JP3017264B2 - 酵素法によるｌ―セリンの製造法 - Google Patents
酵素法によるｌ―セリンの製造法Info
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｌ−セリンの製造法に関し、更に詳しくは
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有す
る微生物細胞、もしくは細胞処理物の存在下で、グリシ
ンとホルムアルデヒドから酵素法によりＬ−セリンを製
造する方法に関するものである。
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有す
る微生物細胞、もしくは細胞処理物の存在下で、グリシ
ンとホルムアルデヒドから酵素法によりＬ−セリンを製
造する方法に関するものである。
Ｌ−セリンは医薬品、化粧品、化学原料等に利用され
るアミノ酸であり、現在は化学的合成法またはグリシン
を前駆体とする発酵法により製造されている。
るアミノ酸であり、現在は化学的合成法またはグリシン
を前駆体とする発酵法により製造されている。
しかしながら、化学合成法の場合はDL体が合成される
ためにＬ体のみを得るには光学分割しなければならない
という欠点があり、又、グリシンを前駆体とする発酵法
には蓄積量、収率、精製、廃水処理等に難点があり、こ
れらの方法は実用上有利な方法とは言い難い。
ためにＬ体のみを得るには光学分割しなければならない
という欠点があり、又、グリシンを前駆体とする発酵法
には蓄積量、収率、精製、廃水処理等に難点があり、こ
れらの方法は実用上有利な方法とは言い難い。
これらの方法に代わって最近は、セリンヒドロキシメ
チルトランスフェラーゼ（EC2.1.2.1.以下「SHMT」と称
する）を利用し、グリシンとホルムアルデヒドからＬ−
セリンを酵素的に合成する方法が注目されている。
チルトランスフェラーゼ（EC2.1.2.1.以下「SHMT」と称
する）を利用し、グリシンとホルムアルデヒドからＬ−
セリンを酵素的に合成する方法が注目されている。
更には、遺伝子操作により微生物のSHMT活性を向上さ
せる方法も知られている（Gene,14,p63〜72（1981）.Ge
ne,27,p47〜54（1984）ので、工業的には微生物の生産
するSHMTを利用する方法は、将来一層有利であると期待
されている。
せる方法も知られている（Gene,14,p63〜72（1981）.Ge
ne,27,p47〜54（1984）ので、工業的には微生物の生産
するSHMTを利用する方法は、将来一層有利であると期待
されている。
SHMTを利用して酵素法によりグリシンとホルムアルデ
ヒドからＬ−セリンを工業的に有利に製造する方法とし
ては、SHMT活性を有する微生物または、微生物の細胞
を、グリシン溶液と接触させた後Ｌ−セリン反応に使用
する方法が知られている。（特開昭61−9294）しかしな
がら、微生物にはセリン分解酵素活性（以下SD活性と称
する）の存在も知られている。〔例えばＬ−セリンデヒ
ドラターゼ（Shizuta Y.and Tokushige M.Methods in
enzymology 17B p575〜p580,Academic PressInc.New Y
ork（1971） Burns.R.O.Methods in enzynology 17B Academic Pre
ss New York（1971） Kubota.K.etal.,J.Fermentation and Bioengineering
67,（６）p391〜p394（1989））〕 該SD活性は酵素法Ｌ−セリンの製造法において次のよ
うな問題点を生じる。
ヒドからＬ−セリンを工業的に有利に製造する方法とし
ては、SHMT活性を有する微生物または、微生物の細胞
を、グリシン溶液と接触させた後Ｌ−セリン反応に使用
する方法が知られている。（特開昭61−9294）しかしな
がら、微生物にはセリン分解酵素活性（以下SD活性と称
する）の存在も知られている。〔例えばＬ−セリンデヒ
ドラターゼ（Shizuta Y.and Tokushige M.Methods in
enzymology 17B p575〜p580,Academic PressInc.New Y
ork（1971） Burns.R.O.Methods in enzynology 17B Academic Pre
ss New York（1971） Kubota.K.etal.,J.Fermentation and Bioengineering
67,（６）p391〜p394（1989））〕 該SD活性は酵素法Ｌ−セリンの製造法において次のよ
うな問題点を生じる。
生成したＬ−セリンが分解され反応収率（対原料グ
リシン収率）が低下する。
リシン収率）が低下する。
Ｌ−セリン分解生成物によりＬ−セリン生成反応が
抑制されセリン蓄積量が低下する。
抑制されセリン蓄積量が低下する。
このため、SD活性の低下した微生物変異株を用いてＬ
−セリンを効率よく製造する方法が知られている。〔文
献（Kubota.K.Agric Biol Chem.49 p7〜P12（198
5））〕しかしながら、SD失活変異株を造成することは
容易なことではなく、復元株の出現といった問題があ
り、工業的規模での方法としては問題があった。
−セリンを効率よく製造する方法が知られている。〔文
献（Kubota.K.Agric Biol Chem.49 p7〜P12（198
5））〕しかしながら、SD失活変異株を造成することは
容易なことではなく、復元株の出現といった問題があ
り、工業的規模での方法としては問題があった。
また、セリン分解活性の抑制法については、特開昭58
−129972号公報、特開昭58−129975号公報に開示されて
いるが、いずれも菌体を40〜60℃の特定温度条件下、10
〜30分間の短時間処理するもので、短時間処理により成
果を得ようとするものであるが、本発明で使用する微生
物に於いてはセリン分解活性の抑制効果としては十分な
ものではないという問題点を見出した。
