JP4544695B2 - グリシンの微生物学的な製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリシンの微生物学的製造方法に関する。さらに詳しくは、ホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアの反応で得られるグリシノニトリルをマイコバクテリウム属、ロドシュードモナス属、キャンディダ属、クレブシエラ属、またはアクレモニウム属に属する微生物の作用による加水分解反応に付し、閉鎖系の反応条件下もしくは生成するアンモニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で選択的にグリシンを回収することを特徴とするグリシンの微生物学的製造方法に関する。得られるグリシンは食品添加物、洗浄剤、医農薬合成原料として有用である。本発明の製造法は、有用なグリシンを効率よく工業的に製造するため利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
グリシンは、従来、ホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアからシュトレッカー法にて一旦グリシノニトリルを合成し、これを苛性ソーダ等のアルカリで加水分解し、グリシンソーダとアンモニアに変換した後、硫酸等の酸で中和し製造されている。この時、アンモニアはアルカリで加水分解される際、蒸発して回収され、グリシンは酸で中和後、晶析法で回収される（特開昭４３−２９９２９号、特開昭５１−１９７１９号、特開昭４９−１４４２０号、特開昭４９−３５３２９号明細書）。このように従来法は、アルカリや酸を多量に用いる欠点に加え、中和工程で塩類が多量に副成されるため、廃棄物が多く環境負荷が大きい欠点があった。さらに、中和副成する塩類はグリシンに溶解度が酷似しているため、グリシンを精製回収するためには、晶析操作を複数回繰り返したり母液を循環する等の煩雑な操作が必要であった（特開昭５１−３４１１３号）。
【０００３】
一方、グリシノニトリルを酵素的に加水分解してグリシンを得る方法も知られている。特公昭５８−１５１２０号においては、ブレビバクテリウム R312株を苛性カリ等でｐＨ８に調整した反応液に懸濁し加水分解反応に用いる方法が、また、特開平３−６２３９１号においては、コリネバクテリウムN-774 株をリン酸緩衝液でｐＨ７．７に調整した反応液に懸濁し反応に用いる方法が開示されている。しかし、これらの方法は、実施例によると、グリシンを得るためにはグリシン重量の１倍から１０倍に相当する多量の菌体を用いる必要があり、さらに、反応液のｐＨを調整するため、緩衝液が用いられる問題があった。すなわち、多量の菌体を用いるため、培地や菌体を多量に浪費する欠点があり、また、ｐＨ調整剤として緩衝液を用いるため、緩衝液消費や廃棄が避けられない欠点があった。さらに、緩衝液はアンモニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨げる問題もある。ロドコッカス属、アルスロバクター属、カセオバクター属、シュードモナス属、エンテロバクター属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、コリネバクテイリア属、またはストレプトマイセス属の微生物を用いる特開平３−２８０８８９号においては、菌体使用量は生成グリシン重量の約２０分の１に改良されているが、反応時間が約４０時間と長い欠点があり、さらに、緩衝液を反応に用いる問題は解決されていない。
【０００４】
このように、従来の微生物を用いたグリシノニトリルからグリシンを生産する方法は、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たりの活性が低いため、菌体や培地を多量に消費し廃棄する欠点があった。さらに、反応液のｐＨを調整するために緩衝液や酸またはアルカリを消費し、シュトレッカー法と同様に、それらの廃棄が避けられない欠点を持っていた。また、従来の微生物を用いた方法ではアンモニアを回収する工夫は開示されていないが、緩衝液や酸を用いると、緩衝液や酸がアンモニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨げる問題に加え、酸またはアルカリを使用すると、シュトレッカー法と同様に、グリシンの回収をを妨げることが予想される。このように従来の微生物を用いる方法も、工業的に実施できるものではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微生物を用いホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られるグリシノニトリルからグリシンを生産するにあたり、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活性であって、菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わなず、グリシンとアンモニアを別々に回収するグリシンの製造法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、このような工業的諸問題を解決するため、菌体当たり、かつ単位時間当たり高い活性を持ち、反応系で生成したグリシンやアンモニアを分解または消費せず、グリシンとアンモニアを別々に、定量的に、かつ容易に回収できる反応系を構築すべく、適した微生物の探索と反応方法の検討を鋭意行った。驚くべきことに、グリシノニトリルの水溶液にマイコバクテリウム属、ロドシュードモナス属、キャンディダ属、クレブシエラ属、またはアクレモニウム属に属する微生物を作用させることにより、単位時間当たり高い活性でグリシンが得られることを見いだし、本発明をなすに至った。
すなわち、本発明は、グリシノニトリルの水溶液にマイコバクテリウム属、ロドシュードモナス属、キャンディダ属、クレブシエラ属、またはアクレモニウム属に属する微生物を作用させることを特徴とするグリシンの製造法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明において用いるグリシノニトリルは、公知の方法で合成することができる。例えば、ホルムアルデヒドと青酸およびアンモニアから得る方法、あるいはホルムアルデヒドと青酸を反応させ一旦グリコロニトリルを合成し、継いでアンモニアを作用させて得る方法で合成される。どちらも、シュトレッカー法として総称されている。
【０００８】
