JPH03206892A - 酵素法によるｌ―セリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｌ−セリンの製造法に関し、更に詳しくはセ
リンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する
微生物細胞、もしくは細胞処理物の存在下で、グリシン
とホルムアルデヒドから酵素法によりＬ−セリンを製造
する方法に関するものである。

〔従、来の技術〕

Ｌ−ｔｊリンは医薬品、化粧品、化学原料等に利用され
るアミノ酸であり、現在は化学的合成法またはグリシン
を前駆体とする発酵法により製造されている。

しかしながら、化学合成法の場合はＤＬ体が合成される
ためにＬ体のみを得るには光学分割しなければならない
という欠点があり、又、グリシンを前駆体とする発酵法
には蓄積量、収率、精製、廃水処理等に電点があり、こ
れらの方法は実用上有利な方法とは言い難い。

これらの方法に代わって最近は、セリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼ（ＥＣ２，１，２，１，以下ｒｓ
ＨＭＴＪと称する）を利用し、グリシンとホルムアルデ
ヒドからＬ−セリンを酵素的に合成する方法が注目され
ている。

更には、遺伝子操作により微生物のＳＨＭＴ活性を向上
させる方法も知られている（Ｇｅｎｅ、　１４．　ｐ６
３〜７２（１９８１）、　Ｇｅｎｅ、　２７．　ｐ４７
〜５４（１９８４））ので、工業的には微生物の生産す
るＳＨＭＴを利用する方法は、将来−層有利であると期
待されている。

ＳＨＭＴを利用して酵素法によりグリシンとホルムアル
デヒドからし一セリンを工業的に有利に製造する方法と
しては、ＳＨＭＴ活性を有する微生物または、微生物の
細胞を、グリシン溶液と接触させた後Ｌ−セリン反応に
使用する方法が知られている。

（特開昭６ｌ−９２９４）　　Ｉ、かじながら、微生物
にはセリン分解酵素活性（以下ＳＤ活性と称する）の存
在も知られている。〔例えばＬ−セリンデヒドラターゼ
（■５ｈｉｚｕｔａ　Ｙ、　ａｎｄ　Ｔｏｋｕｓｈｉｇ
ｅ　Ｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
　１７Ｂ　ｐ５７５Ｎｐ５８０．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　
ＰｒｅｓｓＩｎｃ−Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７１） ■Ｂｕｒｎｓ、　Ｒ，０，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎ
ｚｙｎｏｌｏｇｙ　Ｌ７ＢＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７１）■Ｋｕｂｏｔａ　、
に、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
　ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６７、　（６
）　ｐ３９１−ｐ３９４（１９８９）））該ＳＤ活性は
酵素法Ｌ−セリンの製造法において次のような問題点を
生じる。

■　生成したし一セリンが分解され反応収率（対原料グ
リシン収率）が低下する。

■、Ｌ−セリン分解生成物によりＬ−セリン生成反応が
抑制されセリン蓄積量が低下する。

このため、ＳＤ活性の低下した微生物変異株を用いてＬ
−セリンを効率よく製造する方法が知られている。〔文
献（■Ｋｕｂｏｔａ、　Ｋ、　Ａｇｒｉｃ　Ｂｉｏｌ　
Ｃｈｅｗ。

４９Ｐ７〜Ｐ１２　（１９８５）））　Ｉ、かしながら
、ＳＤ失活変異株を造成することは容易なことではなく
、復元株の出現といった問題があり、工業的規模での方
法としては問題があった。

また、セリン分解活性の抑制法については、特開昭５８
−１２９９７２号公報、特開昭５８−１２９９７５号公
報に開示されているが、いずれも菌体を４０〜６０℃の
特定温度条件下、１０〜３０分間の短時間処理するもの
で、短時間処理により成果を得ようとするものであるが
１本発明で使用する微生物に於いてはセリン分解活性の
抑制効果としては十分なものではないという問題点を見
出した。