−129972号公報、特開昭58−129975号公報に開示されて
いるが、いずれも菌体を40〜60℃の特定温度条件下、10
〜30分間の短時間処理するもので、短時間処理により成
果を得ようとするものであるが、本発明で使用する微生
物に於いてはセリン分解活性の抑制効果としては十分な
ものではないという問題点を見出した。
このような状況のもとに本発明者らは、SHMT活性を有
すると同時にSD活性も有している微生物の培養液、菌体
もしくは菌体処理物を用いて、グリシンとホルムアルデ
ヒドよりＬ−セリンを製造するに当たり、その細胞、も
しくは細胞処理物中に存在するSD活性を、SHMT活性の低
下は極力抑えながら、選択的に低下させる方法を確立す
ることを目的とし、該SHMT酵素活性を有する微生物の細
胞もしくは細胞処理物を用いて、Ｌ−セリンを製造する
方法を鋭意検討した。
すると同時にSD活性も有している微生物の培養液、菌体
もしくは菌体処理物を用いて、グリシンとホルムアルデ
ヒドよりＬ−セリンを製造するに当たり、その細胞、も
しくは細胞処理物中に存在するSD活性を、SHMT活性の低
下は極力抑えながら、選択的に低下させる方法を確立す
ることを目的とし、該SHMT酵素活性を有する微生物の細
胞もしくは細胞処理物を用いて、Ｌ−セリンを製造する
方法を鋭意検討した。
その結果、SHMT活性を有すると同時にSD活性も有して
いる微生物の細胞懸濁液もしくは細胞処理物溶液を60℃
以下の温度で溶存酸素が1ppm以上存在する条件で前処理
すると選択的にSD活性を低下させることを見い出し、以
上の処理を施した該微生物の細胞もしくは細胞処理物を
用い、グリシンとホルムアルデヒドよりＬ−セリンを効
率よく製造する方法を完成した。
いる微生物の細胞懸濁液もしくは細胞処理物溶液を60℃
以下の温度で溶存酸素が1ppm以上存在する条件で前処理
すると選択的にSD活性を低下させることを見い出し、以
上の処理を施した該微生物の細胞もしくは細胞処理物を
用い、グリシンとホルムアルデヒドよりＬ−セリンを効
率よく製造する方法を完成した。
即ち、本発明は酵素セリンヒドロキシメチルトランス
フェラーゼ活性を有する、微生物の細胞もしくは細胞処
理物の存在下、グリシンとホルムアルデヒドより、Ｌ−
セリンを製造する方法において、細胞懸濁液もしくは細
胞処理溶液を60℃以下の温度で溶存酸素濃度が1ppm以上
に保たれるように懸濁液または細胞処理溶液に酸素又は
空気を溶解し、前処理した該酵素活性を有する微生物の
細胞もしくは細胞処理物を用いる事を特徴とする、Ｌ−
セリンの製造方法である。
フェラーゼ活性を有する、微生物の細胞もしくは細胞処
理物の存在下、グリシンとホルムアルデヒドより、Ｌ−
セリンを製造する方法において、細胞懸濁液もしくは細
胞処理溶液を60℃以下の温度で溶存酸素濃度が1ppm以上
に保たれるように懸濁液または細胞処理溶液に酸素又は
空気を溶解し、前処理した該酵素活性を有する微生物の
細胞もしくは細胞処理物を用いる事を特徴とする、Ｌ−
セリンの製造方法である。
本発明において用いられる微生物は、SHMT活性を有す
るものであればよく、このような微生物の例としては、
エシェリヒア・コリ（Esherichiacoli）MT−10350（FER
M P−7437、FERM BP−793）、エシェリヒア・コリMT−1
0351（FERM P−7438、FERM BP−794）をあげることがで
きる。
るものであればよく、このような微生物の例としては、
エシェリヒア・コリ（Esherichiacoli）MT−10350（FER
M P−7437、FERM BP−793）、エシェリヒア・コリMT−1
0351（FERM P−7438、FERM BP−794）をあげることがで
きる。
本発明において用いられる微生物の培養に当たって
は、使用菌株の利用しうる炭素源、窒素源、無機塩類、
有機栄養物などを含有するものであれば合成培地、天然
培地のいずれも使用できる。培養は通常好気的条件、培
養温度25〜40℃、培養液のpH6〜８で行われる。
は、使用菌株の利用しうる炭素源、窒素源、無機塩類、
有機栄養物などを含有するものであれば合成培地、天然
培地のいずれも使用できる。培養は通常好気的条件、培
養温度25〜40℃、培養液のpH6〜８で行われる。
本発明に於いては、このようにして得られた培養液は
そのまま遠心分離、濾過等により集菌した細胞又は細胞
処理物を酵素源として用いる。細胞処理物としては、細
胞を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処
理、溶媒処理、化学的処理、浸透圧処理、自己消化、界
面活性剤処理、酵素処理等により細胞壁の一部もしくは
全部を破砕したもの、これらより得られる酵素画分、細
胞及び細胞抽出物の固定化物などがある。
そのまま遠心分離、濾過等により集菌した細胞又は細胞
処理物を酵素源として用いる。細胞処理物としては、細
胞を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処
理、溶媒処理、化学的処理、浸透圧処理、自己消化、界
面活性剤処理、酵素処理等により細胞壁の一部もしくは
全部を破砕したもの、これらより得られる酵素画分、細
胞及び細胞抽出物の固定化物などがある。
培養液から細胞を集菌する場合、培養液中の炭素源、
たとえばグルコース等が消費された培養液から集菌され
るのが好ましい。
たとえばグルコース等が消費された培養液から集菌され
るのが好ましい。
本発明においては、本発明に用いる細胞又は細胞処理
物を60℃以下、好ましくは30〜50℃に保ちつつ、酸素ま
たは空気を通気、あるいは攪拌により、処理液中の溶存
酸素濃度を常に1ppm以上となるように溶解、保持するこ
とにより、細胞内又は細胞処理物中に存在するSD活性の
みを選択的に低下させることが出来る。
物を60℃以下、好ましくは30〜50℃に保ちつつ、酸素ま
たは空気を通気、あるいは攪拌により、処理液中の溶存
酸素濃度を常に1ppm以上となるように溶解、保持するこ
とにより、細胞内又は細胞処理物中に存在するSD活性の
みを選択的に低下させることが出来る。