本発明においては、使用する微生物として、マイコバクテリウム(Mycobacterium) 属、ロドシュードモナス(Rhodo pseudomonas) 属、キャンディダ(Candida) 属、クレブシエラ(Klebciella)属、またはアクレモニウム(Acremonium)属に属する微生物が適していることを新たに発見したものである。
本発明に適した微生物として具体的には、マイコバクテリウム エスピー ＡＣ７７７（FERM BP-2352 ）、ロドシュードモナス スフェロイデス ATCC 11167 、キャンディダ トロピカリス ATCC 20311 、クレブシエラ エスピーＤ５Ｂ（微工研菌寄 第８９３３号）、アクレモニウム エスピー Ｄ９Ｋ（微工研菌寄 第８９３０号）の微生物を使用できる。これらの菌株は、いずれも特開平２−８４１９８、特開昭６３−２０９５９２に記載されている。
【０００９】
本発明に使用される微生物の培養には、通常用いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリン、有機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、窒素源としては、アンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩および有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス等が用いられる。また、培地にはリン酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加される。培養はｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で好気的に行われる。本発明の微生物の培養において、上記の培地に酵素誘導剤を加えてもよい。例えば、ラクタム化合物（γ−ラクタム、δ−ラクタム、ε−カプロラクタム等）、ニトリル化合物、アミド化合物等を用いてもよい。
【００１０】
本発明の微生物は、そのまま工業使用できるが、適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしくは遺伝子工学的手法により改良された変異株、例えば、酵素を構成的に生産する変異株を育成し用いることもできる。本発明の菌体とは、培養液から採取した菌体または菌体処理物（菌体の破砕物、菌体破砕物より分離した酵素、および菌体または菌体から分離抽出された酵素を固定化した処理物）である。培養液からの菌体の採取は、公知の方法で行うことができる。
【００１１】
本発明においては、上述の方法で分離した菌体および菌体処理物は、一旦、蒸留水や緩衝液に懸濁して保存することができる。この場合、反応後の廃棄物を減らす上で蒸留水を用いることが好ましい。また、保存安定化のためにグリシン等の安定剤を保存液に添加することができる。この場合も、反応後の廃棄物を減らす上でグリシンを用いることが好ましい。こうして得られた菌体および菌体処理物の懸濁水溶液にグリシノニトリルを添加するか、または得られた菌体および菌体処理物の懸濁水溶液、あるいは菌体および菌体処理物を直接、グリシノニトリル水溶液に添加するすることにより、速やかに加水分解反応が進行しグリシンを製造することができる。
【００１２】
すなわち、通常、前記微生物菌体または菌体処理物を、例えば、乾燥菌体換算で０．０１から５重量％、基質のグリシノニトリルを１から３０重量％を反応装置に仕込み、温度として例えば０〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃にて、反応時間を例えば１〜２４時間、好ましくは３〜８時間反応させればよい。この場合、グリシノニトリルを薄い濃度で仕込み経時的に追加添加したり、反応温度を経時的に変化させてもよい。また、グリシノニトリルの着色を防止する目的で、グリシノニトリルに対し０．００１〜８ｍｏｌ％亜硫酸塩や蟻酸等の還元性の化合物、アスコルビン酸等の還元性生化学化合物を添加することができる。
【００１３】
こうしてグリシノニトリルが加水分解され、グリシンと同時にアンモニアが生成し、反応液のｐＨは反応前に比べ反応後は増加する。このように反応の進行に伴いｐＨが増加するのを抑えるため、反応前に緩衝液を添加したり、反応中に酸またはアルカリを添加することができる。しかし、反応後の廃棄物を減らす上では、こうした緩衝液、酸やアルカリを反応液に添加しないことが好ましい。反応を開放型の反応器で実施することができるが、生成するアンモニアの飛散による環境汚染の防止ならびに貴重なアンモニアを回収する目的で、密閉型の反応容器を用い閉鎖的反応条件で生成するアンモニアを、応容器中に一旦蓄積することが好ましい。この場合、ｐＨの上昇を抑えるために、生成するアンモニアを反応と同時に分離する反応分離装置を付属することがさらに好ましい。こうしたアンモニアの反応分離法としては、アンモニアの反応蒸留法や不活性ガスの流通法で実施することができる。
【００１４】
反応蒸留を行う場合、加水分解反応装置に、アンモニアと同伴する水を冷却回収する冷却器の付いた単管搭、棚段搭、または充填塔を備え、反応水溶液の沸騰圧以上、例えば、６０℃で２０．０ｋＰａ以上から０℃で０．６ｋＰａ以上の圧力条件下で、連続的にまたは間欠的に減圧反応蒸留することが好ましい。さらに好ましくは、１２．６ｋＰａから１．３ｋＰａの圧力条件下で減圧反応蒸留することができる。不活性ガスを流通する場合、不活性ガスの吹き込みノズルと、アンモニアや同伴する水を不活性ガスから回収する冷却トラップとを備え、微加圧から減圧条件下で連続的にまたは間欠的に、アンモニアを不活性ガスに同伴し反応液から分離することができる。さらに、アンモニア分離を促進するため、減圧反応蒸留を不活性ガス流通条件下で行うこともできる。反応方式はバッチ型方式や流通型反応方式、またはこれらを組み合わせた方式で行うことができる。
【００１５】
かくして、グリシノニトリルは、ほぼ１００％のモル収率で加水分解し、生成するアンモニアの全部は密閉型反応容器中に、一旦、グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度水溶液として生成蓄積させることができる。また、生成するアンモニアの全部または殆どは、反応と同時に反応蒸留法や不活性ガスの流通法で反応液から分離し冷却回収される。もし、グリシンアミドが残存する場合は、グリシンアミドの加水分解活性をもつ菌体もしくは酵素を追添加することにより、完全にグリシンおよびアンモニアに転換することも可能である。グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度水溶液からのグリシンの回収は、例えば、反応液から菌体を遠心濾過、膜分離等によって除いた後、グリシンは晶析法、イオン交換法または貧性溶媒による分別沈澱法にて回収できる。また、アンモニアは一部の水と一緒に蒸発後、蒸留や抽出によって回収することができる。