〔発明が解決しようとする課題〕

このような状況のもとに本発明者らは、ＳＨＭＴ活性を
有すると同時にＳＤ活性も有している微生物の培養液、
菌体もしくは菌体処理物を用いて、グリシンとホルムア
ルデヒドよりＬ−セリンを製造するに当たり、その細胞
、もしくは細胞処理物中に存在するＳＤ活性を、ＳＨＭ
Ｔ活性の低下は極力抑えながら、選択的に低下させる方
法を確立することを目的とし、該Ｓ　ＨＭ　Ｔ酵素活性
を有する微生物の細胞もしくは細胞処理物を用いて、Ｌ
−セリンを製造する方法を鋭意検討した。

その結果、ＳＨＭＴ活性を有すると同時にＳＤ活性も有
している微生物の細胞懸濁液もしくは細胞処理物溶液を
６０℃以下の温度で溶存酸素がＩＰＰ■以上存在する条
件で前処理すると選択的にＳＤ活性を低下させることを
見い出し１以上の処理を施した該微生物の細胞もしくは
細胞処理物を用い、グリシンとホルムアルデヒドよりＬ
−セリンを効率よく製造する方法を完成した。

即ち、本発明は酵素セリンヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼ活性を有する、微生物の細胞もしくは細胞処理
物の存在下、グリシンとホルムアルデヒドより、Ｌ−セ
リンを製造する方法において、細胞懸濁液もしくは細胞
処理溶液を６０℃以下の温度で溶存酸素濃度が１　ｐｐ
ｍ以上に保たれるように懸濁液または細胞処理溶液に酸
素又は空気を溶解し、前処理した該酵素活性を有する微
生物の細胞もしくは細胞処理物を用いる事を特徴とする
、Ｌ−セリンの製造方法である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明において用いられる微生物は、ＳＨＭＴ活性を有
するものであればよく、このような微生物の例としては
、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）ＭＴ−１０３５０（ＦＥＲＭ　Ｐ−７４３７、ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−７９３）、エシェリヒア・コリＭＴ−１０
３５１（ＦＥＲＮ　Ｐ−７４３８，ＦＥＲＭＢＰ−７９
４）をあげることができる。

本発明において用いられる微生物の培養に当たっては、
使用菌株の利用しうる炭素源、窒素源、無機塩類、有機
栄養物などを含有するものであれば合成培地、天然培地
のいずれも使用できる。培養は通常好気的条件、培養温
度２５〜４０℃、培養液のＰＨ６〜８で行われる。

本発明に於いては、このようにして得られた培養液はそ
のまま遠心分離、濾過等により集菌した細胞又は細胞処
理物を酵素源として用いる。細胞処理物としては、細胞
を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、
溶媒処理、化学的処理、浸透圧処理、自己消化、界面活
性剤処理、酵素処理等により細胞壁の一部もしくは全部
を破砕したもの、これらより得られる酵素画分、細胞及
び細胞抽出物の固定化物などがある。

培養液から細胞を集菌する場合、培養液中の炭素源、た
とえばグルコース等が消費された培養液から集菌される
のが好ましい。

本発明においては、本発明に用いる細胞又は細胞処理物
を６０℃以下、好ましくは３０〜５０℃に保ちつつ、酸
素または空気を通気、あるいは攪拌により、処理液中の
溶存酸素濃度を常に１ρρｍ以上となるように溶解、保
持することにより、細胞内又は細胞処理物中に存在する
ＳＤ活性のみを選択的に低下させることが出来る。

処理温度は３０℃未満ではＳＤ活性の抑制ができない傾
向がある。又、６０℃を越せばＳＤ活性と共に３１１８
７話性も低下するので好ましくない。

処理液中の溶存酸素量は溶媒、溶質によって変化するが
常に処理液中に１　ｐｐｍ以上に溶存酸素があれば十分
である。処理液のｐＨは通常６〜９、処理時間は２〜１
０時間、好ましくは４〜８時間である。

ＳＤ活性失活処理において発泡防止のため通常使用され
る消泡剤を添加してもよい。処理液中にグリシンを添加
して処理することは更に好ましい態様である。以上の前
処理を施したＳ）ＩＭＴ活性を有する細胞又は、細胞処
理物を用いてＬ−セリンの合成を実施する。

