CN116287038A - 一种全细胞催化制备γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种全细胞催化制备γ‑氨基丁酸的方法，该方法向副短乳杆菌的菌悬液中加入底物，通过全细胞催化法、在负压下将底物转化为γ‑氨基丁酸。进一步的，本发明优选在转化的过程中加入表面活性剂，采用六浆涡轮直叶式搅拌，通过这些改进，可以显著提高γ‑氨基丁酸的转化效率。本发明转化时间仅需4h~6h，γ‑氨基丁酸的产量短时间内最高可达500g/L以上，转化率最高可达99%，大幅度减少了合成γ‑氨基丁酸的时间，显著提高了生产效率，对工业化生产具有深远意义。

Description

一种全细胞催化制备γ-氨基丁酸的方法
技术领域
本发明涉及一种γ-氨基丁酸的制备方法，具体涉及一种安全、高效、转化效率高、γ-氨基丁酸产量高的全细胞催化制备γ-氨基丁酸的方法，属于微生物发酵工程技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的功能性非蛋白质氨基酸，具有增进脑活力、降血压、抗焦虑、调节激素分泌、治疗癫痫和保肝护肾等生理功能，在食品、医药保健、饮料加工、化妆品等领域具有广泛的应用前景和市场需求。
γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法、植物富集法、微生物发酵法和生物转化法。化学合成法条件苛刻、能耗大、成本高、得率低且安全性差，不能用于食品、药品等领域。植物富集法GABA含量低，不适于规模化生产。微生物发酵法生产周期长、生产得率较低且后续分离提取较为困难，使其工业化应用受到限制。生物转化法即全细胞催化转化法由于具有操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高且分离纯化成本低等优势，越来越受到青睐。
目前常采用微生物细胞转化法来生产GABA。如专利CN102174449B涉及一种高产γ-氨基丁酸的方法，该方法通过菌种分离筛选、吖啶橙—紫外线诱变和N+注入诱变获得一株高产γ-氨基丁酸 Lactobacillusbrevis TCCC (CGMCCNO.3414) 菌株，再通过发酵培养基和发酵条件的优化以及采用生长细胞发酵和休止细胞的生物转化相偶联生产γ- 氨基丁酸，其产量在100g/L左右。该工艺采用野生菌，但其产量不高。专利CN111635898A公开了一种酶活显著提高的谷氨酸脱羧突变体及其应用，所用菌种为巨大芽孢杆菌，基于所述突变体构建重组工程菌株，通过全细胞催化法以L-谷氨酸为底物制备γ-氨基丁酸，催化体系中摩尔转化率接近100％，无副产物生产，催化时间为6~12h，γ-氨基丁酸产量最高达到625.6g/L。但该工艺过程中所用菌种为工程菌种，在培养阶段需要加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导，同时还需要加入抗生素作为筛选标记，而IPTG和抗生素对人有一定毒性，通过该工艺过程所得的产物中会有IPTG和抗生素残留的风险，而γ-氨基丁酸主要应用于食品领域，一旦出现残留对消费者会产生危害。
专利CN109722402 A公开了一种全细胞转化法生产γ-氨基丁酸的方法，其以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，异源表达巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶，通过高密度发酵培养，获得蛋白过表达的谷氨酸棒杆菌菌体细胞。以L-谷氨酸或L-谷氨酸盐为底物，利用谷氨酸棒杆菌全细胞催化生产γ-氨基丁酸，催化5～24小时γ-氨基丁酸产量420～600g/L。该工艺同样使用工程菌，在种子培养基中会添加氯霉素作为筛选标记重组菌，同时需要IPTG诱导，上述物质均可能残留到最终产品中，长期使用对健康人群造成危害。
专利CN107475151B筛选出了一株高产γ-氨基丁酸副短乳酸杆菌（Lactobacillusparabrevis）HX12-19，其菌种从食品材料中分离筛选获得，安全性高，可用于食品等领域；采用传统发酵和生物转化分段控制，充分利用生物酶转化得到产物γ-氨基丁酸，大大提高生产效率，降低成本，发酵产率可达235 g/L。该专利在现有行业中以野生菌乳酸菌进行细胞转化已达到较高水平，但仍有进一步提高的可能性。
发明内容
针对目前全细胞转化法生产γ-氨基丁酸存在的转化效率低问题，本发明提供了一种全细胞催化制备γ-氨基丁酸的方法，该方法具有全细胞转化法具有的操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高、分离纯化成本低等优势；且该方法转化过程中采用负压，提高了γ-氨基丁酸的产量和转化率。
本发明具体技术方案如下：
一种全细胞催化制备γ-氨基丁酸的方法，该方法包括以下步骤：向副短乳杆菌的菌悬液中加入底物，在负压下通过全细胞催化法将底物转化为γ-氨基丁酸。