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、これらの実施例に制限されるものではない。
【００１６】
【実施例１】
酸素の混入を防ぐため、全ての反応操作は窒素雰囲気下で行い、反応に用いる全ての水溶液は約５℃に冷却し窒素ガスで一旦加圧後、再び常圧に戻す操作を数回繰り返し空気との置換を行った。
（１）グリシノニトリルの合成
窒素雰囲気下でホルマリンに等量の青酸をを作用させて一旦生成したグリコロニトリル水溶液に、過剰量のアンモニア水溶液を添加し、２時間反応を行った後、未反応のアンモニアと過剰の水を減圧除去し、３０重量％グリシノニトリル水溶液を得た。
【００１７】
（２）菌体の培養
マイコバクテリウム エスピー ＡＣ７７７株を、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
ε−カプロラクタム ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
【００１８】
(2) 培養条件
３０℃／１日
(3) グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。密閉した１００ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として１０３ｍｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを１７ｍｌの蒸留水に調合し、２０℃にて反応を開始した。反応開始２時間後、ｐＨは１０になっていた。この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成していた。
【００１９】
そこで、２時間毎に反応温度を５℃昇温し、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを追加添加し、反応液を液体クロマトグラフィー法で分析した。この操作を４回切り返し、合計１０時間反応を行った。得られた３２ｇの反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアはネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンとアンモニアが定量的に生成していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は５８ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は５．８ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの３０ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し、４．９ｇのグリシンを晶析回収した。一方、冷却回収した蒸発水溶液中のアンモニアは１．２５ｇであった。
【００２０】
【実施例２】
実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。
（１）菌体の培養
ロドシュードモナス スフェロイデス ATCC 11167 を、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
ε−カプロラクタム ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
(2) 培養条件
３０℃／１日
【００２１】
（２）グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフラスコに、ドライアイストラップを経て減圧ポンプに接続した単管型の蒸留塔、圧力センサー、温度計、および液送ポンプに接続したサンプリング管を備えた。このセパラブルフラスコに乾燥菌体量として１．７１ｇを仕込み、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０ｍｌを調合した。減圧ポンプでフラスコ内の圧力を１０ｋＰａに調整し、３０℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析したところ、グリシノニトリルが消失し、グリシンが定量的に生成していた。
【００２２】
そこで、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌを追加添加した。
１時間毎にこの操作をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイストラップには固体が２０ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９８ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成しトレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は３５ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は７ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの２９６ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して、５６ｇのグリシンを晶析回収した。
【００２３】
【実施例３】
実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。
（１）菌体の培養
キャンディダ トロピカリス ATCC 20311 を、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
ε−カプロラクタム ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
(2) 培養条件
３０℃／１日
【００２４】
（２）グリシノニトリルの加水分解