本発明のし一セリン合成反応は、ＰＨ６〜９、温度３０
〜６０℃で攪拌条件下で行うのが好ましい。酵素ＳＨＭ
Ｔは補酵素として、テトラヒドロ葉酸とピリドキサルリ
ン酸を要求するので、これらの物質を反応系に添加する
ことによりＬ−セリン反応が高められることがある。な
お１本発明のＬ−セリン反応は、窒素雰囲気または還元
剤存在下に行うことによっても一層促進されることがあ
る。

反応基質であるグリシンの添加量は、反応温度における
飽和溶解度以上でも特に問題ないが、できれば５Ｍによ
り近い濃度の方が好ましい。グリシンの添加方法につい
ては反応開始時に一括添加しても、反応進行にともない
分割添加してもよい。

一方の反応基質であるホルムアルデヒドは、気体で、あ
るいは水溶液として、アルコール溶液として、更には固
形重合物のパラホルムアルデヒドなどの形態で使用する
ことが出来るが、３７〜４３％程度の水溶液であるホル
マリンの使用が好適である。

ホルムアルデヒドはＳＨ九Ｔ酵素活性を阻害しない程度
の濃度で用いなければならず、反応の進行にともない反
応液に分割または連続的に添加する。

本発明方法のし一セリン合成反応は通常ｐＨ６〜９、反
応温度３０〜６０℃、反応時間は５〜４０時間、好まし
くは反応温度４０〜５０℃で２０〜３０時間である。

ｐＨの調整は反応液中にアルカリを添加して実施される
。反応液に添加するアルカリとしては、水酸化リチウム
、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムな、どアルカリ金
属水酸化物の他、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど
水に溶解して液性を塩基性とするものであればよい。

反応の進行は反応液中のＬ−セリン及びグリシン濃度を
液体クロマトグラフィーにより分析し確認できる。

反応終了後の反応液の後処理は、反応液に鉱酸例えば硫
酸、塩酸等を加え液性を酸性側、好ましくはｐＨ５以下
としＬ−セリンを溶解する。この溶液に濾過助剤、例え
ば活性炭等を加え、熱濾過し菌体破砕物等の不純物を除
去する。

濾液は常法により・濃縮し、Ｌ−セリンの結晶を析出さ
せ分離、乾燥しＬ−セリンを得る。

〔発明の効果〕

本発明において最も特徴とする、ＳＤ活性を低下させる
処理の効果によりＬ−セリン合成反応において、■反応
生成したＬ−セリンの分解が抑制され反応収率（対原料
グリシン収率）の低下が抑えられる。■Ｌ−セリン分解
生成物によりＬ−セリン生成反応が抑制されセリン蓄積
量が低下することを防止できる。

〔実施例〕

以下、実施例及び実験例により本発明の詳細な説明する
。

勿論、実施例は本発明を具体的に例証するものであり、
本発明がこの実施例の範囲に限定されるものではない。

実験例１ エシェリヒア・コリＭＴ−１０３５０（微工研菌寄第７
４３７号）の菌株を後述のＬＢ−ＡＰ寒天平板培地に植
菌し、３５℃にて一夜培養を行ない、生育したコロニー
から２白金耳を１５０ａ＋（！のＬＢ−Ａ、Ｐ液体培地
の入った綿栓付き５００ｎＱ坂ロフラスコに接種した。

接種した坂ロフラスコは３５℃にて２０時間振盪培養（
１２０ｒｐｍ）を行ない、所定時間培養後、ＰＴ最小培
地を２０Ｑ仕込んだ３（ＩＱジャーファーメンタ−に移
液して３５℃、通気ｆｆ１ｌｖｖｎ＋、攪拌回転数６０
ＯｒｐｍにてｐＨ６，８にＰＨコントローラーによりア
ンモニア水の添加により制御を行いつつ、殺菌済み４０
％グルコース水溶液を逐時添加しながら４０時間培養を
行った。所定時間培養後、培地中のグルコースが消費さ
れるのを確認して１．直ちに遠心分離機にて集菌を行い
、湿菌体を得た。得られた集菌湿菌体０．４６ｋｇを１
．４３ｋｇの水及び０．４１ｋｇのグリシン溶液中に加
えた。ｐＨをＮａ０１１にて調製し、７．５に合わせ、
攪拌しながら４０℃に１６時間保った。

