KR930006993B1

KR930006993B1 - 효소법에 의한 l-세린의 제조법

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Publication number: KR930006993B1
Application number: KR1019900015576A
Authority: KR
Inventors: 다이스케 우라; 타다시 하시무까이; 토시오 마츠모또; 노부히로 후꾸하라
Original assignee: 미쓰이 도오아쓰 가가쿠 가부시키가이샤; 사와무라 하루오
Priority date: 1989-10-06
Filing date: 1990-09-28
Publication date: 1993-07-26
Also published as: DE69021001D1; DE69021001T2; CA2027059C; US5382517A; JP3017264B2; EP0421477B1; EP0421477A1; JPH03206892A; CA2027059A1; KR910008138A; DK0421477T3

Abstract

내용 없음.

Description

효소법에 의한 L-세린의 제조법

제1도는 실험예 4에 있어서 0-8시간의 처리시간에 따르는 효소소비량(%)을 나타낸다.

본 발명은, L-세린의 제조법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 세린 히드록시메틸트란스퍼라제활성을 지니는 미생물 세포, 혹은 세포처리물의 존재하에서, 글리신과 포름알데히드에서 효소법에 의해 L-세린을 제조하는 방법에 관한 것이다. L-세린은 의약품, 화장품 화학원료등에 이용되는 아민산으로, 현재는 화학적합성법 또는 글리신을 전구체로 하는 발효법에 의해 제조되고 있다.

그렇지만, 화학합성법의 경우는 DL체가 합성되므로 L체만을 얻으려면 광학분제(光學分劑)하지 않으면 안되는 단점이 있고, 한편, 글리신을 전구체로 하는 발효법에서는 축적량, 수율, 정제, 폐수처리등에 난점이 있는 관계로 이들 방법은 실용상 유리한 방법이라고 말하기 어렵다.

이들 방법에 대신하여 최근에는 세린히드록시메틸트란스퍼라제(EC 2.1.2.1. 이하 "SHMT"라 칭한다)를 이용해 글리신과 포름알데히드에서 L-세린을 효소적으로 합성하는 방법이 주목되고 있다.

게다가, 유전자 조작에 의해 미생물의 SHMT활성을 향상시키는 방법도 알려져 있는데(Gene, 14, P63-72(1981). Gene, 27, P47-54(1984)), 공업적으로는 미생물을 생산하는 SHMT를 이용하는 방법이 장래에는 더 유리한 것으로 기대되고 있다.

SHMT를 이용하여 효소법에 의해 글리신과 포름알데히드에서 L-세린을 공업적으로 유리하게 제조하는 방법으로는, SHMT활성을 지니는 미생물 또는 미생물의 세포를, 글리신용액과 접촉시킨후 L-세린 반응에 사용하는 방법이 알려져 있다(특개소 61-9294).

그런데, 미생물으로는 세린분해효소활성(이하 SD활성으로 칭한다)의 존재도 알려져 있다(예를들면 L-세린 데히드라타제(1 Shizufay. and Tokushige M. Metho

de in enzymology 17B P575-P580, Academic Press Inc. New York(1971) 2 Burns. R. O. Methods in enzynology 17B Academic Press New York(1971) 3 Kubota. K, etal., J. Fermentation and Bioengineering 67, (6) P391-P394(1989))

상기 SD 활성은 효소법 L-세린의 제조법에 의해 다음과 같은 문제점을 만든다.

① 생성된 L-세린이 분해하여 반응수율(대원료 글리신 수율)이 저하한다.

② L-세린 분해생성물에 의해 L-세린 생성반응이 억제되어 축적량이 저하한다.

이때문에, SD활성이 저하된 미생물변이주를 사용하여 L-세린을 효율좋게 제조하는 방법이 알려져 있다[문헌(1 Kubota. K. Agric Biol Chem. 49 P7-P12(1985))]. 그런데 SD실활(失活) 변이주를 조성하는 일은 용이한 일은 아니며 복원주(復元株)의 출현이란 문제가 발생하여 공업적 규모로서의 방법으로는 문제가 있다.