処理温度は30℃未満ではSD活性の抑制ができない傾向
がある。又、60℃を越せばSD活性と共にSHMT活性も低下
するので好ましくない。
がある。又、60℃を越せばSD活性と共にSHMT活性も低下
するので好ましくない。
処理液中の溶存酸素量は溶媒、溶質によって変化する
が常に処理液中に1ppm以上に溶存酸素があれば十分であ
る。処理液のpHは通常６〜９、処理時間は２〜10時間、
好ましくは４〜８時間である。
が常に処理液中に1ppm以上に溶存酸素があれば十分であ
る。処理液のpHは通常６〜９、処理時間は２〜10時間、
好ましくは４〜８時間である。
SD活性失活処理において発泡防止のため通常使用され
る消泡剤を添加してもよい。処理液中にグリシンを添加
して処理することは更に好ましい態様である。以上の前
処理を施したSHMT活性を有する細胞又は、細胞処理物を
用いてＬ−セリンの合成を実施する。
る消泡剤を添加してもよい。処理液中にグリシンを添加
して処理することは更に好ましい態様である。以上の前
処理を施したSHMT活性を有する細胞又は、細胞処理物を
用いてＬ−セリンの合成を実施する。
本発明のＬ−セリン合成反応は、pH6〜９、温度30〜6
0℃で攪拌条件下で行うのが好ましい。酵素SHMTは補酵
素として、テトラヒドロ葉酸とピリドキサルリン酸を要
求するので、これらの物質を反応系に添加することによ
りＬ−セリン反応が高められることがある。なお、本発
明のＬ−セリン反応は、窒素雰囲気または還元剤存在下
に行うことによっても一層促進させることがある。
0℃で攪拌条件下で行うのが好ましい。酵素SHMTは補酵
素として、テトラヒドロ葉酸とピリドキサルリン酸を要
求するので、これらの物質を反応系に添加することによ
りＬ−セリン反応が高められることがある。なお、本発
明のＬ−セリン反応は、窒素雰囲気または還元剤存在下
に行うことによっても一層促進させることがある。
反応基質であるグリシンの添加量は、反応温度におけ
る飽和溶解度以上でも特に問題ないが、できれば5Mによ
り近い濃度の方が好ましい。グリシンの添加方法につい
ては反応開始時に一括添加しても、反応進行にともない
分割添加してもよい。
る飽和溶解度以上でも特に問題ないが、できれば5Mによ
り近い濃度の方が好ましい。グリシンの添加方法につい
ては反応開始時に一括添加しても、反応進行にともない
分割添加してもよい。
一方の反応基質であるホルムアルデヒドは、気体で、
あるいは水溶液として、アルコール溶液として、更には
固形重合物のパラホルムアルデヒドなどの形態で使用す
ることが出来るが、37〜43％程度の水溶液であるホルマ
リンの使用が好適である。
あるいは水溶液として、アルコール溶液として、更には
固形重合物のパラホルムアルデヒドなどの形態で使用す
ることが出来るが、37〜43％程度の水溶液であるホルマ
リンの使用が好適である。
ホルムアルデヒドはSHMT酵素活性を阻害しない程度の
濃度で用いなければならず、反応の進行にともない反応
液に分割または連続的に添加する。
濃度で用いなければならず、反応の進行にともない反応
液に分割または連続的に添加する。
本発明方法のＬ−セリン合成反応は通常pH6〜９、反
応温度30〜60℃、反応時間は５〜40時間、好ましくは反
応温度40〜50℃で20〜30時間である。
応温度30〜60℃、反応時間は５〜40時間、好ましくは反
応温度40〜50℃で20〜30時間である。
pHの調整は反応液中にアルカリを添加して実施され
る。反応液に添加するアルカリとしては、水酸化リチウ
ム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどアルカリ金
属水酸化物の他、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど
水に溶解して液性を塩基性とするものであればよい。
る。反応液に添加するアルカリとしては、水酸化リチウ
ム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどアルカリ金
属水酸化物の他、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど
水に溶解して液性を塩基性とするものであればよい。
反応の進行は反応液中のＬ−セリン及びグリシン濃度
を液体クロマトグラフィーにより分析し確認できる。
を液体クロマトグラフィーにより分析し確認できる。
反応終了後の反応液の後処理は、反応液に鉱酸例えば
硫酸、塩酸等を加え液性を酸性側、好ましくはpH5以下
としＬ−セリンを溶解する。この溶液に濾過助剤、例え
ば活性炭等を加え、熱濾過し菌体破砕物等の不純物を除
去する。
硫酸、塩酸等を加え液性を酸性側、好ましくはpH5以下
としＬ−セリンを溶解する。この溶液に濾過助剤、例え
ば活性炭等を加え、熱濾過し菌体破砕物等の不純物を除
去する。
濾液は常法により濃縮し、Ｌ−セリンの結晶を析出さ
せ分離、環装しＬ−セリンを得る。
せ分離、環装しＬ−セリンを得る。
本発明において最も特徴とする、SD活性を低下させる
処理の効果によりＬ−セリン合成反応において、反応
生成したＬ−セリンの分解が抑制され反応収率（対原料
グリシン収率）の低下が抑えられる。Ｌ−セリン分解
生成物によりＬ−セリン生成反応が抑制されセリン蓄積
量が低下することを防止できる。
処理の効果によりＬ−セリン合成反応において、反応
生成したＬ−セリンの分解が抑制され反応収率（対原料
グリシン収率）の低下が抑えられる。Ｌ−セリン分解
生成物によりＬ−セリン生成反応が抑制されセリン蓄積
量が低下することを防止できる。
以下、実施例及び実験例により本発明を詳細に説明す
る。
る。
勿論、実施例は本発明を具体的に例証するものであ
り、本発明がこの実施例の範囲に限定されるものではな
い。
り、本発明がこの実施例の範囲に限定されるものではな
い。
実験例１ エシェリヒア・コリMT−10350（微工研菌寄第7437
号）の菌株を後述のLB−AP寒天平板培地に植菌し、35℃
にし一夜培養を行ない、生育したコロニーから２白金耳