所定時間混合後、混合液を２倍に希釈してＳＤ活性を測
定し、次いで消泡剤（アデカノール・ＬＧ−１０９旭電
化製）を０．１％濃度に添加し１表−１に示す各溶存酸
素濃度に保たれるように通気量を調整し、通気後、２時
間、４時間口の残存ＳＤ活性及びＳＨＭＴ活性を混合液
を２倍に希釈して測定した。

培地組成 １、　　ＬＢ−ＡＰ　　寒天平板培地 ＢａｃｔｏΔ　トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）　　１０
．０ｇＢａｃｔｏΔ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製＞　　
５．０ｇＮａＣＱ　　　　　　　　　　　１０．０ｇ蒸
留水　　　　　　　　　１０００ｓｅｆｌｐＨ＝７．５
にＮａＯＨにて調整 ＰＨ調整後、寒天１５ｇを加えてオートクレーブ殺菌（
１２０℃、１０分間）Ｌ、６０’Ｃ以下に冷却後、アン
ピシリンを濃度２５μｇ／Ｑになるように無菌フィルタ
ーを通して添加。シャーレに分注し固化させ寒天平板を
作製した。

２、、ＬＢ−ＡＰ　　液体培地 ＢａｃｔｏＡ　トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）　　１０
．０ｇＢａｃｔｏム酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）　　
５．０ｇＮａ１　　　　　　　　　　１０．０ｇ蒸留水
　　　　　　　　１０００ｎ＋ｌ２ｐ）Ｉ＝７．５にＮ
ａＯＨにて調整 ｐＨ調整後、オートクレーブ殺菌（１２０℃、　１０分
間）し、６０℃以下に冷却後、アンピシリンを濃度２５
μｇｚｌｌ　　になるように無菌フィルターを通して添
加した。

３、　　ＰＴ　　最少培地 リン酸１カリウム　　　　　　　　　２．０ｇリン酸２
カリウム　　　　　　　　　２．０ｇＭｇ５０４・７Ｈ
，０２，Ｏｇ （ＮＨ４）２ＳＯ，１，５ｇ Ｌ−フェニルアラニン　　　　　　　２．５ｇＣａＣＱ
２・２Ｈ２０８２Ｈ２Ｏ ８０Ｉ１．　・２８２０　　　　　　　　　　　８１１
ｇＣｏＣＱ、　・６Ｈ，０８ｍｇ ＡＱＣＩＩ、　・６）１２０　　　　　　　　　　　　
　　　　２０ｍｇＨ３ＢＯ，１ｍｇ ＭｎＳＯ４・５８．０　　　　　　　　　　　　　　　
２０ｍｇｚｎＳＯ４・７■２０　　　　　　　　　　　
　　　　４ｍｇＮａ２Ｍｏｂ４・２Ｈ２０４ｍｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０８０ｍｇ 蒸留水　　　　　　　　　　　　　１０００ｎ＋Ｑを混
合し、１２０℃で３０分間殺菌後、０．２μ亀の無菌フ
ィルターにて無菌濾過した塩酸チアミン水溶液をチアミ
ン濃度を５０ｍｇ／　Ｑとなるように添加した。

ＳＤ活性　びＳＨＭＴ活性の測定方法 １、　　ＳＤ活性測定方法 ２．２ｍＱのエッペンドルフ、チューブ中へ、０，１ｍ
Ｑの５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）と０　、６
ｍ１２の３３ｍＭ　Ｌ−セリン水溶液と０．１ｍ１２の
０．ｂａＭピリドキサルリン酸（５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５））と０．１ｍ１２の蒸留水を加え、３０
℃で５分間ブレインキュベーションを行った０次に、そ
の溶液へ、　０．４ｔａＱの菌体処理液を加え攪拌した
後、３０℃で２時間反応した。所定時間終了後、０　、
２＋ａｆｉのトリクロロ酢酸（１５％水溶液）を加えて
反応を停止した。反応液は遠心分離を行い、上清液を１
０倍に希釈し、液体クロマトグラフィー（以下４、ＨＰ
ＬＣと略する）にてＬ−セリンの分析を行った。対照と
して、ブレインキュベーションした後、反応液にトリク
ロロ酢酸を加え、次に、菌体処理液を加えた。所定時間
３０℃で反応を行い、上記と同様に遠心分離を行い上清
液中のＬ−セリン濃度を分析しこれを標準とした。ＨＰ
ＬＣでのＬ−セリンの分析条件は、下記の通りである。