또한, 세린 분해활성의 억제법에 대해서는, 특개소 58-129972호 공보, 특개소 58-129975호 공보에 나타나있지만, 양쪽다 균체를 40-60℃의 특정온도 조건하, 10-30분간의 단시간에 처리하는 것으로서, 단시간 처리에 의해 성과를 얻으려 하는 것이나, 본 발명에서 사용하는 미생물에 의해서는 세린분해활성의 억제효과가 충분하지 않은 문제점이 나타났다.

이러한 점을 고려해 본 발명자들은 SHMT활성을 지니고, 동시에 SD활성도 지니고 있는 미생물의 배양액, 균체 또는 균체처리물을 사용하여 글리신과 포름알데히드로 L-세린을 제조하는데 알맞게 세포 또는 세포처리물중에 존재하는 SD활성을, SHMT활성의 저하는 최대한 억제하면서, 선택적으로 저하시키는 방법을 확립함을 목적으로 하고, 상기 SHMT효소활성을 지니는 미생물의 세포 또는 세포처리물을 사용하여 L-세린을 제조하는 방법을 연구하였다. 그결과, SHMT활성을 지니는 동시에 SD활성도 지니는 미생물의 세포현탁액 또는 세포처리물 용액을 60℃이하의 온도에서 용존산소가 1ppm 이상 존재하는 조건에서 전처리하면, 선택적으로 SD활성을 저하시키는 것을 발견하고, 이상의 처리를 행한 상기 미생물의 세포 또는 세포처리물을 이용해 글리신과 포름알데히드에 의해 L-세린을 효율좋게 제조하는 방법을 완성하였다.

즉, 본 발명은 효소 세린 히드록시메틸트란퍼라제활성을 지니는 미생물의 세포 또는 세포처리물의 존재하, 글리신과 포름알데히드에 의해 L-세린을 제조하는 방법에 의해서 세포현탁액 또는 세포처리용액을 60℃ 이하의 온도에서 용존산소가 1ppm이상으로 유지하도록 현탁액 또는 세포처리용엑에 산소 또는 공기를 용해시키고, 전처리한 상기 효소활성을 지니는 미생물의 세포 또는 세포처리물을 사용하는 것을 특징으로 하는 L-세린의 제조방법이다.

본 발명에 있어서 사용되는 미생물은, SHMT활성을 지니는 것이면 좋은데, 이러한 미생물로는 에세리치아·콜리(Escherichia coli) MT-10350(미공연균기 제7437호 BP793) 에세리치아·콜리 MT-10351(미공연균기 제7438호 BP793) 등이다.

본 발명에 있어서 사용되고 있는 미생물의 배양에는 사용균주가 이용가능한 탄소원, 질소원, 무기염류, 유기영양물 등을 함유하는 것이면 합성배지, 천연배지의 어느것에도 사용가능하다. 배양은 통상 호기적 조건, 배양온도 25-40℃, 배양액의 pH 6-8에서 행한다.

본 발명에서는 이렇게 하여 얻어진 배양액은 그대로 원심분리, 여과등에 의해 집균된 세포 또는 세포처리물을 효소원으로 사용한다. 세포처리물로는 세포를 기계적 파괴, 초음파처리, 동결융해처리, 건조처리, 용매처리, 화학적처리, 침투압처리, 자기소화, 계면활성제 처리, 효소처리등에 의해 세포벽의 일부 또는 전부를 파쇄한 것, 이렇게 하여 얻어진 효소고형분, 세포 및 세포추출물의 고정화물등이 있다.

배양액에서 세포를 집균하는 경우 배양액중의 탄소원, 예를들면 글리코스등이 소비된 배양액에서 집균하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는, 본 발명에서 사용하는 세포 또는 세포처리물을 60℃이하, 바람직하게는 30-50℃에서 유지, 산소 또는 공기를 통기, 혹은 교반에 의해 처리액중의 용조산소농도를 항상 1ppm이상 되도록 용해, 보지함에 의해 세포내 또는 세포처리물중에 존재하는 SD활성만을 선택적으로 저하시키는 것이 가능하다.