（１）で得られた乾燥菌体１．８２ｇを用いる以外は、実施例２と同様の操作を行った。ドライアイストラップには固体が２０ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９６ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成しトレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は３３ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は６．６ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの２９４ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して、５６ｇのグリシンを晶析回収した。
【００２５】
【実施例４】
実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。
（１）菌体の培養
クレブシエラ エスピー Ｄ５Ｂを、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
ε−カプロラクタム ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
【００２６】
(2) 培養条件
３０℃／１日
(3) グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ドライアイストラップに接続したミストセパレーター、温度計、およびサンプリング管を備えた。このセパラブルフラスコに乾燥菌体量として１．８８ｇを仕込み、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素ガスを１時間当たり３リットルフィードしながら、３０℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成していた。
【００２７】
そこで、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌを追加添加した。
この操作をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイストラップには固体が１５ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９１ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成しトレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は３２ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は６．４ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの２８９ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して、５６ｇのグリシンを晶析回収した。
【００２８】
【実施例５】
実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。
（１）菌体の培養
アクレモニウム エスピー Ｄ９Ｋを、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
イソブチロニトリル ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
(2) 培養条件
３０℃／１日
【００２９】
（２）グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ドライアイストラップを経て減圧ポンプに接続した単管型の蒸留塔、圧力センサー、温度計、および液送ポンプに接続したサンプリング管を備えた。このセパラブルフラスコに乾燥菌体量として１．７４ｇを仕込み、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素ガスを１時間当たり３リットルフィードしながら、減圧ポンプでフラスコ内の圧力を１０ｋＰａに調整し、３０℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析したところ、グリシノニトリルが消失しグリシンが定量的に生成していた。
【００３０】
そこで、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌを追加添加した。
２時間毎にこの操作をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイストラップには固体が２５ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９２ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成しトレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は３５ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は６．９ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの２９０ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して、５６ｇのグリシンを晶析回収した。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の製造方法は、グリシノニトリルの水溶液にマイコバクテリウム属、ロドシュードモナス属、キャンディダ属、クレブシエラ属、またはアクレモニウム属に属する微生物を作用させることで、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的かつ別々に回収できる効果を有する。
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリシンの微生物学的製造方法に関する。さらに詳しくは、ホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアの反応で得られるグリシノニトリルをマイコバクテリウム属、ロドシュードモナス属、キャンディダ属、クレブシエラ属、またはアクレモニウム属に属する微生物の作用による加水分解反応に付し、閉鎖系の反応条件下もしくは生成するアンモニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で選択的にグリシンを回収することを特徴とするグリシンの微生物学的製造方法に関する。得られるグリシンは食品添加物、洗浄剤、医農薬合成原料として有用である。本発明の製造法は、有用なグリシンを効率よく工業的に製造するため利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