を150mlのLB−AP液体培地の入った綿栓付き500ml坂口フ
ラスコに接種した。接種した坂口フラスコは35℃にて20
時間振盪培養（120rpm）を行ない、所定時間培養後、PT
最小培地を20仕込んだ30ジャーファーメンターに移
液して35℃、通気量1vvm、攪拌回転数600rpmにてpH6.8
にpHコントローラーによりアンモニア水の添加により制
御を行いつつ、殺菌済み40％グルコース水溶液を逐時添
加しながら40時間培養を行った。所定時間培養後、培地
中のグルコースが消費されるのを確認して、直ちに遠心
分離機にて集菌を行い、湿菌体を得た。得られた集菌湿
菌体0.46kgを1.43kgの水及び0.41kgのグリシン溶液中に
加えた。pHをNaOHにて調製し、7.5に合わせ、攪拌しな
がら40℃に16時間保った。
号）の菌株を後述のLB−AP寒天平板培地に植菌し、35℃
にし一夜培養を行ない、生育したコロニーから２白金耳
を150mlのLB−AP液体培地の入った綿栓付き500ml坂口フ
ラスコに接種した。接種した坂口フラスコは35℃にて20
時間振盪培養（120rpm）を行ない、所定時間培養後、PT
最小培地を20仕込んだ30ジャーファーメンターに移
液して35℃、通気量1vvm、攪拌回転数600rpmにてpH6.8
にpHコントローラーによりアンモニア水の添加により制
御を行いつつ、殺菌済み40％グルコース水溶液を逐時添
加しながら40時間培養を行った。所定時間培養後、培地
中のグルコースが消費されるのを確認して、直ちに遠心
分離機にて集菌を行い、湿菌体を得た。得られた集菌湿
菌体0.46kgを1.43kgの水及び0.41kgのグリシン溶液中に
加えた。pHをNaOHにて調製し、7.5に合わせ、攪拌しな
がら40℃に16時間保った。
所定時間混合後、混合液を２倍に希釈してSD活性を測
定し、次いで消泡剤（アデカノール LG−109旭電化
製）を0.1％濃度に添加し、表−１に示す各溶存酸素濃
度に保たれるように通気量を調整し、通気後、２時間、
４時間目の残存SD活性及びSHMT活性を混合液を２倍に希
釈して測定した。
定し、次いで消泡剤（アデカノール LG−109旭電化
製）を0.1％濃度に添加し、表−１に示す各溶存酸素濃
度に保たれるように通気量を調整し、通気後、２時間、
４時間目の残存SD活性及びSHMT活性を混合液を２倍に希
釈して測定した。
培地組成 1. LB−AP寒天平板培地 pH調整後、寒天15gを加えてオートクレーブ殺菌（120
℃,10分間）し60℃以下に冷却後、アンピシリンを濃度2
5μg/になるように無菌フィルターを通して添加。シ
ャーレに分注し固化させ寒天平板を作製した。
℃,10分間）し60℃以下に冷却後、アンピシリンを濃度2
5μg/になるように無菌フィルターを通して添加。シ
ャーレに分注し固化させ寒天平板を作製した。
2. LB−AP液体培地 pH調整後、オートクレーブ殺菌（120℃,10分間）し、
60℃以下に冷却後、アンピシリンを濃度25μg/になる
ように無菌フィルターを通して添加した。
60℃以下に冷却後、アンピシリンを濃度25μg/になる
ように無菌フィルターを通して添加した。
3. PT最少培地 リン酸１カリウム 2.0g リン酸２カリウム 2.0g MgSO4・7H2O 2.0g （NH4）2SO4 1.5g Ｌ−フェニルアラニン 2.5g CaCl2・2H2O 80mg CuCl2・2H2O 8mg CoCl2・6H2O 8mg AlCl2・6H2O 20mg H3BO3 1mg MnSO4・5H2O 20mg ZnSO4・7H2O 4mg Na2MoO4・2H2O 4mg FeSO4・7H2O 80mg 蒸留水 1000ml を混合し、120℃で30分間殺菌後、0.2μｍの無菌フィル
ターにて無菌濾過した塩酸チアミン水溶液をチアミン濃
度を50mg/となるように添加した。
ターにて無菌濾過した塩酸チアミン水溶液をチアミン濃
度を50mg/となるように添加した。
SD活性及びSHMT活性の測定方法 1. SD活性測定方法 2.2mlのエッペンドルフチューブ中へ、0.1mlの500mM
リン酸緩衝液（pH7.5）と0.6mlの33mM L−セリン水溶液
と0.1mlの0.1mMピリドキサルリン酸（50mMリン酸緩衝液
（pH7.5））と0.1mlの蒸留水を加え、30℃で５分間プレ
インキュベーションを行った。次に、その溶液へ、0.4m
lの菌体処理液を加え攪拌した後、30℃で２時間反応し
た。所定時間終了後、0.2mlのトリクロロ酢酸（15％水
溶液）を加えて反応を停止した。反応液は遠心分離を行
い、上清液を10倍に希釈し、液体クロマトグラフィー
（以下、HPLCと略する）にてＬ−セリンの分析を行っ
た。対照として、プレインキュベーションした後、反応
液にトリクロロ酢酸を加え、次に、菌体処理液を加え
た。所定時間30℃で反応を行い、上記と同様に遠心分離
を行い上清液中のＬ−セリン濃度を分析しこれを標準と
した。HPLCでのＬ−セリンの分析条件は、下記の通りで
ある。
リン酸緩衝液（pH7.5）と0.6mlの33mM L−セリン水溶液
と0.1mlの0.1mMピリドキサルリン酸（50mMリン酸緩衝液
（pH7.5））と0.1mlの蒸留水を加え、30℃で５分間プレ
インキュベーションを行った。次に、その溶液へ、0.4m
lの菌体処理液を加え攪拌した後、30℃で２時間反応し
た。所定時間終了後、0.2mlのトリクロロ酢酸（15％水
溶液）を加えて反応を停止した。反応液は遠心分離を行
い、上清液を10倍に希釈し、液体クロマトグラフィー
（以下、HPLCと略する）にてＬ−セリンの分析を行っ
た。対照として、プレインキュベーションした後、反応
液にトリクロロ酢酸を加え、次に、菌体処理液を加え
た。所定時間30℃で反応を行い、上記と同様に遠心分離
を行い上清液中のＬ−セリン濃度を分析しこれを標準と
した。HPLCでのＬ−セリンの分析条件は、下記の通りで
ある。
HPLC分析条件（Ｌ−セリン、グリシンの定量）ポスト
ラベル法にて分析を行った。移動相は脱気水を用い、流
速を1.0ml/minに設定した。
ラベル法にて分析を行った。移動相は脱気水を用い、流
