgeführten Biotest erfolgen.
Nachfolgend wird die Erfindung durch Beispiele und Vergleichsbeispiele weiter beschrieben.
Nachdem Escherichia coli MT-10350 (FERM BP-793)
auf einer Bouillon-Schrägkultur bei 37° C 40 h gezüchtet worden war, wurden je fünf 100 ml-Portionen eines Mediums
(pH 7,2), das das in Tabelle I angegebene Nährmedium enthielt, mit einer Platinschlaufe des gezüchteten
Bakteriums beimpft, bevor Schüttelkultur bei 37°C für 40 h erfolgte, um die Kulturlösung zu erhalten. Sodann
wurden 10 1 des Mediums der obigen Zusammensetzung in einem 20 1-Fermentator mit der obigen KuI-turlösung
beimpft, belüftet und bewegt, pH 7,2, 370C, 30 h. Die so erhaltene Kulturlösung wurde zentrifugiert,
um Mikroorganismenzellen zu sammeln, die dann mit physiologischer Salzlösung gewaschen werden, wodurch
etwa 50 g feuchte Zellen erhalten werden. Die so erhaltenen feuchten Zellen wurden bei —15° C zwei Tage
gefroren und unmittelbar vor ihrer Verwendung als Enzymquelle" für die Reaktion aufgetaut. Nachdem 40 g
der gefrorenen Zellen zu 500 ml Reaktionslösung, die in Tabelle II angegebenen Bestandteile enthaltend, gegeben
worden waren, wurde Formalin kontinuierlich mit einer peristaltischen Pumpe so zugeführt, daß sein Konzentrationsbereich
von 7 bis 12 mM gehalten wurde, indem die Konzentration an in der Reaktionslösung enthaltenem
Formaldehyd durch Gaschromatographie analysiert wurde. Die Reaktion wurde bei 500C bei pH
7,0 durchgeführt, wobei die Reaktionslösung leicht gerührt und ihr Stickstoffgas mit einer Geschwindigkeit
von 1 ml/min eingeleitet wurde. Das Einleiten des Formalins in die Reaktionslösung wurde 37 h fortgesetzt,
und die Gesamtmenge an der Reaktionslösung zugeführtem Formalin (37 Gew./Gew.-% Formaldehyd-Lösung)
war 24 ml. Nach beendeter Reaktion waren 29 g L-Serin in der Reaktionslösung angesammelt. Die Konzentration
des angesammelten L-Serins war 55 g/l. Die Molausbeute an produziertem L-Serin relativ zu dem
zur Herstellung der Reaktionslösung zugesetzten Glycin war 83% und relativ zu Formaldehyd 86%
Tabelle I | % |
1 | |
Glucose | 0,2 |
Zitronensäure | 0,3 |
NaNH4HPO4 · 4 H2O | 0,5 |
K2HPO4 | 0,05 |
MgSO4 · 7 H2O | 0,05 |
Hefeextrakt | |
Glycin
Tetrahydrofolsäure
Pyridoxalphosphat
0,1
0,01
Die Reaktion wurde unter Verwendung von Escherichia coli MT-10351 (FERM BP-794), einem von dem in
Beispiel 1 verwendeten Mikroorganismus verschiedenen Mikroorganismus, nach der gleichen Methode wie
in Beispiel 1 durchgeführt. Formalin wurde in die Reaktionslösung 57 π eingeleitet, und die Gesamtmenge an in
die Reaktionslösung eingeleitetem Formalin war 25 ml. In der Reaktionslösung waren 28 g L-Serin angesammelt.
Die Konzentration des angesammelten L-Serins war 53 g/l. Die Molausbeute an produziertem L-Serin
realtiv zu dem zur Herstellung der Reaktionslösung zugesetzten Glycin war 80% und relativ zu dem der Reaktionslösung
zugesetzten Formaldehyd 80%.
Das Vermögen des erfindungsgemäß zur Produktion von L-Serin aus Glycin in Gegenwart und in Abwesenheit
von Formaldehyd verwendeten Mikroorganismus wurde verglichen. Die Ergebnisse waren, wie in den
folgenden Versuchsbeispielen angegeben.
