JP2006528486A - カンジダトロピカリスｃｊ−ｆｉｄ菌株（ｋｃｔｃ１０４５７ｂｐ）およびそれを利用したキシリトールの生産方法 - Google Patents

Abstract

蜂蜜から分離した新たなカンジダトロピカリス（カンジダトロピカリスＣＪ−ＦＩＤ）（寄託番号ＫＣＴＣ１０４５７ＢＰ）を直接またはアルギン酸に固定化した後、高濃度のキシロースおよびスクロースを含有する発酵培地で培養してキシリトールが生成された培養液を得、収得されたキシリトールを含有した培養液から活性炭カラムおよび陰イオンカラムを利用して精製した後、最終的に粉末状のキシリトールを得る方法を提供することによって、高生産性、高収率および高純度のキシリトールを製造できる。

Description

本発明は、新たな菌株であるカンジダトロピカリスＣＪ−ＦＩＤおよびそれを利用したキシリトール(ザイルリトル)の生産方法に関する。さらに詳細には、蜂蜜から分離した新たなカンジダトロピカリスＣＪ−ＦＩＤおよびを直接またはアルギン酸で固定化した後、高濃度のキシロースおよびスクロースを含有する発酵培地で培養してキシリトールが生成された培養液を得、収得されたキシリトールを含有した培養液から活性炭カラムおよび陰イオンカラムを利用してキシリトールを精製した後、最終的に粉末状のキシリトールを得る方法を提供することによって、高生産性、高収率および高純度のキシリトールを製造する方法に関する。

キシリトールは、５炭糖であるキシロースの還元性末端基に水素が添加されてアルコール基に還元された糖アルコールであって、自然界の果物、野菜および茸などの植物体に少量存在し、また、哺乳動物の炭水化物代謝の中間産物として知られている。キシリトールは、化学構造上の特徴によって、他の糖類に比べて安定性が高く、親水力が高く、褐色化反応を起こさない。

キシリトールは、スクロースのような甘味度を表しつつも低カロリーであり、血糖値の増加や歯の齲蝕症などを誘発しないため、砂糖代替甘味料として優秀性が立証されている（非特許文献１）。人体に吸収される過程において、能動拡散方式により腸管で吸収されるが、吸収される速度が非常に遅いため完全には吸収されずに排泄され、吸収されたキシリトールは、腸内細菌によって分解され、一部のみが人体に利用されるため、低カロリー甘味料に分類される。

特に、キシリトールは、キシリトールが細胞組織内に吸収されるとき、インシュリンを必要としないため、糖尿病患者のための代用糖として使われている。さらに、甘味度がスクロースと類似しており、溶解される時に熱低下が起こる特性によって口内で感じる清涼感が高く、菓子製品およびおよびガム類の食品の色々な分野で応用されており、またムシ歯の発生と関連するミュータンス連鎖球菌の生育を阻害することにより虫歯の発生を抑制する効果があるため、歯磨き粉などの原料として使われている。

キシリトールは、野菜や果物などに存在するが、その量が微量であるので、それを自然的に分離することは経済的でないという問題点があった。すなわち、従来のキシリトールは、木材、稲わらまたは黍の中に存在するヘミセルロースから加水分解されて出たキシロースを、高温、高圧の条件でキシリトールに還元する化学的な方法が主に使われてきたが、このような化学的方法は、キシロースまたはキシリトールとへミセルロース部分で生じる他の高分子糖の加水分解物との分離および精製が容易でないだけでなく、その収率も５０〜６０％ほどと低い。また、高温高圧の反応による危険性および酸やアルカリ使用による廃棄物の問題が存在するという短所がある。

キシリトールを生産する別の方法は、微生物を触媒として使用し、培地中のキシロースをキシリトールに生物転換させることである。すなわち、培地から細胞膜を通過して細胞内に輸送されたキシロースが、ＮＡＤＰＨを助酵素として使用するキシロース還元酵素（ＸＲ）によってキシリトールに転換され、このキシリトールが細胞内に過量蓄積された後に細胞の外に排出されることである。前記微生物による方法は、反応後のキシロースの完全消費によって、キシロースとキシリトールとの分離工程を必要とせず、また常温および常圧の反応条件などの長所があるが、発酵液には副生される有機酸およびグリセロールを含有する場合がほとんどであり、培地成分や微生物自体由来の成分が含まれているため、このような成分のみを効果的に除去して高純度のキシリトールを効率的に精製することは難しく、生産収率も低いという問題点があった。

特許文献１では、グルコノバクターオキシダン（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ ＡＴＣＣ ６２１）を利用して、アラビトールからキシリトールを生産し、最終４５ｇ／Ｌのキシリトール溶液２００ｍｌを製造した後、これを精製に使用しているが、これは、正確に精製収率が計算されていないだけでなく、低濃度（５０ｇ／Ｌ）のキシリトール溶液を使用することによって、高濃度、高効率のキシリトールを精製する工程ではないため、産業化には困難さがあるという問題点があった。したがって最近では、このような短所を解決するために、新たな酵母菌株の分離およびそれを利用したキシリトールの生産方法についての多くの研究が進められつつある。
韓国特許出願公開第１０−２００１−４９９１８号公報 ＭｃＮｕｔｔＫ.，Ａ.Ｓｅｎｔｋｉ．１９９６．Ｓｕｇａｒ ｒｅｐｌａｃｅｒｓ：ａｇｒｏｗｉｎｇ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ ｉｎｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ｎｕｔｒ．Ｔｏｄａｙ．３１（６）：ｐｐ２５５−２６１