进一步的，上述方法中，所述全细胞催化法指的是背景技术中提到的生物转化法，又称微生物细胞转化法、全细胞转化法，即通过微生物菌体中的酶作为催化剂进行化学转化，将底物转化为γ-氨基丁酸。
进一步的，上述方法中，所述底物可以为谷氨酸钠，也可以为谷氨酸。采用谷氨酸钠做底物时，会导致转化体系钠离子浓度过高、渗透压过高，从而使菌体细胞失水破裂，胞内酶释放引起酶活及转化率下降。谷氨酸为底物，相比于谷氨酸钠不会造成转化体系渗透压过高，转化率更高，同时谷氨酸为底物不会产生无机盐副产物，不需要脱盐工艺，提高了生产效率和工艺简洁性。因此，优选的，底物为谷氨酸。
进一步的，在菌悬液中加入底物，底物浓度为500～900g/L，更优选为700～800g/L。
进一步的，本发明方法中，全细胞催化在负压下进行，即在低于大气压的情况下进行，整个转化过程中，保持体系为负压，负压压力为-0.1Mpa~-0.01Mpa。负压可以通过抽真空的方式实现，抽真空可将脱羧反应转化产生的副产物二氧化碳更高效的从水相转化成气相并随负压抽走，解除了产物抑制作用，利于反应平衡向合成γ-氨基丁酸方向移动。二氧化碳的分离也提高了底物的溶解度，避免了二氧化碳对菌体的影响，提高了转化效率。
进一步的，所述副短乳杆菌的菌悬液是由发酵得到的副短乳杆菌菌体用水重新悬浮得到的。首先采用发酵法培养得到副短乳杆菌发酵液，然后离心分离得到湿的副短乳杆菌菌体，然后将该菌体重新悬浮在水中，即可得到菌悬液。所述副短乳杆菌可以采用现有技术中报道的任意能够催化底物谷氨酸钠或谷氨酸转化为γ-氨基丁酸的副短乳杆菌，副短乳杆菌菌体的发酵得到方式可以采用现有技术中报道的方法，一般都是采用菌种培养得到种子液，然后种子液加入发酵培养基中进行发酵培养得到发酵液的方式。
进一步的，菌悬液中菌体的浓度为5~10g/L。
优选的，所述副短乳杆菌为副短乳杆菌（Lactobacillus parabrevis）HX12-19，其保藏编号为：CCTCCM2017307。该副短乳杆菌HX12-19已经在专利CN107475151B中进行了详细的报道，其发酵培养方法也可以参照该专利中记载的方法进行。在实际使用时，可以采用CN107475151B中记载的方法得到发酵液，然后将发酵液离心，得到菌体。
在本发明某一具体实施方式中，在发酵得到副短乳杆菌菌体时，发酵至菌体密度为OD 600＞2.5时结束发酵，得到发酵液，发酵液经离心得到副短乳杆菌菌体。发酵培养时，用磷酸调控pH值为4-6，培养温度为30± 2℃。
进一步的，在全细胞催化转化时，除了在负压条件下进行外，对转化温度和体系pH也有一定要求。优选的，转化温度为20~35℃。优选的，转化时体系的pH维持在4.7-5.0，pH可以通过谷氨酸的溶解来进行调整，底物谷氨酸为酸性，溶于水后可以使体系保持一定的pH，溶解的谷氨酸消耗后，继续有谷氨酸溶解进来，实现动态最优pH平衡。
进一步的，本发明方法转化效率高，所需时间少，整个转化时间一般为4-6h，转化结束为底物L-谷氨酸或其钠盐消耗殆尽。进一步的，在转化过程中，体系一直在搅拌条件下进行，所述搅拌可以采用现有技术中常用的搅拌方式来进行，例如浆式搅拌、涡轮搅拌等，优选为涡轮搅拌，更优选为六浆涡轮直叶式搅拌。六浆涡轮直叶式搅拌可以有效地增加转化液径向及轴向的运动，从而使得转化液中所含的二氧化碳能够较高效率在负压下以气体形式释放到空气中，进一步提高底物谷氨酸的溶解度以及转化效率。
进一步的，在转化过程中，优选的可以向菌悬液中加入表面活性剂，以提高转化效率。所述表面活性剂可以为豆油、玉米油、聚二甲基硅醚、聚氧乙烯、十二烷基苯磺酸钠或脂肪酸盐（如棕榈酸钠）。
进一步的，表面活性剂在菌悬液中的含量为0.5~1g/L。
进一步的，在某一具体的实施方式中，向菌体悬浮液中加入底物，搅拌，维持一定温度，保持负压进行转化。在某一具体的实施方式中，向菌体悬浮液中加入底物，涡轮搅拌，维持一定温度，保持负压进行转化。在某一具体的实施方式中，向菌体悬浮液中加入底物，六浆涡轮直叶式搅拌，维持一定温度，保持负压进行转化。在某一具体的实施方式中，向菌体悬浮液中加入底物和表面活性剂，搅拌，维持一定温度，保持负压进行转化。在某一具体的实施方式中，向菌体悬浮液中加入底物和表面活性剂，涡轮搅拌，维持一定温度，保持负压进行转化。在某一具体的实施方式中，向菌体悬浮液中加入底物和表面活性剂，六浆涡轮直叶式搅拌，维持一定温度，保持负压进行转化。
本发明具有以下优点：
1、本发明在转化过程中采用负压抽真空的方式，可将脱羧反应转化产生的副产物二氧化碳更高效从水相转化成气相并随负压抽走，解除了产物抑制作用，利于反应平衡向合成γ-氨基丁酸方向移动。另外二氧化碳的浓度过高会使得转化体系中碳酸浓度较高，而高浓度的HCO-会引起细胞膜膜电位的电荷密度过高，从而导致对底物的跨膜运输途径受阻，影响转化效率，菌体细胞最终会发生形态改变，代谢受到抑制导致菌体破碎，胞内谷氨酸脱氢酶释放使得酶活下降，所以负压转化可以很好的解决这一不利因素影响。