처리온도는 30℃미만에서는 SD활성의 억제가 가능하지 못한 경향이 있다. 또한 60℃를 넘으면 SD활성과 함께 SHMT활성도 저하하여 바람직하지 않다.

처리액중의 용존산소량은 용매, 용질에 의해 변화하지만 통상 처리액중에 1ppm이상으로 용존산소가 있으면 충분한다. 처리액의 pH는 통상 6-9, 처리시간은 2-10시간, 바람직하게는 4-8시간이다.

SD활성실활처리에 있어서 발포방지를 위해 통상 사용되는 소포제를 첨가하는 것이 좋다. 처리액중에 글리신을 첨가하여 처리하는 것도 마찬가지로 바람직한 태양이다. 이상의 전처리를 행한 SHMT활성을 지니는 세포 또는 세포처리물을 사용하여 L-세린의 합성을 실시한다.

본 발명의 L-세린 합성반응은 pH 6-9, 온도 30-60℃에서 교반하면서 행하는 것이 바람직하다. 효소 SHMT는 보효소로서 테트라히드로집산과 피리독살린 산을 요구하는 것으로, 이들 물질을 반응계에 첨가하는 것에 의해 L-세린반응이 고양되는 경우가 있다. 또한 본 발명의 L-세린반응은, 질소분위기 또는 환원제 존재하에서 행하는 것에 의해서도 한층 촉진되는 경우도 있다.

반응기질인 글리신의 첨가량은, 반응온도에 있어서의 포화용해도 이상에서도 특별한 문제가 없지만, 가능하면 5M에 가까운 농도가 바람직하다. 글리신의 첨가방법에 대해서는 반응개시때에 일괄적으로 첨가하거나 반응진행과 더불어 분할 첨가하는 것 모두 가능하다.

한쪽의 반응기질인 포름알데히드는 기체로서, 수용액으로서, 알코올 용액으로서 또는 고형중합물인 파라포름알데히드등의 형태로 사용하는 것이 가능하지만, 37-43% 정도의 수용액인 포르말린을 사용하는 것이 바람직하다.

포름 알데히드는 SHMT효소활성을 저해하지 않는 정도의 농도로 사용해야 하며, 반응의 진행에 따라 반응액에 분할 또는 연속적으로 첨가한다.

본 발명 방법의 L-세린 합성반응은 통상 pH 6-9, 반응온도 30-60℃, 반응시간은 5-40시간, 바람직하게는 반응온도 40-50℃에서 20-30시간이다.

pH의 조정은 반응액중에 알카리를 첨가하여 실시한다. 반응액에 첨가한 알카리로는, 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등 알카리금속 수산화물외에 피로린산칼륨, 암모니아등 물에 용해하여 액성이 염기성인 것이면 좋다.

반응진행은 반응액중의 L-세린 및 글리신 농도를 액체크로마토그래피로 분석하여 확인할 수 있다. 반응 종료후의 반응액의 후처리는, 반응액에 강산, 예를들면 황산, 염산등을 가해 액성을 산성 측, 바람직하게는 pH 5이하로 L-세린을 용해한다. 이 용액에 여과조제, 예를들면 활성탄 등을 가하고 열 여과해 균체 파쇄물등의 불순물을 제거한다.

여액은, 통상의 방법보다 농축하고 L-세린의 결정을 석출, 분리, 건조하여 L-세린을 얻는다.

본 발명에 있어서 최고의 특징인 SD활성을 저하시키는 처리의 효과에 의한 L-세린 합성반응에 있어서, ① 반응 생성한 L-세린의 분해가 억제되어 반응수율(대원료글리신 수율)의 저하를 방지할 수 있으며, ② L-세린 분해생성물에 의해 L-세린 생성반응이 억제되어 세린축적량이 저하하는 경우를 방지할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.

물론, 실시예는 본 발명을 구체적으로 입증해 주지만, 본 발명이 이런 실시예에 의해 한정을 받는 것은 아니다.