ＨＰＬＣ分析条件（Ｌ−セリン、グリシンの定量）ボス
トラベル法にて分析を行った。移動相は脱気水を用い、
流速を１．０■Ｑ／ｗｉｎに設定した。

発色剤は５０−フタルアルデヒド溶液を流速０．４ｍＱ
／ｗｉｎで通液した。検出器は蛍光検出器を用いて、照
射波長３６５ｎｍ、放射波長４５５ｎｍにて行った。

分離カラムは、５ｈｏｄｅｘ　ＤＭ−６１４（昭和電工
層）を２本直列につないで使用した。

２、　３１＋ＭＴ活性測定方法 ２．２社のエッペンドルフチューブ中へ、０．１ａ＋Ｑ
の５００ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｏｒ（ｐＨ＝７．３）と０
．５ｍＡの１．０Ｍグリシン水溶液と０．３ｍＱの０．
４５％テトラヒドロ葉酸溶液（０，０８％ホルマリンを
含む５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．３）］と０　
、２ｍＱの蒸留水を加え、５０℃で５分間ブレインキュ
ベーションを行った。

次に、その溶液へ０．１＋ａＱの菌体処理液（５０＋＋
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）にて５０倍に希釈処理液
）を加え攪拌した後、５０℃で１０分間反応した。所定
時間終了後、０．３ｎ＋Ｑのトリクロロ酢酸（１５％水
溶液）を加えて反応を停止した。反応液は遠心分離を行
い、上清液を５倍に希釈し、ＨＰＬＣにてＬ−セリンの
分析を行った。ＨＰＬＣのＬ−セリンの分析条件は、上
記の通りである。

実験例２ エシェリヒア・コリＭＴ−１０３５０の菌株を、実験例
１と同様の操作で培養を行い、培養液から遠心分離し湿
菌体を得た。得られた湿菌体を培養液の１７３量の０．
８５％ＮａＣＱ水溶液で洗浄後、再度遠心により集菌し
洗浄菌体を得た。８８．８ｇの洗浄湿菌体を５℃に冷却
したＯ、１Ｍ　ｌ−リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）を
加え８００ｇとした。該懸濁液を２分割し、一方の懸濁
液は超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＭ社製）にて、氷上で
破砕処理を行い、破砕液を更に２分割し、各々の破砕液
を溶存酸素濃度計（東亜電波層）、通気ノズル、攪拌装
置及び温度調節装置を有する容器に注入し、消泡のため
アデカノールＬＧ−１０９ＣＭ電化製）を０．０５％に
なるように添加し、４０℃にて、表−２に示す溶存酸素
濃度になるように一気量を調整し、開始時のＳＨＭＴ活
性およびＳＤ活性を測定した。

また、通気後４時間口の各々の活性を測定し、残存率を
表−２に示す。該懸濁液の残りは超音波処理を行なわず
、更に、これを２分割し、溶存酸素濃度計（東亜電波層
）１通気ノズル、攪拌装置及び温度調節装置を有する容
器に注入し、消泡のためアデカノール＾ＬＧ−１０９（
加電化製）を０．０５％になるように添加し、４０℃に
て、表−２に示す溶存酸素濃度になるように通気量を調
整し処理を行った。

処理４時間後、懸濁液に等量の０．１Ｍ　トリス・塩酸
緩衝液（ｐ）Ｉ　＝　７．５）を加え、超音波破砕機（
ＢＲＡＮＳＯＮ社製）にて氷上で破砕処理を行い、破砕
液のＳＨＭＴ活性およびＳＤ活性を測定した。