2、转化体系中的底物谷氨酸在水中的溶解度较低，随着负压转化过程中二氧化碳被抽走，其含量降低，进而减少溶液中碳酸含量，实现pH上升，从而较高的pH值能够增加底物谷氨酸的溶解度，底物含量提高从而引起脱羧反应正向移动，提高γ-氨基丁酸的转化效率，也可以很好解决谷氨酸溶解度问题。
3、本发明优选以谷氨酸作为底物进行转化，谷氨酸可以有效避免采用高浓度的谷氨酸钠做底物时钠离子浓度高的问题，避免了转化体系渗透压过高、菌体细胞失水破裂，避免了胞内酶释放引起酶活及转化率大幅度下降，有效提高了转化效率，同时谷氨酸在工业生产中不需要采用额外的脱盐工艺，可大大提高生产效率。
4、本发明转化体系优选采用六桨涡轮直叶式搅拌，可以有效地增加转化液径向及轴向的运动，从而使得转化液中所含的二氧化碳能够较高效率在负压下以气体形式释放到空气中，进一步提高底物谷氨酸的溶解度以及转化效率。
5、本发明转化体系中优选加入表面活性剂，可以提高细胞膜的通透性，降低细胞表面张力，高效实现底物的跨膜运输实现胞内转化、胞外分泌的作用。
6、本发明转化时间仅需4h~6h，γ-氨基丁酸的产量短时间内可累计高达500g/L以上，转化率可将近100%，大幅度减少了合成γ-氨基丁酸的时间，显著提高了生产效率，对工业化生产具有深远意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。下述实施例中，如无特别说明，所述术语均为现有技术中定义的含义，所述操作均在现有技术中有相关报道。
下述实施例中，如无特别说明，所述浓度均为质量百分浓度。
下述实施例中，以CN107475151B中报道的副短乳杆菌（Lactobacillusparabrevis）HX12-19来验证本发明制备方法的优势，但并不表示本发明方法仅适用于这一种菌种。
副短乳杆菌（Lactobacillus parabrevis）HX12-19湿菌体的制备方法为：将试管斜面的副短乳杆菌HX12-19接入100ml液体种子培养基中，摇瓶静置30℃培养，培养15~20h，获得种子液；将种子液按照1%的接种量接入3L发酵培养基中，通气量为0.1vvm，转速为20rpm，30℃培养20 h，期间通过补加磷酸控制pH值在4~6之间，菌体OD600为2.8时结束发酵，获得发酵液，发酵液经离心机8000rpm离心收集菌体，弃上清液，得湿菌体40g。
其中，液体种子培养基为MRS培养基；发酵培养基的配方为：碳源葡萄糖10g/L，氮源为酵母粉10g/L，胰蛋白胨10g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，微量元素为硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.3g/L。
实施例1
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.8g棕榈酸钠和0.8kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、转化过程中pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例2
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入1.0g十二烷基苯磺酸钠和0.7kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.01Mpa、转化过程中pH值为4.7-5.0、温度为20℃，催化转化4h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例3
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.8g豆油和0.8kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.01Mpa、转化过程中pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例4
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入1.0g棕榈酸钠和0.5kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化4h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例5
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入1.0g棕榈酸钠和0.9kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化6h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例6
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入1.0g棕榈酸钠和0.8kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例7