速を1.0ml/minに設定した。
発色剤は、ｏ−フタルアルデヒド溶液を流速0.4ml/mi
nで通液した。検出器は蛍光検出器を用いて、照射波長3
65nm、放射波長455nmにて行った。分離カラムは、Shode
x DM−614（昭和電工製）を２本直列につないで使用し
た。
nで通液した。検出器は蛍光検出器を用いて、照射波長3
65nm、放射波長455nmにて行った。分離カラムは、Shode
x DM−614（昭和電工製）を２本直列につないで使用し
た。
2. SHMT活性測定方法 2.2mlのエッペンドルフチューブ注へ、0.1mlの500mM
リン酸Buffer（pH＝7.3）と0.5mlの1.0Mグリシン水溶液
と0.3mlの0.45％テトラヒドロ葉酸溶液〔0.08％ホルマ
リンを含む500mMリン酸緩衝液（pH＝7.3）〕と0.2mlの
蒸留水を加え、50℃で５分間プレインキュベーションを
行った。
リン酸Buffer（pH＝7.3）と0.5mlの1.0Mグリシン水溶液
と0.3mlの0.45％テトラヒドロ葉酸溶液〔0.08％ホルマ
リンを含む500mMリン酸緩衝液（pH＝7.3）〕と0.2mlの
蒸留水を加え、50℃で５分間プレインキュベーションを
行った。
次に、その溶液へ0.1mlの菌体処理液（50mMリン酸緩
衝液（pH7.3）にて50倍に希釈処理液）を加え攪拌した
後、50℃で10分間反応した。所定時間終了後、0.3mlの
トリクロロ酢酸（15％水溶液）を加えて反応を停止し
た。反応液を遠心分離を行い、上清液を５倍に希釈し、
HPLCにてＬ−セリンの分析を行った。HPLCのＬ−セリン
の分析条件は、上記の通りである。
衝液（pH7.3）にて50倍に希釈処理液）を加え攪拌した
後、50℃で10分間反応した。所定時間終了後、0.3mlの
トリクロロ酢酸（15％水溶液）を加えて反応を停止し
た。反応液を遠心分離を行い、上清液を５倍に希釈し、
HPLCにてＬ−セリンの分析を行った。HPLCのＬ−セリン
の分析条件は、上記の通りである。
実験例２ エシェリヒア・コリMT−10350の菌株を、実験例１と
同様の操作で培養を行い、培養液から遠心分離し湿菌体
を得た。得られた湿菌体を培養液の1/3量の0.85％NaCl
水溶液ど洗浄後、再度遠心により集菌し洗浄菌体を得
た。88.8gの洗浄湿菌体を５℃に冷却した0.1Mトリス・
塩酸緩衝液（pH7.5）を加え800gとした。該懸濁液を２
分割し、一方の懸濁液は超音波破砕機（BRANSOM社製）
にて、氷上で破砕処理を行い、破砕液を更に２分割し、
各々の破砕液を溶存酸素濃度計（東亜電波製）、通気ノ
ズル、攪拌装置及び温度調節装置を有する容器に注入
し、消泡のためアデカノールLG−109（旭電化製）を0.0
5％になるように添加し、40℃にて、表−２に示す溶存
酸素濃度になるように通気量を調整し、開始時のSHMT活
性およびSD活性を測定した。
同様の操作で培養を行い、培養液から遠心分離し湿菌体
を得た。得られた湿菌体を培養液の1/3量の0.85％NaCl
水溶液ど洗浄後、再度遠心により集菌し洗浄菌体を得
た。88.8gの洗浄湿菌体を５℃に冷却した0.1Mトリス・
塩酸緩衝液（pH7.5）を加え800gとした。該懸濁液を２
分割し、一方の懸濁液は超音波破砕機（BRANSOM社製）
にて、氷上で破砕処理を行い、破砕液を更に２分割し、
各々の破砕液を溶存酸素濃度計（東亜電波製）、通気ノ
ズル、攪拌装置及び温度調節装置を有する容器に注入
し、消泡のためアデカノールLG−109（旭電化製）を0.0
5％になるように添加し、40℃にて、表−２に示す溶存
酸素濃度になるように通気量を調整し、開始時のSHMT活
性およびSD活性を測定した。
また、通気後４時間目の各々の活性を測定し、残存率
を表−２に示す。該懸濁液の残りは超音波処理を行なわ
ず、更に、これを２分割し、溶存酸素濃度計（東亜電波
製）、通気ノズル、攪拌装置及び温度調節装置を有する
容器に注入し、消泡のためアデカノール LG−109（旭電化製）を0.05％になるように添加し、40
℃にて、表−２に示す溶存酸素濃度になるように通気量
を調整し処理を行った。処理４時間後、懸濁液に等量の
0.1Mトリス・塩酸緩衝液（pH＝7.5）を加え、超音波破
砕機（BRANSON社製）にて氷上で破砕処理を行い、破砕
液のSHMT活性およびSD活性を測定した。
を表−２に示す。該懸濁液の残りは超音波処理を行なわ
ず、更に、これを２分割し、溶存酸素濃度計（東亜電波
製）、通気ノズル、攪拌装置及び温度調節装置を有する
容器に注入し、消泡のためアデカノール LG−109（旭電化製）を0.05％になるように添加し、40
℃にて、表−２に示す溶存酸素濃度になるように通気量
を調整し処理を行った。処理４時間後、懸濁液に等量の
0.1Mトリス・塩酸緩衝液（pH＝7.5）を加え、超音波破
砕機（BRANSON社製）にて氷上で破砕処理を行い、破砕
液のSHMT活性およびSD活性を測定した。
実験例３ エシェリヒア・コリMT−10350の菌株を、実験例１と
同様の操作で培養を行い、培養液から遠心分離し湿菌体
を得た。得られた湿菌体を培溶液の1/3量の0.85％NaCl
水溶液で洗浄後、再度遠心分離により集菌し洗浄菌体を
得た。100gの洗浄湿菌体を５℃に冷却した0.1Mトリス・
塩酸緩衝液（pH＝7.5）を加え1000gとした。該懸濁液を
５分割し各々の懸濁液を溶存酸素濃度計、通気ノズル、
攪拌装置及び温度調節装置を有する容器に注入し、消泡
のためアデカノール LG−109（旭電化製）を0.05％に
なるように添加し、表−３に示す溶存酸素濃度になるよ
うに通気量又は攪拌を調整し、20〜65℃の温度条件下で
４時間攪拌処理を行った。
同様の操作で培養を行い、培養液から遠心分離し湿菌体
を得た。得られた湿菌体を培溶液の1/3量の0.85％NaCl
水溶液で洗浄後、再度遠心分離により集菌し洗浄菌体を
得た。100gの洗浄湿菌体を５℃に冷却した0.1Mトリス・
塩酸緩衝液（pH＝7.5）を加え1000gとした。該懸濁液を
５分割し各々の懸濁液を溶存酸素濃度計、通気ノズル、
攪拌装置及び温度調節装置を有する容器に注入し、消泡