グリシンは、従来、ホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアからシュトレッカー法にて一旦グリシノニトリルを合成し、これを苛性ソーダ等のアルカリで加水分解し、グリシンソーダとアンモニアに変換した後、硫酸等の酸で中和し製造されている。この時、アンモニアはアルカリで加水分解される際、蒸発して回収され、グリシンは酸で中和後、晶析法で回収される（特開昭４３−２９９２９号、特開昭５１−１９７１９号、特開昭４９−１４４２０号、特開昭４９−３５３２９号明細書）。このように従来法は、アルカリや酸を多量に用いる欠点に加え、中和工程で塩類が多量に副成されるため、廃棄物が多く環境負荷が大きい欠点があった。さらに、中和副成する塩類はグリシンに溶解度が酷似しているため、グリシンを精製回収するためには、晶析操作を複数回繰り返したり母液を循環する等の煩雑な操作が必要であった（特開昭５１−３４１１３号）。
【０００３】
一方、グリシノニトリルを酵素的に加水分解してグリシンを得る方法も知られている。特公昭５８−１５１２０号においては、ブレビバクテリウム R312株を苛性カリ等でｐＨ８に調整した反応液に懸濁し加水分解反応に用いる方法が、また、特開平３−６２３９１号においては、コリネバクテリウムN-774 株をリン酸緩衝液でｐＨ７．７に調整した反応液に懸濁し反応に用いる方法が開示されている。しかし、これらの方法は、実施例によると、グリシンを得るためにはグリシン重量の１倍から１０倍に相当する多量の菌体を用いる必要があり、さらに、反応液のｐＨを調整するため、緩衝液が用いられる問題があった。すなわち、多量の菌体を用いるため、培地や菌体を多量に浪費する欠点があり、また、ｐＨ調整剤として緩衝液を用いるため、緩衝液消費や廃棄が避けられない欠点があった。さらに、緩衝液はアンモニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨げる問題もある。ロドコッカス属、アルスロバクター属、カセオバクター属、シュードモナス属、エンテロバクター属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、コリネバクテイリア属、またはストレプトマイセス属の微生物を用いる特開平３−２８０８８９号においては、菌体使用量は生成グリシン重量の約２０分の１に改良されているが、反応時間が約４０時間と長い欠点があり、さらに、緩衝液を反応に用いる問題は解決されていない。
【０００４】
このように、従来の微生物を用いたグリシノニトリルからグリシンを生産する方法は、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たりの活性が低いため、菌体や培地を多量に消費し廃棄する欠点があった。さらに、反応液のｐＨを調整するために緩衝液や酸またはアルカリを消費し、シュトレッカー法と同様に、それらの廃棄が避けられない欠点を持っていた。また、従来の微生物を用いた方法ではアンモニアを回収する工夫は開示されていないが、緩衝液や酸を用いると、緩衝液や酸がアンモニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨げる問題に加え、酸またはアルカリを使用すると、シュトレッカー法と同様に、グリシンの回収をを妨げることが予想される。このように従来の微生物を用いる方法も、工業的に実施できるものではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微生物を用いホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られるグリシノニトリルからグリシンを生産するにあたり、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活性であって、菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わなず、グリシンとアンモニアを別々に回収するグリシンの製造法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、このような工業的諸問題を解決するため、菌体当たり、かつ単位時間当たり高い活性を持ち、反応系で生成したグリシンやアンモニアを分解または消費せず、グリシンとアンモニアを別々に、定量的に、かつ容易に回収できる反応系を構築すべく、適した微生物の探索と反応方法の検討を鋭意行った。驚くべきことに、グリシノニトリルの水溶液にマイコバクテリウム属、ロドシュードモナス属、キャンディダ属、クレブシエラ属、またはアクレモニウム属に属する微生物を作用させることにより、単位時間当たり高い活性でグリシンが得られることを見いだし、本発明をなすに至った。
すなわち、本発明は、グリシノニトリルの水溶液にマイコバクテリウム属、ロドシュードモナス属、キャンディダ属、クレブシエラ属、またはアクレモニウム属に属する微生物を作用させることを特徴とするグリシンの製造法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明において用いるグリシノニトリルは、公知の方法で合成することができる。例えば、ホルムアルデヒドと青酸およびアンモニアから得る方法、あるいはホルムアルデヒドと青酸を反応させ一旦グリコロニトリルを合成し、継いでアンモニアを作用させて得る方法で合成される。どちらも、シュトレッカー法として総称されている。
【０００８】
本発明においては、使用する微生物として、マイコバクテリウム(Mycobacterium) 属、ロドシュードモナス(Rhodo pseudomonas) 属、キャンディダ(Candida) 属、クレブシエラ(Klebciella)属、またはアクレモニウム(Acremonium)属に属する微生物が適していることを新たに発見したものである。
本発明に適した微生物として具体的には、マイコバクテリウム エスピー ＡＣ７７７（FERM BP-2352 ）、ロドシュードモナス スフェロイデス ATCC 11167 、キャンディダ トロピカリス ATCC 20311 、クレブシエラ エスピーＤ５Ｂ（微工研菌寄 第８９３３号）、アクレモニウム エスピー Ｄ９Ｋ（微工研菌寄 第８９３０号）の微生物を使用できる。これらの菌株は、いずれも特開平２−８４１９８、特開昭６３−２０９５９２に記載されている。