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.5g棕榈酸钠和0.8kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例8
取5g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.8g棕榈酸钠和0.8kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例9
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.8kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例10
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.8g椰油酰二乙醇酰胺和0.8kg谷氨酸，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例11
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，用1L纯化水悬浮，加入0.8g棕榈酸钠和0.8kg的谷氨酸，全程采用四叶旋桨式搅拌形式，搅拌均匀后，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化6h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例12
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.4kgL-谷氨酸钠，全程采用六浆涡轮直叶式搅拌形式，反应期间随着pH值的不断升高，间断添加盐酸和0.4kg的L-谷氨酸钠，通过补加盐酸控制pH值为4.7-5.0之间，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例13
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.8kg谷氨酸，全程采用四叶旋桨式搅拌形式，搅拌均匀后，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
实施例14
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.4kg谷氨酸钠，全程采用四叶旋桨式搅拌形式，反应期间随着pH值的不断升高，间断添加盐酸和0.4kg的L-谷氨酸钠，通过补加盐酸控制pH值为4.7-5.0之间，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa、温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
对比例1
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，用1L纯化水悬浮，加入0.8kg的谷氨酸，全程采用四叶旋桨式搅拌形式，搅拌均匀后，保持常压，pH值为4.7-5.0、温度为30℃，催化转化6h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
对比例2
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.4kg谷氨酸钠，全程采用四叶旋桨式搅拌形式，保持常压，反应期间随着pH值的不断升高，间断添加盐酸和0.4kg的L-谷氨酸钠，通过补加盐酸控制pH值为4.7-5.0之间，温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
对比例3
取10g副短乳杆菌HX12-19湿菌体，置于3L罐体中，并用1L纯化水悬浮，加入0.8kg谷氨酸钠，全程采用四叶旋浆式搅拌形式，用真空泵抽真空，保持反应体系中的压力为-0.1Mpa，通过补加盐酸控制pH值为4.7-5.0之间，温度为30℃，催化转化5h，然后离心收集上清液，上清液经过0.22μm滤芯过滤，液相检测γ-氨基丁酸含量，并计算转化率。
验证例γ-氨基丁酸及谷氨酸（钠）检测
1、仪器：
配有紫外检测器、自动进样器和数据处理系统的高效液相色谱仪；
色谱柱：Hypersil ODS C18 ，5μm，4.6×250mm（同等或以上分离效果的色谱柱）；
分析天平：精度0.1mg；
超声波溶解器；
微孔过滤器；
容量瓶：100mL；
针头过滤器(0.22μm)。
2、试剂：
除非特别说明，在分析中所使用试剂均为分析纯。
甲醇：色谱级；乙腈：色谱级；邻苯二醛（OPA）；结晶乙酸钠；冰醋酸；γ-氨基丁酸标准品：纯度≥99.0%；谷氨酸标准品：纯度≥99.0%；硼酸；氢氧化钠。