Vergleichsbeispiel 1
100 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,0), 10 g/l Fleischextrakt, 10 g/l Pepton und 15 g/l NaCl enthaltend,
wurden jeweils mit Escherichia coli MT-10350 und MT-10351 beimpft und 24 h bei 300C schüttelkultiviert.
Nach beendeter Kultur wurden die Mikrobenzellen zentrifugiert und zweimal mit physiologischer Salzlösung
gewaschen, wodurch etwa 0,4 g feuchte Mikrobenzellen erhalten wurden. 0,2 g der so erhaltenen feuchten
Mikrobenzellen wurden in 10 ml einer 5OmM Phosphatpufferlösung (pH 7,0), 5000 μΜοΙ Glycin,
150μΜο1 Formaldehyd, ΙΟμΜοΙ Tetrahydrofolsäure
und 0,1 μΜοΙ Pyridoxalphosphat enthaltend, suspendiert
und das Gemisch unter Schütteln 2 h bei 37°C der Reaktion unterworfen.
Wie in Tabelle III gezeigt, wurde die Ansammlung von L-Serin beobachtet
Ein weiterer Versuch wurde nach der gleichen Arbeitsweise durchgeführt, ausgenommen, daß Formaldehyd
nicht zugesetzt wurde, und die folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
Nachdem 100 ml-Portionen des Mediums mit der in Tabelle IV gezeigten Zusammensetzung in 500 ml-Schüttelkolben
gegossen und sterilisiert worden waren, wurde diese sterilisierte Portion mit einer Platinschlaufe
Escherichia coli MT-10350, zuvor auf einer Bouillon-Schrägkultur 20 h bei 37°C gezüchtet, beimpft. Die
Schüttelkultur erfolgte 15 h bei 37°C. Aus der so erhaltenen
Kulturlösung wurden Mikrobenzellen durch Zentrifugieren gewonnen, bevor sie mit physiologischer
Salzlösung gewaschen und bevor sie wiederum zentrifugiert wurden, um feuchte Mikroorganismenzellen zu erhalten.
1 g der feuchten Zellen wurden in 5 ml 18%iger Glycinlösung vom pH 7,5 suspendiert und 3 h bei 500C
leicht geschüttelt (Giycinbehandlung). Nachdem die die Zellen enthaltende Glycinlösung mit Wasser zur Einstellung
des Gesamtvolumens auf 10 ml vor dem Einstellen des pH auf 7,0 verdünnt worden war, wurden
1 mg Pyridoxalphosphat, 10 mg Tetrahydrofolsäure und 20 mg Formalin (37%ige Formaldehydlösung) zugesetzt
und die Reaktion gestartet. Sie wurde bei 500C bei pH 7 durchgeführt, wobei sie leicht gerührt wurde und
Stickstoffgas mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml/ min eingeleitet wurde. Nach dem Starten der Reaktion
wurde eine 10 mg-Portion Formalin alle 30 min der Reaktionslösung zugesetzt. Die Reaktion wurde 20 h fortgeführt,
und die Gesamtmenge an der Reaktionslösung zugesetztem Formalin war 420 mg. In der Reaktionslösung
hatten sich 500 mg L-Serin angesammelt.
Vergleichsbeispiel 2
Andererseits wurde 1 g der feuchten, in Beispiel 3 erhaltenen Mikrobenzellen ohne Giycinbehandlung in
10 ml 9%iger Glycinlösung (pH 7,0) suspendiert und die Suspension nach genau der gleichen Arbeitsweise wie
oben umgesetzt. Als Ergebnis hatten sich nur 98 mg L-Serin in der Reaktionslösung angesammelt.