のためアデカノール LG−109（旭電化製）を0.05％に
なるように添加し、表−３に示す溶存酸素濃度になるよ
うに通気量又は攪拌を調整し、20〜65℃の温度条件下で
４時間攪拌処理を行った。
処理前及び４時間処理後の各々のSHMT活性及びSD活性
を測定し、残存率を表−３に示す。
を測定し、残存率を表−３に示す。
実験例４ エシェリヒア・コリMT−10350を実験例２と同様に培
養、集菌した湿菌体500gを得た。純水1160gを培養に用
いる2.6ミニジャーファメンター（マルビシェンジ社
製・タービン型攪拌羽根付（６翼）に仕込み40℃下空気
を1vvmで通気しながら600rpmで攪拌しそのDO（溶存酸
素）濃度を測定したところ6.4ppmだった。通気を停止
し、その純水中に得られた湿菌体のうち200gを加えて10
0rpm程度で穏やかに攪拌を行い40℃下懸濁液中のDO濃度
を連続して測定したところDO濃度は15分間で速やかに0p
pmまで下がった。次に、前述と同様のミニジャーファー
メンターに純水1080gを仕込みグリシン300.4g（4.00mo
l）を加え、40℃下で攪拌溶解した後、NaOH2.3gを加え
てPH＝7.5に調整した。その後、1vvm、600rpmで通気、
攪拌を行ない、溶存酸素を飽和とした。通気を止め、攪
拌を100rpmとして、その溶液中へ前述と同様に湿菌体22
1.8gを加えて、20分後の液中の溶存酸素を測定したとこ
ろ0ppmだった。無通気のまま40℃で17時間100rpmで攪拌
を続けてグリシン処理液を行ない、処理が終わった溶液
約1500g中のDO濃度を測定したところ0ppmだった。攪拌
回転数を400rpmに上げグリシン処理液1500g中へ空気を
３/minで吹き込み、DO濃度が飽和（6.5ppm）に達した
時点で空気の吹き込みを停止し、それよりグリシン処理
液中のDO濃度が０になるまでの時間を測定したところ11
minを要した。
養、集菌した湿菌体500gを得た。純水1160gを培養に用
いる2.6ミニジャーファメンター（マルビシェンジ社
製・タービン型攪拌羽根付（６翼）に仕込み40℃下空気
を1vvmで通気しながら600rpmで攪拌しそのDO（溶存酸
素）濃度を測定したところ6.4ppmだった。通気を停止
し、その純水中に得られた湿菌体のうち200gを加えて10
0rpm程度で穏やかに攪拌を行い40℃下懸濁液中のDO濃度
を連続して測定したところDO濃度は15分間で速やかに0p
pmまで下がった。次に、前述と同様のミニジャーファー
メンターに純水1080gを仕込みグリシン300.4g（4.00mo
l）を加え、40℃下で攪拌溶解した後、NaOH2.3gを加え
てPH＝7.5に調整した。その後、1vvm、600rpmで通気、
攪拌を行ない、溶存酸素を飽和とした。通気を止め、攪
拌を100rpmとして、その溶液中へ前述と同様に湿菌体22
1.8gを加えて、20分後の液中の溶存酸素を測定したとこ
ろ0ppmだった。無通気のまま40℃で17時間100rpmで攪拌
を続けてグリシン処理液を行ない、処理が終わった溶液
約1500g中のDO濃度を測定したところ0ppmだった。攪拌
回転数を400rpmに上げグリシン処理液1500g中へ空気を
３/minで吹き込み、DO濃度が飽和（6.5ppm）に達した
時点で空気の吹き込みを停止し、それよりグリシン処理
液中のDO濃度が０になるまでの時間を測定したところ11
minを要した。
又、DO濃度を飽和に近い状態（6.5ppm）に空気の吹込
みを続けて、酵素消費量の経時変化を調べると添付の第
１図に示すように、グリシン処理直後の酸素消費量を10
0％とすると空気吹き込み処理時間を経ると共に酸素消
費量は減少した。
みを続けて、酵素消費量の経時変化を調べると添付の第
１図に示すように、グリシン処理直後の酸素消費量を10
0％とすると空気吹き込み処理時間を経ると共に酸素消
費量は減少した。
DO測定法：マルビシェンジ社製の溶存酸素指示計（DY
−２型；ガルバニ電極タイプ）を用いた。
−２型；ガルバニ電極タイプ）を用いた。
実施例１ 実験例１に示した方法でエシェリヒア・コリMT−1035
0の菌株を培養した菌体を、遠心分離により集菌した。
得られた菌体40gは、溶存酸素濃度計、pH計、攪拌機、
スーパージャー付通気ノズルおよび温度調整機の付いた
１フラスコに125gの蒸留水に36gグリシンを溶解し、p
Hを7.5に調整した溶液中へ加えた。40℃で16時間無通気
のまま緩やかに攪拌を行ない、次に、溶存酸素濃度が1p
pm以上に保たれるように、40℃で４時間通気を行った。
0の菌株を培養した菌体を、遠心分離により集菌した。
得られた菌体40gは、溶存酸素濃度計、pH計、攪拌機、
スーパージャー付通気ノズルおよび温度調整機の付いた
１フラスコに125gの蒸留水に36gグリシンを溶解し、p
Hを7.5に調整した溶液中へ加えた。40℃で16時間無通気
のまま緩やかに攪拌を行ない、次に、溶存酸素濃度が1p
pm以上に保たれるように、40℃で４時間通気を行った。
このようにして得られた通気処理液200gはホルマリン
フィード用ポンプおよびpH計、攪拌機、温度調整機の付
いた２−反応器に、前もっと調整した700gの蒸留水に
340gのグリシン、1.0gのテトラヒドロ葉酸及び20mgのピ
リドキサルリン酸を混合した反応溶液に加えた。
フィード用ポンプおよびpH計、攪拌機、温度調整機の付
いた２−反応器に、前もっと調整した700gの蒸留水に
340gのグリシン、1.0gのテトラヒドロ葉酸及び20mgのピ
リドキサルリン酸を混合した反応溶液に加えた。
通気処理液を加えた後、反応溶液を50℃に加温して、
pHを6.7にNaOHで調整した。次に、反応液中のホルマリ
ン濃度を分析しながら、反応液中のホルマリン濃度を次
式を満たす許容範囲；｛（ホルマリン濃度mM＝（20mM＋
（10mM）＊（反応経過時間）｝以下になるように制御し
て反応を行った。
pHを6.7にNaOHで調整した。次に、反応液中のホルマリ
ン濃度を分析しながら、反応液中のホルマリン濃度を次
式を満たす許容範囲；｛（ホルマリン濃度mM＝（20mM＋