[실험예 1]

에세리치아·콜리 MT-10350(미공연균기제 7437호 BP793)의 균주를 후술의 LB-AP 한천평판배지에 식균하고, 35℃에서 하룻밤 배양을 행하고, 생육된 콜로니에서 2백금이(白金耳)를 150ml의 LB-AP 액제배지가 들어있는 마개달린 500ml 판구 플라스크에 접종하였다. 접종한 판구플라스크는 35℃에서 20시간 진동배양(120rpm)을 행하고, 소정시간 배양후, PT최소배지를 20사입한 30쟈파멘타에 이액하여 35℃, 통기량 1vvm, 교반회전수 600rpm에서 pH6.8로 pH콘트롤라에서 암모니아수 첨가에 의해 제어된다. 살균제 40% 글루코스 수용액을 축시 첨가하면서 40시간 배양을 행하였다. 소정시간 배양후, 배지중의 글루코스가 소비되는 것을 확인하고, 곧바로 원심분리기에서 집균을 행하여 습균체를 얻었다. 얻어진 집균습균체 0.46Kg 을 1.43K

g의물 및 0.41Kg의 글리신 용액중에 가했다. pH를 NaOH로 조절해 7.5로 하고 교반하면서 40dC에서 16시간 유지했다.

소정시간 혼합후, 혼합액을 2배로 희석하여 SD활성을 측정하고, 다음에 소포제(아데카놀 LG-109 욱전화제)를 0.1% 농도로 첨가하고, 표 1에 나타난 각 용존산소농도로 유지되도록 통기량을 조정하고, 통기후, 2시간, 4시간에서의 잔존 SD활성 및 SHMT활성을 혼합액을 2배로 희석하여 측정하였다.

[표 1]

배지조성

1. LB-AP한천평판배지

Bacto A 트립톤(Difco사제) 10.0g

Bacto A 효모엑기스(Difco사제) 5.0g

Nacl 10.0g

증류수 pH=7.5로 NaOH로서 조정100ml

pH조정후, 한천 15g을 가해 오트클레이브살균(120℃, 10분간)하고 60℃이하로 냉각후, 안피시린을 농도 25μg/로 되도록 하여 무균필타를 통하여 첨가하였다. 셀에 분주(分注)하고 고화하여 한천 평판을 제작하였다.

2. LB-AP 액제배지

Bacto A 트립톤(Difco사제) 10.0g

Bacto A 효모엑기스(Difco사제) 5.0g

Nacl 10.0g

증류수 pH=7.5로 NaOH로서 조정 1000ml

pH 조정후, 오트클레이브 살균(12℃, 10분간)하고, 60℃이하로 냉각후 안피시린을 농도 25μg/가 되도록 무균필터를 통해 첨가했다.

3. PT최소배지

인산1칼륨 2.0g

인산2칼륨 2.0g

MgSO₄·7H₂O 2.0g

(NH₄)₂SO₄1.5g

L-페닐알라닌 2.5mg

CaCl₂·2H₂O 80mg

CuCl₂·2H₂O 8mg

CoCl₂·6H₂O 8mg

AlCl₂·6H₂O 20mg

H₂BO₃1mg

MnSO₄·5H₂O 20mg

ZnSO₄·7H₂O 4mg

Na₂MoO₄·2H₂O 4mg

FeSO₄·7H₂O 80mg

증류수 1000ml

를 혼합하고, 120℃에서 30분 살균 후, 0.2μm의 무균필터로 무균여과한 염산티아민 수용액을 티아민 농도를 50mg/ℓ가 되도록 첨가했다.

SD활성 및 SHMT활성의 측정방법

1. SD활성 측정방법

2. 2ml의 엣판드로프쵸프중에서, 0.1ml의 500mM 인산완충액(pH 7.5)과 0.6ml의 33mM L-세린 수용액과 0.1ml의 0.1mM 피리독살린산(50mM 인산완충액(pH 7.5))과 0.1ml의 증류수를 가해, 30℃에서 5분간 프레인교바숀을 행하였다. 다음에 그 용액에 0.4ml의 균체처리액을 가해 교반한 후 30℃에서 2시간 반응시켰다. 소정시간 종료후, 0.2ml의 트리클로로초산(15% 수용액)을 가하여 반응을 정지하였다.