【０００９】
本発明に使用される微生物の培養には、通常用いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリン、有機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、窒素源としては、アンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩および有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス等が用いられる。また、培地にはリン酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加される。培養はｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で好気的に行われる。本発明の微生物の培養において、上記の培地に酵素誘導剤を加えてもよい。例えば、ラクタム化合物（γ−ラクタム、δ−ラクタム、ε−カプロラクタム等）、ニトリル化合物、アミド化合物等を用いてもよい。
【００１０】
本発明の微生物は、そのまま工業使用できるが、適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしくは遺伝子工学的手法により改良された変異株、例えば、酵素を構成的に生産する変異株を育成し用いることもできる。本発明の菌体とは、培養液から採取した菌体または菌体処理物（菌体の破砕物、菌体破砕物より分離した酵素、および菌体または菌体から分離抽出された酵素を固定化した処理物）である。培養液からの菌体の採取は、公知の方法で行うことができる。
【００１１】
本発明においては、上述の方法で分離した菌体および菌体処理物は、一旦、蒸留水や緩衝液に懸濁して保存することができる。この場合、反応後の廃棄物を減らす上で蒸留水を用いることが好ましい。また、保存安定化のためにグリシン等の安定剤を保存液に添加することができる。この場合も、反応後の廃棄物を減らす上でグリシンを用いることが好ましい。こうして得られた菌体および菌体処理物の懸濁水溶液にグリシノニトリルを添加するか、または得られた菌体および菌体処理物の懸濁水溶液、あるいは菌体および菌体処理物を直接、グリシノニトリル水溶液に添加するすることにより、速やかに加水分解反応が進行しグリシンを製造することができる。
【００１２】
すなわち、通常、前記微生物菌体または菌体処理物を、例えば、乾燥菌体換算で０．０１から５重量％、基質のグリシノニトリルを１から３０重量％を反応装置に仕込み、温度として例えば０〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃にて、反応時間を例えば１〜２４時間、好ましくは３〜８時間反応させればよい。この場合、グリシノニトリルを薄い濃度で仕込み経時的に追加添加したり、反応温度を経時的に変化させてもよい。また、グリシノニトリルの着色を防止する目的で、グリシノニトリルに対し０．００１〜８ｍｏｌ％亜硫酸塩や蟻酸等の還元性の化合物、アスコルビン酸等の還元性生化学化合物を添加することができる。
【００１３】
こうしてグリシノニトリルが加水分解され、グリシンと同時にアンモニアが生成し、反応液のｐＨは反応前に比べ反応後は増加する。このように反応の進行に伴いｐＨが増加するのを抑えるため、反応前に緩衝液を添加したり、反応中に酸またはアルカリを添加することができる。しかし、反応後の廃棄物を減らす上では、こうした緩衝液、酸やアルカリを反応液に添加しないことが好ましい。反応を開放型の反応器で実施することができるが、生成するアンモニアの飛散による環境汚染の防止ならびに貴重なアンモニアを回収する目的で、密閉型の反応容器を用い閉鎖的反応条件で生成するアンモニアを、応容器中に一旦蓄積することが好ましい。この場合、ｐＨの上昇を抑えるために、生成するアンモニアを反応と同時に分離する反応分離装置を付属することがさらに好ましい。こうしたアンモニアの反応分離法としては、アンモニアの反応蒸留法や不活性ガスの流通法で実施することができる。
【００１４】
反応蒸留を行う場合、加水分解反応装置に、アンモニアと同伴する水を冷却回収する冷却器の付いた単管搭、棚段搭、または充填塔を備え、反応水溶液の沸騰圧以上、例えば、６０℃で２０．０ｋＰａ以上から０℃で０．６ｋＰａ以上の圧力条件下で、連続的にまたは間欠的に減圧反応蒸留することが好ましい。さらに好ましくは、１２．６ｋＰａから１．３ｋＰａの圧力条件下で減圧反応蒸留することができる。不活性ガスを流通する場合、不活性ガスの吹き込みノズルと、アンモニアや同伴する水を不活性ガスから回収する冷却トラップとを備え、微加圧から減圧条件下で連続的にまたは間欠的に、アンモニアを不活性ガスに同伴し反応液から分離することができる。さらに、アンモニア分離を促進するため、減圧反応蒸留を不活性ガス流通条件下で行うこともできる。反応方式はバッチ型方式や流通型反応方式、またはこれらを組み合わせた方式で行うことができる。
【００１５】
かくして、グリシノニトリルは、ほぼ１００％のモル収率で加水分解し、生成するアンモニアの全部は密閉型反応容器中に、一旦、グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度水溶液として生成蓄積させることができる。また、生成するアンモニアの全部または殆どは、反応と同時に反応蒸留法や不活性ガスの流通法で反応液から分離し冷却回収される。もし、グリシンアミドが残存する場合は、グリシンアミドの加水分解活性をもつ菌体もしくは酵素を追添加することにより、完全にグリシンおよびアンモニアに転換することも可能である。グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度水溶液からのグリシンの回収は、例えば、反応液から菌体を遠心濾過、膜分離等によって除いた後、グリシンは晶析法、イオン交換法または貧性溶媒による分別沈澱法にて回収できる。また、アンモニアは一部の水と一緒に蒸発後、蒸留や抽出によって回収することができる。
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、これらの実施例に制限されるものではない。
【００１６】
【実施例１】
酸素の混入を防ぐため、全ての反応操作は窒素雰囲気下で行い、反応に用いる全ての水溶液は約５℃に冷却し窒素ガスで一旦加圧後、再び常圧に戻す操作を数回繰り返し空気との置換を行った。
（１）グリシノニトリルの合成