実験例３ エシェリヒア・コリＭＴ−１０３５０の菌株を、実験例
１と同様の操作で培養を行い、培養液から遠心分離し湿
菌体を得た。得られた湿菌体を培溶液の１／３量の０．
８５％ＮａＣＱ水溶液で洗浄後、再度遠心分離により集
菌し洗浄菌体を得た。１００ｇの洗浄湿菌体を５℃に冷
却した０、１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を
加え１０００ｇとした。該懸濁液を５分割し各々の懸濁
液を溶存酸素濃度計、通気ノズル、攪拌装置及び温度調
節装置を有する容器に注入し、消泡のためアデカノール
・ＬＧ−１０９（地竜化製）を０．０５％になるように
添加し、表−３に示す溶存酸素濃度になるように通気量
又は攪拌を調整し、２０〜６５℃の温度条件下で４時間
攪拌処理を行った。

処理前及び４時間処理後の各々のＳ）ＩＭＴ活性及びＳ
Ｄ活性を測定し、残存率を表−３に示す。

表−２酵素活性残存率 表−３ 傘　処理時の溶存酵素はすべて５ｐｐｍに制御した。

実験例４ エシェリヒア・コリＭＴ−１０３５０を実験例２と同様
に培養、集菌した湿菌体５００ｇを得た。純水１１６０
ｇを培養に用いる２、６Ｑミニジヤーフアメンター（マ
ルビシェンジ社製・タービン型攪拌羽根付（６翼）に仕
込み４０℃下空気をｌｖｖｍで通気しなから６００ｒｐ
ｍで攪拌しそのＤＯ（溶存酸素）濃度を測定したところ
６．４ｐｐｍだった０通気を停止し、その純水中に得ら
れた湿菌体のうち２００ｇを加えて１１００ｒｐ＋程度
で穏やかに攪拌を行い４０℃下懸濁液中のＤＯ濃度を連
続して測定したところＤＯ濃度は１５分間で速やかに０
ＰＰＩまで下がった。次に、前述と同様のミニジャーフ
ァーメンタ−に純水１０８０ｇを仕込みグリシン３００
．４ｇ（４，ＯＯｍｏｌ）を加え、４０℃下で攪拌溶解
した後、ＮａＯＨ２，３ｇを加えてＰ）Ｉ　＝　７．５
に調整した。その後、ｌｖｖｍ、６００ｒｐｍで通気、
攪拌を行ない、溶存酸素を飽和とした。通気を止め、攪
拌を１１００ｒｐとして、その溶液中へ前述と同様に湿
菌体２２１．８ｇを加えて、２０分後の液中の溶存酸素
を測定したところＯｐｐｍだった。無通気のまま４０℃
で１７時間１１００ｒｐで攪拌を続けてグリシン処理液
を行ない、処理が終わった溶液約１５００ｇ中のＤＯ濃
度を測定したところＯｐｐｍだった。攪拌回転数を４０
Ｏｒｐｍに上げグリシン処理液１５００ｇ中へ空気を３
１／＋ｍｉｎで吹き込み、Ｄｏ濃度が飽和（６，５ｐｐ
ｍ）に達した時点で空気の吹き込みを停止し、それより
グリシン処理液中のＤＯ濃度が０になるまでの時間を測
定したところｌ１ｍ１ｎを要した。

又、ＤＯ濃度を飽和に近い状態（６，５ｐｐｍ）に空気
の吹込みを続けて、酵素消費量の経時変化を調べると添
付の第１図に示すように、グリシン処理直後の酸素消費
量を１００％とすると空気吹き込み処理時間を経ると共
に酸素消費量は減少した。

ＤＯ測定法：マルビシエンジ社製の溶存酸素指示計（Ｄ
Ｙ−２型；ガルバニ電極タイプ）を用いた。

実施例１ 実験例１に示した方法でエシェリヒア・コリＭＴ−１０
３５０の菌株を培養した菌体を、遠心分離により集菌し
た。得られた菌体４０ｇは、溶存酸素濃度計、ＰＨ計、
攪拌機、スーパージャー付通気ノズルおよび温度調整機
の付いたＩＱフラスコに１２５ｇの蒸留水に３６ｇグリ
シンを溶解し、ｐＨを７．５に調整した溶液中へ加えた
６４０℃で１６時間無通気のまま緩やかに攪拌を行ない
、次に、溶存酸素濃度が１　ｐｐｍ以上に保たれるよう
に、４０℃で４時間通気を行った。