（10mM）＊（反応経過時間）｝以下になるように制御し
て反応を行った。
一方、反応液のpHを1N−NaOHの添加にてpH6.6に保っ
た。反応は35時間行った。所定時間反応後反応液中のＬ
−セリン及びグリシン濃度をHPLCにて分析を行い、425g
のＬ−セリンの生成を認めた。
た。反応は35時間行った。所定時間反応後反応液中のＬ
−セリン及びグリシン濃度をHPLCにて分析を行い、425g
のＬ−セリンの生成を認めた。
反応終了後、反応液に硫酸を加えpHを4.0とし、活性
炭21.3g（PMSX 三井製薬製）を加え90℃にて１時間加
熱後、熱濾過を行い、濾液を反応液の半分量まで減圧濃
縮し、冷却晶析後、濾過した。
炭21.3g（PMSX 三井製薬製）を加え90℃にて１時間加
熱後、熱濾過を行い、濾液を反応液の半分量まで減圧濃
縮し、冷却晶析後、濾過した。
濾別した結晶を乾燥後127.5gのＬ−セリンを得た。Ｌ
−セリンは純度99.4％、施光度＋15.2であった。
−セリンは純度99.4％、施光度＋15.2であった。
エシェリヒア・コリ（MT−10351）も同様の操作を行
い表−４の結果を得た。
い表−４の結果を得た。
対ホルマリン収率： 生成Ｌ−セリン（mol）／消費ホルマリン（mol） セリン選択率： 生成Ｌ−セリン（mol）／消費グリシン（mol） 実施例２ エシェリヒア・コリMT−10350を実験例２と同様に培
養集菌後、湿菌体を蒸留水に菌体濃度が2.5％（乾燥菌
体の重量％）になるように懸濁し、pHを7.5にNaOHにて
調整後、40℃にて、溶存酸素濃度を１〜4ppmに保ち、４
時間、通気攪拌を行なった。次に、超音波破砕機にて菌
体を破砕処理し、処理後のSHMT活性を測定した結果、SH
MT活性は200U/mlであった。375gのグリシン、1.00gのテ
トラヒドロ葉酸及び20mgのピリドキサルリン酸を700gの
蒸留水に加えpHを6.7にNaOHで調整し、50℃に加温した
基質溶液を、pH計、攪拌機、N2ガス吹き込みノズル、ホ
ルマリンフィード用ポンプおよび温度調整機のついて遮
光２フラスコに入れた。
養集菌後、湿菌体を蒸留水に菌体濃度が2.5％（乾燥菌
体の重量％）になるように懸濁し、pHを7.5にNaOHにて
調整後、40℃にて、溶存酸素濃度を１〜4ppmに保ち、４
時間、通気攪拌を行なった。次に、超音波破砕機にて菌
体を破砕処理し、処理後のSHMT活性を測定した結果、SH
MT活性は200U/mlであった。375gのグリシン、1.00gのテ
トラヒドロ葉酸及び20mgのピリドキサルリン酸を700gの
蒸留水に加えpHを6.7にNaOHで調整し、50℃に加温した
基質溶液を、pH計、攪拌機、N2ガス吹き込みノズル、ホ
ルマリンフィード用ポンプおよび温度調整機のついて遮
光２フラスコに入れた。
更に、菌体破砕通気処理液250g加えた後、ホルマリン
フィード用ポンプにより、ホルマリン水溶液を断続的に
添加した。ホルマリンの添加速度は反応液中のホルマリ
ン濃度を分析しながら該ホルマリン濃度を実施例１と同
様に制御して行った。
フィード用ポンプにより、ホルマリン水溶液を断続的に
添加した。ホルマリンの添加速度は反応液中のホルマリ
ン濃度を分析しながら該ホルマリン濃度を実施例１と同
様に制御して行った。
また、反応液のpHを2N−NaOH水溶液の添加にて行い、
pH6.6に保った。反応は35時間行い、所定時間反応後、
反応液中のＬ−セリン濃度およびグリシン濃度の分析を
HPLCにて行った。410.0gのＬ−セリンの生成を認め、表
−５に示す反応成績を得た。
pH6.6に保った。反応は35時間行い、所定時間反応後、
反応液中のＬ−セリン濃度およびグリシン濃度の分析を
HPLCにて行った。410.0gのＬ−セリンの生成を認め、表
−５に示す反応成績を得た。
エシェリヒア・コリMT−10351も同様の操作を行い表
−５の結果を得た。
−５の結果を得た。
比較例１ 実験例１に示した方法でエシェリヒア・コリMT−1035
0の菌株を培養した菌体を遠心分離により集菌した。得
られた湿菌体40gは、溶存酸素濃度計、pH計、攪拌機、
スパージャー付通気ノズルおよび温度調整機のついた１
フラスコに125gの蒸留水に36gグリシンを溶解し、pH
を7.5に調整した溶液中へ加えた。40℃で20時間無通気
のまま緩やかに攪拌を行った。次に、340gのグリシン、
1.0gのテトラヒドロ葉酸及び20mgのピリドキサルリン酸
及び700gの蒸留水を２反応器に入れ、ホルマリンフィ
ード用ポンプおよびpH計、攪拌機、温度調整機を２反
応器に設置し、200gの無通気処理液を加えた。反応溶液
を50℃に加温して、pHを6.7にNaOHで調整した。次に、
反応液中のホルマリン濃度を分析しながら、反応液中の
ホルマリン濃度を次式を満たす許容範囲；｛（ホルマリ
ン濃度mM）＝（20mM）＋（10mM）＊（反応経過時間）｝
以下になるように制御して反応を行った。一方、反応液
のpHを1N−NaOHの添加にてpH6.6に保った。反応は35時
間行った。所定時間反応後、反応液中のＬ−セリン及び
グリシン濃度をHPCLにて分析を行い、245.6gのＬ−セリ
ンの生成を認めた。これより表−６に示す結果を得た。
0の菌株を培養した菌体を遠心分離により集菌した。得
られた湿菌体40gは、溶存酸素濃度計、pH計、攪拌機、
スパージャー付通気ノズルおよび温度調整機のついた１
フラスコに125gの蒸留水に36gグリシンを溶解し、pH
を7.5に調整した溶液中へ加えた。40℃で20時間無通気
のまま緩やかに攪拌を行った。次に、340gのグリシン、
1.0gのテトラヒドロ葉酸及び20mgのピリドキサルリン酸
及び700gの蒸留水を２反応器に入れ、ホルマリンフィ
ード用ポンプおよびpH計、攪拌機、温度調整機を２反
応器に設置し、200gの無通気処理液を加えた。反応溶液
を50℃に加温して、pHを6.7にNaOHで調整した。次に、
反応液中のホルマリン濃度を分析しながら、反応液中の
ホルマリン濃度を次式を満たす許容範囲；｛（ホルマリ
ン濃度mM）＝（20mM）＋（10mM）＊（反応経過時間）｝
以下になるように制御して反応を行った。一方、反応液