반응액은 원심분리를 행하고 상청액을 10배로 희석하고 액체크로마토그래피(이하 HPLC로 칭한다)로 L-세린의 분석을 행하였다. 대조적으로 프레인교바숀 한후, 반응액에 트리클로로 초산을 가하고, 균체처리액을 가했다. 소정시간 30℃에서 반응을 행하고 상기와 같은 모양으로 원심분리를 행한 상청액중의 L-세린 농도를 분석하고 이를 표준으로 하였다. HPLC에서 L-세린의 분석조건은 하기와 같다.

HPLC분석조건(L-세린, 글리신의 정량) 포스트라벨법에서 분석을 행하였다. 이 동상은 탈기수를 사용하고 유속을 1.0ml/min로 설정하였다.

발색제는, O-프탈알데히드용액을 유속 0.4ml/min으로 통액하였다. 검출기는 형광검출기를 사용하여, 조사파장 365nm, 방사파장 455nm로 행하였다. 분리칼럼은 Shodex DM-614(소화전공제)를 2개 직렬로 하여 사용했다.

2. SHMT 활성측정방법

2.2ml의 엣판드르프쵸프중에, 0.1ml의 500mM 인산버터(pH=7.3)과 0.5ml의 1.0M 글리신 수용액과 0.3ml의 0.45% 테트라히드로염산용액(0.08% 포르말린을 함유한 500mM 인산완충액(pH=7.3)과 0.2ml의 증류수를 가하고, 50℃에서 5분간 프레인교바숀을 행하였다.

다음에, 그 용액에 0.1ml의 균체처리액(50mM 인산완충액(pH 7.3)에서 50배로 희석처리한 액)을 가하고, 교반한 후, 50℃에서 10분간 반응하였다. 소정시간 종료후, 0.3ml의 트리클로로초산(15% 수용액)을 가하여 반응을 정지했다. 반응액은 원심분리를 행하고, 상청액을 5배로 희석하고, HPLC로 L-세린의 분석을 행하였다. HPLC의 L-세린의 분석조건은 상기와 같다.

[실험예 2]

에세리피아·콜리 MT-10350의 균주를, 실험예 1과 같은 모양으로 조작하여 배양을 행하고, 배양액에서 원심분리하여 습균체를 얻었다. 얻어진 습균체를 배양액의 1/3량의 0.85% NaCl수용액에서 세정후, 다시 원심분리에 의해 집균하여 세정균체를 얻었다. 88.8g의 세정습균체를 5℃로 냉각한 0.1M 트리스·염산완충액(pH 7.5)을 가하여 800g으로 하였다. 상기 현탁액을 2분하고, 한쪽의 현탁액은 초음파분쇄기(BRANSON 사제)에서 빙상에서 파쇄처리를 행하고, 파쇄액을 다시 2분하고, 각각의 파쇄액을 용존산소농도계(동아전파제), 통기노즐, 교반장치 및 온도조절장치를 지니는 용기에 주입하고, 소포를 위해 아데카놀 LG-109(욱전화제)를 0.05%가 되도록 첨가하고, 40℃에서 표 2에 표시한 용존산소농도가 되도록 통기량을 조정하고, 개시시의 SHMT활성 및 SD활성을 측정하였다.

또한, 통기후 4시간에서의 각각의 활성을 측정하고, 잔존율을 표 2에 표시한다. 상기 현탁액의 나머지는 초음파 처리를 행하지 않고, 다시 이것을 2분하고 용존산소농도계(동아전파제), 통기노즐, 교반장치 및 온도조절장치를 지니는 용기에 주입하고, 소포를 위해 아데카놀 LG-109(욱전화제)를 0.05%가 되도록 첨가하고, 40℃에서 표2에 표시한 용존산소농도가 되도록 통기량을 조정해 처리를 행하였다. 처리 4시간후 현탁액에 등량의 0.1M 트리스·염산완충액(pH=7.5)을 가하고 초음파 분쇄기(BRANSON사제)에서 빙상에서 파쇄처리를 행하고, 파쇄액의 SHMT활성 및 SD활성을 측정하였다.