このようにして得られた通気処理液２００ｇはホルマリ
ンフィード用ポンプおよびｐＨ計、攪拌機、温度調整機
の付いた２Ｑ−反応器に、前もって調整した７００ｇの
蒸留水に３４０ｇのグリシン、１．ｏｇのテトラヒドロ
葉酸及び２０ｍｇのピリドキサルリン酸を混合した反応
溶液に加えた。

通気処理液を加えた後、反応溶液を５０℃に加温して、
ｐｔ−ｔを６．７にＮａＯＨで調整した。次に、反応液
中のホルマリン濃度を分析しながら、反応液中のホルマ
リン濃度を次式を満たす許容範囲；（（ホルマリン濃度
ｍＭ　＝　（２０ｍＭ　＋　（１０＋ａＭ）申（反応経
過時間））以下になるように制御して反応を行った。

一方、反応液の２１１をｌＮ−ＮａＯＨの添加にてｐＨ
６，６に保った。反応は３５時間行った。所定時間反応
後反応液中のＬ−セリン及びグリシン濃度をＨＰＬＣに
て分析を行い、　４２５ｇのＬ−セリンの生成を認めた
。

反応終了後、反応液に硫酸を加えｐＨを４．０とし、活
性炭２１．３ｇ（ＰＭＳＸ・三井製薬製）を加え９０℃
にて１時間加熱後、熱濾過を行い、濾液を反応液の半分
量まで減圧濃縮し、冷却晶析後、濾過した。

濾別した結晶を乾燥後、１２７．５ｇのし一セリンを得
た。Ｌ−セリンは純度９９．４％、旋光度＋１５．２で
あっ、た。

エシェリヒア・コリ（ＭＴ−１０３５１）も同様の操作
を行い表−４の結果を得た。

表−４反応成積 対ホルマリン収率： 生成Ｌ−セリン（ｍｏｌ）／消費ホルマリン（ｍｏｌ）
セリン選択率： 生成Ｌ−セリン（ｍｏｌ）　／消費グリシン（ｍｏｌ）
実施例２ エシェリヒア・コリＭＴ−１０３５０を実験例２と同様
に培養集菌後、湿菌体を蒸留水に菌体濃度が２．５％（
乾燥菌体の重量％）になるように懸濁し、ＰＨを７．５
にＮａＯＨにて調整後、４０℃にて、溶存酸素濃度を１
〜４ρＰ＠に保ち、４時間、通気攪拌を行なった。次に
、超音波破砕機にて菌体を破砕処理し、処理後のＳＨＭ
Ｔ活性を測定した結果、ＳＨＭＴ活性は２００Ｕ／１１
１２テあった。　３７５ｇ（７）グリシン、１．００ｇ
ノテトラヒドロ葉酸及び２Ｑ醜ｇのピリドキサルリン酸
を７００ｇの蒸留水に加えｐＨを６．７にＮａＯＨで調
整し、５０℃に加温した基質溶液を、ＰＨ計、攪拌機、
Ｎ２ガス吹き込みノズル、ホルマリンフィード用ポンプ
および温度調整機のついた遮光２Ｑフラスコに入れた。

更に、菌体破砕通気処理液２５０ｇ加えた後、ホルマリ
ンフィード用ポンプにより、ホルマリン水溶液を断続的
に添加した。ホルマリンの添加速度は反応液中のホルマ
リン濃度を分析しながら該ホルマリン濃度を実施例１と
同様に制御して行った。

また、反応液のｐＨを２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液の添加にて
行い、ＰＨ６，６に保った。反応は３５時間行い、所定
時間反応後、反応液中のＬ−セリン濃度およびグリシン
濃度の分析をＨＰＬＣにて行った。４１０．０ｇのＬセ
リンの生成を認め、表−５に示す反応成積を得た。

エシェリヒア・コリＭＴ−１０３５１も同様の操作を行
い表−５の結果を得た。

表−５反応成積 比較例１ 実験例１に示した方法でエシェリヒア・コリＭＴ−１０
３５０の菌株を培養した菌体を遠心分離により集菌した
。得られた湿菌体４０ｇは、溶存酸素濃度計、ｐＨ計、
攪拌機、スパージャ−付通気ノズルおよび温度調整機の
ついたＩＱフラスコに１２５ｇの蒸留水に３６ｇグリシ
ンを溶解し、ＰＨを７．５に調整した溶液中へ加えた。