窒素雰囲気下でホルマリンに等量の青酸をを作用させて一旦生成したグリコロニトリル水溶液に、過剰量のアンモニア水溶液を添加し、２時間反応を行った後、未反応のアンモニアと過剰の水を減圧除去し、３０重量％グリシノニトリル水溶液を得た。
【００１７】
（２）菌体の培養
マイコバクテリウム エスピー ＡＣ７７７株を、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
ε−カプロラクタム ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
【００１８】
(2) 培養条件
３０℃／１日
(3) グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。密閉した１００ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として１０３ｍｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを１７ｍｌの蒸留水に調合し、２０℃にて反応を開始した。反応開始２時間後、ｐＨは１０になっていた。この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成していた。
【００１９】
そこで、２時間毎に反応温度を５℃昇温し、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを追加添加し、反応液を液体クロマトグラフィー法で分析した。この操作を４回切り返し、合計１０時間反応を行った。得られた３２ｇの反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアはネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンとアンモニアが定量的に生成していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は５８ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は５．８ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの３０ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し、４．９ｇのグリシンを晶析回収した。一方、冷却回収した蒸発水溶液中のアンモニアは１．２５ｇであった。
【００２０】
【実施例２】
実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。
（１）菌体の培養
ロドシュードモナス スフェロイデス ATCC 11167 を、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
ε−カプロラクタム ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
(2) 培養条件
３０℃／１日
【００２１】
（２）グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフラスコに、ドライアイストラップを経て減圧ポンプに接続した単管型の蒸留塔、圧力センサー、温度計、および液送ポンプに接続したサンプリング管を備えた。このセパラブルフラスコに乾燥菌体量として１．７１ｇを仕込み、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０ｍｌを調合した。減圧ポンプでフラスコ内の圧力を１０ｋＰａに調整し、３０℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析したところ、グリシノニトリルが消失し、グリシンが定量的に生成していた。
【００２２】
そこで、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌを追加添加した。
１時間毎にこの操作をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイストラップには固体が２０ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９８ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成しトレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は３５ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は７ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの２９６ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して、５６ｇのグリシンを晶析回収した。
【００２３】
【実施例３】
実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。
（１）菌体の培養
キャンディダ トロピカリス ATCC 20311 を、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
ε−カプロラクタム ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
(2) 培養条件
３０℃／１日
【００２４】
（２）グリシノニトリルの加水分解
（１）で得られた乾燥菌体１．８２ｇを用いる以外は、実施例２と同様の操作を行った。ドライアイストラップには固体が２０ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９６ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成しトレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は３３ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は６．６ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの２９４ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して、５６ｇのグリシンを晶析回収した。
【００２５】
【実施例４】
実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。