[실험예 3]

에세리피아·콜리 MT-10350의 균주를, 실험예 1과 같은 모양의 조작으로 배양을 행하고, 배양액에서 원심분리하여 습균체를 얻었다. 얻어진 습균체를 배양액의 1/3량의 0.85% NaCl수용액에서 세정 후, 다시 원심분리에 의해 집균하여 세정균체를 얻었다. 10g의 세정습균체를 5℃에 냉각한 0.1M 트리스·염산완충액(pH=7.5)을 가해 1000g으로 하였다.

상기 현탁액을 5분하고 각각의 현탁액을 용존산소온도계, 통기노즐, 교반장치 및 온도조절장치를 지니는 용기에 주입하고, 소포를 위해 아데카놀 LG-109(욱전화제)를 0.05%가 되도록 첨가해, 표 3에 표시한 용존산소농도가 되도록 통기량 또는 교반을 조정하고, 20-65℃의 온도조건하에서 4시간 교반처리를 행하였다.

처리전 및 4시간 처리후의 각각의 SHMT활성 및 SD활성을 측정하고, 잔존율을 표 3에 표시한다.

[표 2]

[표 3]

* 처리시의 용존산소는 전부 5ppm으로 억제

[실험예 4]

에세리피아·콜리 MT-10350을 실험예 2와 같은 모양으로 배양, 집균한 습균체 500g을 얻었다. 순수 1160g을 배양에 사용하는 2.61 미니쟈파멘타(마르비센지사제·다빈형 교반 날개부(6익))에 사입하고 40℃하에서 공기를 1vvm으로 통기하면서 600rpm으로 교반하고 그 DO(용존산소) 농도를 측정한 결과 6.4ppm이었다. 통기를 정지하고 그 순수중에서 얻어진 습균체의 단체 200g을 가하여 100rpm 정도로 가볍게 교반을 행하고 40℃하 현탁액중의 DO농도를 연속하여 측정한 결과 DO농도는 15분간에 빠르게 0ppm까지 하강하였다. 다음에, 전술한 것과 마찬가지로 미니쟈파멘타에 순수 1080g을 사입하고 글리신 300.4g(4mol)을 가하고, 40℃하에서 교반 용해한 후 NaOH 2.3g을 가해 pH=7.5로 조정하였다. 그후 1vvm, 600rpm으로 통기, 교반을 행하고 용존산소를 포화시켰다. 통기를 중단하고 교반을 100rpm으로 하여 그 용액중에서 전술한 것과 같이 습균체 221.8g을 가하고 20분 후의 액중의 용존산소를 측정한 결과 0ppm이었다.

무통기상태로 40℃에서 17시간 100rpm으로 교반을 계속하고 글리신 처리액을 행하고, 처리가 끝난 용액 약 1500g중의 DO농도를 측정한 결과 0ppm이었다. 교반회전수를 400rpm으로 올리고 글리신 처리액 1500g중으로 공기를 3/min으로 흡입하고, DO농도가 포화(6.5ppm)에 달한 시점에서 공기의 흡입을 정지하고, 그것에 의해 글리신 처리액중의 DO농도가 0에 이르기까지의 시간을 측정한 결과 11분이 소요되었다.

또한, DO농도를 포화에 가까운 상태(6.5ppm)에서 공기의 흡입을 계속하여 효소 소비량의 경시변화를 나타내는 제1도에서 나타내는 것과 같이, 글리신 처리직후의 산소 소비량을 100%라고 할때 공기 흡입처리 시간을 지나면 모두 산소 소비량은 감소했다.

DO측정은 마르비센지사제의 용존산소지시계(DY-2형 ; 가르바니전극 타입)를 사용했다.