４０℃で２０時間無通気のまま緩やかに攪拌を行った。

次に、　３４０ｇのグリシン、１．０ｇのテトラヒドロ
葉酸及び２０＋ａｇのピリドキサルリン酸及び７００ｇ
の蒸留水を２Ｑ反応器に入れ、ホルマリンフィード用ポ
ンプおよびｐＨ計、攪拌機、温度調整機を２Ｑ反応器に
設置し、２００ｇの無通気処理液を加えた。反応溶液を
５０℃に加温して、　ＰＨを６．７にＮａＯＨで調整し
た。次に、反応液中のホルマリン濃度を分析しながら、
反応液中のホルマリン濃度を次式を満たす許容範囲；（
（ホルマリン濃度ｍＭ）＝（２０ｍＭ）　十（１０ＩＩ
ＩＭ）申（反応経過時間））以下になるように制御して
反応を行った。一方、反応液のＰＨをｌＮ−Ｎａ０）１
の添加にてＰ）１６．６に保った１反応は３５時間行っ
た。所定時間反応後、反応液中のし一セリン及びグリシ
ン濃度をＨＰＣＬにて分析を行い、２４５．６ｇのＬ−
セリンの生成を認めた。これより表−６に示す結果を得
た。

表−６反応成績 比較例２ 比漱例１において、ＰＨ調整を２Ｍ−ＫＯＨ水溶液にて
実施した。反応成績を表−７に示す。

表−７反応成績 比較例３ エシェリヒア・コリＭＴ−１０３５０を実験例２と同様
に培養集菌後、湿菌体を蒸留水に菌体濃度が２．５％（
乾燥菌体の重量％）になるように懸濁と、ＰＨを７．５
にＮａ０ｔ（にて調整後、溶存酸素濃度が０２ｐｍとな
るようにＮ２を通気しながら４０℃にて、４時間通気攪
拌を行なった。次に、超音波破砕機にて菌体を破砕処理
し、処理後のＳ　ＩＩ　Ｍ　Ｔ活性を測定した結果、Ｓ
　ＨＭ　Ｔ活性は２０００／ＩＩＱであった。３７５ｇ
のグリシン、１．０ｇのテトラヒドロ葉酸、２０ｍｇの
ピリドキサルリン酸を７００ｇの蒸留水に加えｐＨを６
．７にＮａＯＨで調整し、５０℃に加温した基質溶液を
、ＰＨ計、攪拌機、Ｎ２ガス吹き込みノズル、ホルマリ
ンフィード用ポンプおよび温度調整機のついた遮光２ｎ
フラスコに入れ、菌体破砕通気処理液を２５０ｇ加え、
ホルマリンフィード用ポンプにより、ホルマリン水溶液
を断続的に添加した。ホルマリンの添加速度は反応液中
のホルマリン濃度を分析しながら該ホルマリン濃度を実
施例１と同様に制御して反応した。

また、反応液のＰＨ調整を、２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液の添
加にて調整し、ＰＨ６，６に保った１反応は３５時間行
い、所定時間反応後、反応液中のＬ−セリン濃度および
グリシン濃度の分析をＨＰＬＣにて行った。　２２２．
４ｇのし一セリンの生成を認め、表−８に示す反応成績
を得た。

表−８反応成績

【図面の簡単な説明】

第１図は実験例４において０〜８時間の処理時間におけ
る酵素消費量（％）をみた図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を
   有する、微生物の細胞もしくは、細胞処理物の存在下、
   グリシンとホルムアルデヒドよりＬ−セリンを製造する
   方法において、該細胞懸濁液もしくは該細胞処理物溶液
   を６０℃以下の温度で溶存酸素濃度が１ｐｐｍ以上存在
   する条件下、前処理した該酵素活性を有する微生物の細
   胞もしくは細胞処理物を用いることを特徴とする、Ｌ−
   セリンの製造方法。