Tabelle IV | % |
1 | |
Glucose | 0,2 |
Zitronensäure | 03 |
NaNH4HPO4 ■ 4 H2O | 0,5 |
K2HPO4 | 0,05 |
MgSO4 ■ 7 H2O | 0,05 |
Hefeextrakt | |
Beispiel 4 und Vergleichsbeispiel 3
Mikroorganismus
(Escherichia coli)
(Escherichia coli)
Menge angesammelten L-Serins
(μΜοΙ/lOml)
mit ohne
HCHO-Zugabe HCHO-Zugabe
MT-10350
MT-10351
MT-10351
140
78
78
12
10
10
So ist offensichtlich, daß der erfindungsgemäß verwendete
Mikroorganismus L-Serin aus Glycin und Formaldehyd produzierende Aktivität besitzt und praktisch
keine L-Serin aus Glycin alleine produzierende Aktivität besitzt
Feuchte Zellen von Escherichia coli MT-10350 wurden
nach der gleichen Methode, wie in Beispiel 3 angewandt, erhalten. Nachdem 1 g der feuchten Zellen in je
5 ml Glycinlösungen (auf pH 7,5 eingestellt) mit in Tabelle V gezeigten Konzentrationen suspendiert worden
waren, wurde die Suspension 3 h bei 5O0C leicht geschüttelt
Sodann wurden Wasser und Glycin der die Zellen enthaltenden Glycinlösung zugesetzt, um die
Glycinkonzentration auf 9% und die Gesamtmenge auf 10 ml einzustellen. Danach wurde nach der gleichen Methode
wie in Beispiel 1 umgesetzt Während der Reaktion wurde eine Gesamtmenge von 420 mg Formalin
dieser Reaktionslösung zugesetzt Die Mengen an in den Reaktionslösungen produziertem L-Serin waren
wie in Tabelle V angegeben.
7
Tabelle V
Tabelle V
Glycin-Konzentration für | Menge an produziertem |
Glycin-Behandlung (%) | L-Serin(mg) |
0 | 90 |
3 | 261 |
6 | 375 |
12 | 498 |
18 | 497 |
10
Beispiel 5 und Vergleichsbeispiel 4
Mit Escherichia coli MT-10351 wurde wie in Beispiel
3 gearbeitet. Als Ergebnis hatten sich in der unter Verwendung von Glycin-behandelten Mikroorganismenzellen
hergestellten Reaktionslösung 370 mg L-Serin angesammelt. In der mit Mikroorganismenzellen, die
keine Glycinbehandlung erfahren hatten, hergestellten Reaktionslösung war die Menge angesammelten L-Serinsnur39
mg.
Versuchsbeispiel 1
Bestimmung der Serin-Hydroxymethyltransferase-Ak-
Bestimmung der Serin-Hydroxymethyltransferase-Ak-
tivität
Feuchte Zellen, erhalten nach der in Beispiel 3 oder Beispiel 5 beschriebenen Methode, wurden in 50 mM
Kaliumphosphat-Pufferlösung (0,5 mM Pyridoxalphosphat enthaltend) vom pH 7,0 suspendiert, und die Suspension
wurde 5 min bei 4°C einer Ultraschallbehandlung unterworfen. Nachdem die so erhaltene behandelte
Lösung zentrifugiert worden war (10 000 g, 5 min), wurde
die im Überstand vorhandene Serin-Hydroxymethyltransferase-Aktivität
nach der Methode von R. T. Taylor et al. (Analytical Biochemistry 13,80—84 (1965)) gemessen.
Die Messungen der ermittelten spezifischen Aktivität sind in Tabelle VI angegeben.
Bakterienstamm spezifische Aktivität
(μΜοΙ HCHO/min/mg
Protein)
Protein)
45
Escherichia coli MT-10350 340
(FERM BP-793
Escherichia coli MT-10351 230
(FERM BP-794)
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
55
60
65
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Serin durch Umsetzen von Glycin mit Formaldehyd unter Verwendung
der Kulturlösung eines Mikroorganismus oder der Mikroorgar.ismenzellen allein und Isolieren
des gebildeten L-Serins in herkömmlicher Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus
Escherichia coli FERM BP-793 oder FERM BP-794 einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reaktion unter Halten der Aldehyd-Konzentration bei 20 mM oder darunter durchgeführt
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismenzellen
mit Glycin in Kontakt gelangen läßt, bevor die Reaktion zwischen Glycin und Aldehyd unter Verwendung
der Mikroorganismenzellen erfolgt.
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