[실시예 1]

실험예 1에 표시한 방법으로 에세리피아·콜리 MT-10350균주를 배양한 균체를 원심분리에 의해 닙균하였다. 얻어진 균체 40g은, 용존산소 농도계, pH계, 교반기, 스파쟈가 부착된 통기 노즐 및 온도 조절기가 부착된 1플라스크에 125g의 증류수에 36g 글리신을 용해하고, pH를 7.5로 조정한 용액중에 가했다. 40℃에서 16시간 무통기 상태로 가벼운 교반을 행한후, 용존산소농도가 1ppm이상 도도록 40℃에서 4시간 통기를 행했다.

이렇게 하여 얻어진 통기처리액 200g은 포르말린 피드용 펌프 및 pH계, 교반기, 온도 조절기가 부착된 2-반응기에 700g의 증류수에 340g의 글리신, 1.0g의 테트라히드로 염산 및 20mg의 피리독살린산을 혼합한 반응용액에 가했다.

통기 처리액을 가한후, 반응용액을 50℃에 가온하여 pH를 6.7이 되도록 NaOH로 조정하였다. 그리고 반응용액중의 포르말린 농도를 다음식을 만족하는 허용범위 ; [(포르말린 농도 mM)=(20mM+(10mM)·(반응경과 시간)]이하로 되도록 제어하여 반응을 행하였다.

한편, 반응액의 pH를 1N-NaOH의 첨가로 pH 6.6으로 유지했고, 반응시간은 35시간 행하였다. 소정시간 반응후 반응액 중의 L-세린 및 글리신 농도를 HPLC로 분석을 행하여 425g의 L-세린의 생성을 확인했다.

반응종료후, 반응액에 황산을 가해 pH를 4.0으로 하고, 활성탄 21.3g(PMSX삼정제약 제)을 가해 90℃에서 1시간 가열후 열여과를 행하고, 여액을 반응액의 1/2량까지 감압 농축하고 냉각 결정석출후 여과하였다.

여별한 결정을 건조후, 127.5g의 L-세린을 얻었다. L-세린은 순도 99.4%, 선광도 +15.2이었다. 에세리피아·콜리(MT-10351)도 같은 모양으로 조작을 행하여 표 4의 결과를 얻었다.

[표 4]

대 포르말린 수율

생성 L-세린(mol)/소비포르말린(mol)

세린 선택율

생성 L-세린(mol)/소비 글리신(mol)

[실시예 2]

에세리피아·콜리 MT-10350을 실험예 2와 같은 모양으로 배양집균후, 습균체를 증류수에 균체농도가 2.5%(건조균체의 중량 %)가 되도록 현탁하고, pH를 7.5가 되게 NaOH로 조정후, 40℃에서 용존산소농도를 1-4ppm이 유지되도록 하고 4시간, 통기교반을 행하였다. 다음에 초음파 파쇄기에서 균체를 파쇄처리하고, 처리후의 SHMT활성을 측정한 결과, SHMT활성은 200u/ml이었다. 375g의 글리신, 1.00g의 테트라히드로염산 및 20mg의 피리독살린산을 700g의 증류수에 가하고 pH를 6.7이 되도록 NaOH로 조정하고, 50℃에서 가온한 기질용액을, pH계, 교반기, N₂가스흡입노즐, 포르말린피드용 펌프 및 pH계, 교반기, N₂가스흡입노즐, 포르말린피드용펌프 및 온도조절기가 부착된 차광 2플라스크에 넣었다.

다시 균체파쇄통기처리액 250g을 가한 후, 포르말린피드용펌프에 의해 포르말린 수용액을 불연속적으로 첨가하였다. 포르말린의 첨가속도는 반응액중의 포르말린 농도를 분석하면서 당해 포르말린 농도를 실시예 1과 같은 모양으로 제어하여 행하였다.

또한, 반응액의 pH를 2N-NaOH수용액을 첨가해 pH 6.6으로 유지하였다. 반응은 35시간 행하고, 소정시간 반응후 반응액중의 L-세린 농도 및 글리신 농도의 분석을 HPLC로 행하였다. 410.0g의 L-세린의 생성을 밝혀내고 표 5에 표시한 반응성적을 얻었다.

에세리피아·콜리 MT-10351도 같은 모양의 조작을 행하고 표 5의 결과를 얻었다.