のpHを1N−NaOHの添加にてpH6.6に保った。反応は35時
間行った。所定時間反応後、反応液中のＬ−セリン及び
グリシン濃度をHPCLにて分析を行い、245.6gのＬ−セリ
ンの生成を認めた。これより表−６に示す結果を得た。
比較例２ 比較例１において、pH調整を2M−KOH水溶液にて実施
した。反応成績を表−７に示す。
した。反応成績を表−７に示す。
比較例３ エシェリヒア・コリMT−10350を実験例２と同様に培
養集菌後、湿菌体を蒸留水に菌体濃度が2.5％（乾燥菌
体の重量％）になるように懸濁し、pHを7.5にNaOHにて
調整後、溶存酸素濃度が0ppmとなるようにN2を通気しな
がら40℃にて、４時間通気攪拌を行った。次に、超音波
破砕機にて菌体を破砕処理し、処理後のSHMT活性を測定
した結果、SHMT活性は200U/mlであった。375gのグリシ
ン、1.0gのテトラヒドロ葉酸、20mgのピリドキサルリン
酸を700gの蒸留水に加えpHを6.7にNaOHで調整し、50℃
に加温して基質溶液を、pH計、攪拌機、N2ガス吹き込み
ノズル、ホルマリンフィード用ポンプおよび温度調整機
について遮光２フラスコに入れ、菌体破砕通気処理液
を250g加え、ホルマリンフィード用ポンプにより、ホル
マリン水溶液を断続的に添加した。ホルマリンの添加速
度は反応液中のホルマリン濃度を分析しながら該ホルマ
リン濃度を実施例１と同様に制御して反応した。また、
反応液のpH調整を、2N−NaOH水溶液の添加にて調整し、
pH6.6に保った。反応は35時間行い、所定時間反応後、
反応液中のＬ−セリン濃度およびグリシン濃度の分析の
HPLCにて行った。222.4gのＬ−セリンの生成を認め、表
−８に示す反応成績を得た。
養集菌後、湿菌体を蒸留水に菌体濃度が2.5％（乾燥菌
体の重量％）になるように懸濁し、pHを7.5にNaOHにて
調整後、溶存酸素濃度が0ppmとなるようにN2を通気しな
がら40℃にて、４時間通気攪拌を行った。次に、超音波
破砕機にて菌体を破砕処理し、処理後のSHMT活性を測定
した結果、SHMT活性は200U/mlであった。375gのグリシ
ン、1.0gのテトラヒドロ葉酸、20mgのピリドキサルリン
酸を700gの蒸留水に加えpHを6.7にNaOHで調整し、50℃
に加温して基質溶液を、pH計、攪拌機、N2ガス吹き込み
ノズル、ホルマリンフィード用ポンプおよび温度調整機
について遮光２フラスコに入れ、菌体破砕通気処理液
を250g加え、ホルマリンフィード用ポンプにより、ホル
マリン水溶液を断続的に添加した。ホルマリンの添加速
度は反応液中のホルマリン濃度を分析しながら該ホルマ
リン濃度を実施例１と同様に制御して反応した。また、
反応液のpH調整を、2N−NaOH水溶液の添加にて調整し、
pH6.6に保った。反応は35時間行い、所定時間反応後、
反応液中のＬ−セリン濃度およびグリシン濃度の分析の
HPLCにて行った。222.4gのＬ−セリンの生成を認め、表
−８に示す反応成績を得た。
第１図は実験例４において０〜８時間の処理時間におけ
る酵素消費量（％）をみた図である。
る酵素消費量（％）をみた図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−109187（ＪＰ，Ａ) 相田浩ほか編「アミノ酸発酵」＜1986 年５月30日初版＞（株式会社 学会出版 センター発行）ｐ．127−144 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (1)
- 【請求項１】酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェ
ラーゼ活性を有する、微生物の細胞もしくは、細胞処理
物の存在下、グリシンとホルムアルデヒドよりＬ−セリ
ンを製造する方法において、該細胞懸濁液もしくは該細
胞処理物溶液を60℃以下の温度で溶存酸素濃度が1ppm以
上存在する条件下、前処理した該酵素活性を有する微生
物の細胞もしくは細胞処理物を用いることを特徴とす
る、Ｌ−セリンの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26020389 | 1989-10-06 | ||
| JP1-260203 | 1989-10-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03206892A JPH03206892A (ja) | 1991-09-10 |
| JP3017264B2 true JP3017264B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=17344770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02263001A Expired - Lifetime JP3017264B2 (ja) | 1989-10-06 | 1990-10-02 | 酵素法によるｌ―セリンの製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5382517A (ja) |
| EP (1) | EP0421477B1 (ja) |
| JP (1) | JP3017264B2 (ja) |
| KR (1) | KR930006993B1 (ja) |
| CA (1) | CA2027059C (ja) |
| DE (1) | DE69021001T2 (ja) |
| DK (1) | DK0421477T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
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| 相田浩ほか編「アミノ酸発酵」＜１９８６年５月３０日初版＞（株式会社 学会出版センター発行）ｐ．１２７−１４４ |
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