（１）菌体の培養
クレブシエラ エスピー Ｄ５Ｂを、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
ε−カプロラクタム ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
【００２６】
(2) 培養条件
３０℃／１日
(3) グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ドライアイストラップに接続したミストセパレーター、温度計、およびサンプリング管を備えた。このセパラブルフラスコに乾燥菌体量として１．８８ｇを仕込み、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素ガスを１時間当たり３リットルフィードしながら、３０℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成していた。
【００２７】
そこで、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌを追加添加した。
この操作をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイストラップには固体が１５ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９１ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成しトレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は３２ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は６．４ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの２８９ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して、５６ｇのグリシンを晶析回収した。
【００２８】
【実施例５】
実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。
（１）菌体の培養
アクレモニウム エスピー Ｄ９Ｋを、下記の条件で培養した。
(1) 培地
フマル酸 １．０重量％
肉エキス １．０
ペプトン １．０
食塩 ０．１
イソブチロニトリル ０．３
リン酸第一カリウム ０．２
硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２
塩化アンモニウム ０．１
硫酸第二鉄・７水塩 ０．００３
塩化マンガン・４水塩 ０．００２
塩化コバルト・６水塩 ０．００２
ｐＨ ７．５
(2) 培養条件
３０℃／１日
【００２９】
（２）グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ドライアイストラップを経て減圧ポンプに接続した単管型の蒸留塔、圧力センサー、温度計、および液送ポンプに接続したサンプリング管を備えた。このセパラブルフラスコに乾燥菌体量として１．７４ｇを仕込み、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素ガスを１時間当たり３リットルフィードしながら、減圧ポンプでフラスコ内の圧力を１０ｋＰａに調整し、３０℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析したところ、グリシノニトリルが消失しグリシンが定量的に生成していた。
【００３０】
そこで、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌを追加添加した。
２時間毎にこの操作をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイストラップには固体が２５ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９２ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成しトレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は３５ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は６．９ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの２９０ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して、５６ｇのグリシンを晶析回収した。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の製造方法は、グリシノニトリルの水溶液にマイコバクテリウム属、ロドシュードモナス属、キャンディダ属、クレブシエラ属、またはアクレモニウム属に属する微生物を作用させることで、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的かつ別々に回収できる効果を有する。
Claims (4)
- ｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件下で、グリシノニトリルの水溶液に微生物を作用させ、グリシン及びアンモニアを回収するグリシンの製造法であって、上記微生物がマイコバクテリウムエスピー ＡＣ７７７、ロドシュードモナススフェロイデス ＡＴＣＣ １１１６７、キャンディダ トロピカリス ＡＴＣＣ ２０３１１、クレブシエラ エスピーＤ５Ｂ又はアクレモニウム エスピー Ｄ９Ｋであることを特徴とするグリシンの製造法。
- 微生物を作用させる反応条件がｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、かつ閉鎖的反応条件であることを特徴とする請求項１記載の方法。
- 微生物を作用させる反応条件がｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、かつ反応液中に生成するアンモニアを反応液から分離する反応条件であることを特徴とする請求項１記載の方法。
- アンモニアを反応液から分離する方法が反応蒸留であることを特徴とする請求項３記載の方法。
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