[표 5]

비교예 1

실험예 1에 표시한 방법으로 에세리피아·콜리 MT-10350의 균주를 배양한 균체를 원심분리에 의해 집균하였다. 얻어진 습균체 40g은, 용존산소농도계, pH계, 교반기, 스파쟈 부착 통기노즐 및 온도조절기가 부착된 1플라스크에서 125g의 증류수에 36g의 글리신을 용해하고, pH를 7.5로 조정한 용액중에 가했다. 40℃에서 20시간 무통기상태로 가벼운 교반을 행했다.

다음에 340g의 글리신, 1.0g의 테트라히드로염산 및 20mg의 피리독살린산 및 700g의 증류수를 2반응기에 넣고 포르말린피드용 펌프 및 pH계, 교반기, 온도조절기를 2반응기에 설치하고, 200g의 무통기 처리액을 가했다. 반응용액을 50℃로 가온하고 pH를 NaOH로 6.7로 조정하였다. 이어서 반응액중의 포르말린농도를 분석하면서 반응액중의 포르말린 농도를 다음 식을 만족하는 허용범위 ; [(포르말린농도mM) = (20mM) + (10mM)·(반응경과시간)] 이하가 되도록 제어하여 반응을 행하였다. 한편, 반응액의 pH를 1N-NaOH첨가하여 6.6으로 유지했고 반응은 35시간 행하였다. 소정시간 반응 후, 반응액중의 L-세린 및 글리신 농도를 HPLC로 분석하였다. 245.6g의 L-세린의 생성이 확인되었고, 표6에 표시한 결과를 얻었다.

[표 6]

비교예 2

비교예 1에 있어서, pH조정을 2M-KOH 수용액으로 실시했다. 반응성적을 표-7에 표시한다.

[표 7]

비교예 3

에세리피아·콜리 MT-10350을 실험예 2와 같은 모양으로 배양 집균후, 습균체를 증류수에 균체농도가 2.5%(건조균체의 중량 %)가 되도록 현탁하고, pH를 7.5가 되도록 NaOH로 조정후, 용존산소농도가 0ppm이 되도록 N₂로 통기하면서, 40℃에서 4시간 통기교반을 행하였다. 이어서 초음파 분쇄기에서 균체를 파쇄처리하고, 처리후의 SHMT활성을 측정한 결과, SHMT활성은 200u/ml이었다. 375g의 글리신, 1g의 테트라히드로염산, 20mg의 피리독살린산을 700g의 증류수에 가하고, pH를 6.7로 NaOH로 조정하고 50℃로 가온한 기질용액을, pH계, 교반기, N₂가스흡입노즐, 포르말린피드용펌프 및 온도조절기가 부착된 차광2 플라스크에 넣고, 균체 파쇄통기처리액을 250g가하고, 포르말린피드용 펌프에 의해 포르말린 수용액을 불연속적으로 첨가하였다. 포르말린의 첨가속도는 반응액중의 포르말린 농도를 분석하면서 당해 포르말린 농도를 실시예 1과 같은 모양으로 억제시켜 반응하였다. 또한 반응액의 pH조정을 2N-NaOH 수용액 첨가로 조정하여 pH 6.6으로 유지하였다.

반응은 35시간 행하고, 소정시간 반응후, 반응액중의 L-세린 농도 및 글리신 농도의 분석을 HPLC로 행하였다. 222.4g의 L-세린 생성을 확인하고 표 8에 표시한 반응성적을 얻었다.

[표 8]

Claims

효소 세린히드록시메틸트란스퍼라제 활성을 가지는, 미생물의 세포 또는 세포처리물의 존재하, 글리신과 포름알데히드에 의해 L-세린을 제조하는 방법에 있어서, 상기 세포현탁액 혹은 상기 세포처리물용액을 60℃ 이하의 온도에서 잔존산소농도가 1ppm이상 존재하는 조건하에서 전처리된 상기 효소활성을 지니는 미생물의 세포 또는 세포처리물을 이용함을 특징으로 하는 L-세린의 제조방법.