3、分析步骤
（1）标准溶液的制备
精确称取0.5g γ-氨基丁酸或谷氨酸（钠）标准品，用水溶解定容至100mL，混合均匀后取10mL定容至100mL，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，作为标准溶液。
（2）样品溶液的制备
精确量取0.5ml实施例及对比例的样品，用水稀释定容至100mL，混合均匀后取10mL定容至100mL，用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液，作为待测样品溶液。
（3）0.4mol/L硼酸缓冲液的制备
准确称取2.47g硼酸，加水约80mL，用氢氧化钠调pH值10.2，用水定容至100mL。
（4）衍生试剂的制备
称取0.1g邻苯二醛（OPA）用1mL乙腈溶解，加130 μL巯基乙醇，用0.4 mol/L硼酸缓冲液定容至10 mL。
（5）柱前衍生化
应用自动进样器进行柱前衍生，柱前衍生步骤如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（6）色谱分析条件
流动相
A相：称取7.5g结晶乙酸钠，用水溶解定容至1000 mL，滴加5%的醋酸调pH值至7.20±0.02，过滤，备用。
B相：色谱纯乙腈过滤，备用。
运行方法时流动相配比为：75%的A相+25%的B相（体积比）。
流速：1.0 mL/min。
检测波长：338 nm。
柱温：40℃。
（7）试样测定
记录色谱峰的保留时间和峰面积，试样与标准溶液的保留时间应保持一致。以外标法计算出相应的γ-氨基丁酸或谷氨酸（钠）的浓度。
（8）结果计算：
样品中γ-氨基丁酸或谷氨酸（钠）的含量按下式计算：
Figure 924108DEST_PATH_IMAGE002
式中：
X1——样品中γ-氨基丁酸或谷氨酸（钠）的含量，单位为g/L；
Ai——样品中γ-氨基丁酸或谷氨酸（钠）的峰面积；
AS——γ-氨基丁酸或谷氨酸（钠）标准品的峰面积；
CS——γ-氨基丁酸或谷氨酸（钠）标准品稀释液的浓度，单位为g/L；
n—— 样品的稀释倍数；
C—— 标准品的纯度；
转化率 = (添加谷氨酸（钠）的量-剩余的谷氨酸（钠）的量)/添加谷氨酸（钠）的量*100%
（9）实验结果，如下表1所示：
Figure 942486DEST_PATH_IMAGE003
从上述结果中可以看出，在负压基础上增加六浆涡轮直叶式搅拌和不同的表面活性剂能进一步提高产量，转化率最高可达99%，γ-氨基丁酸累积浓度最高可达604g/L，说明本发明方案有很好的提高转化效率的作用。

Claims (10)

1.一种全细胞催化制备γ-氨基丁酸的方法，其特征是：向副短乳杆菌的菌悬液中加入底物，通过全细胞催化法、在负压下将底物转化为γ-氨基丁酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述底物为谷氨酸；优选的，底物在菌悬液中的初始浓度为500～900g/L，更优选为700～800g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：整个转化过程中，保持体系的压力为-0.1Mpa~-0.01Mpa。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：副短乳杆菌的菌悬液是由发酵得到的副短乳杆菌菌体用水重新悬浮得到的；优选的，菌悬液中菌体的浓度为5~10g/L。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：转化时的温度为20~35℃；转化时的pH为4.7-5.0；转化时间为4-6h。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：在菌悬液中还含有表面活性剂，所述表面活性剂为豆油、玉米油、聚二甲基硅醚、聚氧乙烯、十二烷基苯磺酸钠或脂肪酸盐。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是：表面活性剂在菌悬液中的含量为0.5~1g/L。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征是：整个转化过程在搅拌下进行；优选的，所述搅拌方式为浆式搅拌或/和涡轮搅拌，更优选为涡轮搅拌，更更优选为六浆涡轮直叶式搅拌。
9.根据权利要求1或4所述的方法，其特征是：所述副短乳杆菌为副短乳杆菌（Lactobacillus parabrevis）HX12-19，其保藏编号为：CCTCCM2017307。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征是：发酵制备短乳杆菌菌体时，发酵至菌体密度为OD 600＞2.5时结束发酵，得到发酵液，发酵液经离心得到短乳杆菌菌体。
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