本発明は、新たなカンジダトロピカリスＣＪ−ＦＩＤ菌株を提供し、高生産性、高収率および高純度のキシリトールを生産する方法を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために本発明は、キシリトールを生産することを特徴とするカンジダトロピカリス菌株ＣＪ−ＦＩＤ（ＫＣＴＣ１０４５７ＢＰ）を提供する。
また本発明は、アルギン酸水溶液にカンジダトロピカリス菌株を加えて均質に攪拌した後、この溶液をカルシウム塩に滴下して形成されたアルギン酸ビード(アルギネート)を提供する。

また本発明は、キシリトールの生産方法において、キシロースおよびスクロースを含有するキシリトール生産発酵培地を製造するステップと、前記製造された発酵培地に前記カンジダトロピカリス菌株含有のアルギン酸ビードを接種するステップと、前記接種された発酵培地を発酵槽で発酵するステップと、を含んでなることを特徴とするキシリトールの生産方法を提供する。

前記キシリトールの生産方法には、前記発酵ステップで生産されたキシリトール含有発酵液を、活性炭カラムを通じて精製するステップと、前記活性炭カラムで精製されたキシリトール液を、陰イオンカラムを通じて精製するステップと、前記陰イオンカラムを通じて精製されたキシリトール液からキシリトール粉末を製造するステップと、をさらに含んでなる。

以下、本発明について詳細に説明すれば、次の通りである。

キシリトール生産酵母菌株の分離
韓国内の産地で採取された天然蜂蜜試料を滅菌されたチューブで適当に希薄した後、キシロース２００から４００ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、アガー１５から２０ｇ／Ｌが含まれた平板の培地を利用して３０℃で培養した後、前記条件で成長が速い酵母菌株を中心に単一群落を選別した。

キシリトール生産酵母菌株の同定
前述した条件下で耐糖性およびキシリトール生成能に優れる酵母菌株を選別して、これを形態学的・生理学的特性を基礎として分類し、２６ＳｒＲＮＡの塩基配列分析を通じて配列表１の塩基配列を得ることによって最終的に同定し、同定された菌株をカンジダトロピカリスＣＪ−ＦＩＤと命名し、生命工学研究所の遺伝子バンクに受託番号ＫＣＴＣ１０４５７ＢＰで寄託した。

キシリトール生成能の調査
選別した酵母菌株のキシリトール生成能を調べるために選別された単一群落を、キシロース２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、スクロース２ｇ／Ｌの添加された培地５０ｍＬが入っている２５０ｍＬのフラスコに接種して振とう培養器で２００ｒｐｍ、３０℃で１２時間種培養した。この後、キシロース１００ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、スクロース１０ｇ／Ｌが添加された本培養用培地１００ｍＬが入っている５００ｍＬのフラスコに５％接種して振とう培養器で１５０ｒｐｍ、３０℃で４２時間培養した。培養後に一定の時間間隔で培養液の一部の試料を採取した後、キシリトールの生成如何を調べた。

キシロースおよびキシリトールの分析
生成されたキシリトールおよびキシロースの分析は、採取した試料を、遠心分離機を利用して１２,０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を除去し、上澄み液のみをクロマシル１００−１０ ＮＨ２ カラム（デンマーク）が装着されたＨＰＬＣ（島津、日本）のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅＩｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（島津 Ｃ−Ｒ６Ａ、日本）を利用して測定した。このとき、溶媒は、９０％のアセトニトリルを使用し、流速は２.０ｍＬ／分であった。菌体濃度は、濁度計を利用して６００ｎｍで懸濁度を測定し、あらかじめ測定した標準曲線を利用して乾燥重量に換算した。

カンジダトロピカリスの固定化
固定化細胞を製造するために食品用アルギン酸溶液（３％、ｗ／ｖ）を製造した後、ここに同量の細胞濃縮液を混合して攪拌する。これを、ビード製造器を利用して１００ｍＭの塩化カルシウム溶液に滴下してビードを形成し、製造されたアルギン酸ビードは、４℃で１２時間保管してビードの強度を高めた後、実験に使用した。

カンジダトロピカリスを利用したキシリトールの発酵方法
酵母抽出物０.１から１０ｇ／Ｌ、ペプトン０.１から１０ｇ／Ｌ、およびスクロース０.１から５０ｇ／Ｌを含有し、キシロースが含まれた発酵培地を発酵槽に投入した後、前記カンジダトロピカリスＣＪ−ＦＩＤ（ＫＣＴＣ１０４５７ＢＰ）を直接接種またはアルギン酸で固定化された菌株を接種し、培養温度を２５から３５℃で発酵槽の攪拌速度を２００から３００ｒｐｍに調節して発酵を行う。前記発酵は、通気量が０.５から２ｖｖｍでなされ、６０から１００時間発酵させた後、前記培地を遠心分離して細胞を除去し、上澄み液からキシリトールを回収する。

前記培地に投入されるキシロースの量は、５０から２００ｇ／Ｌが望ましく、さらに望ましくは、８０から１５０ｇ／Ｌである。もし、キシロースの量が５０ｇ／Ｌ未満である場合には、キシリトールの生産収率が低くなり、２００ｇ／Ｌを超える場合には、生産性がそれ以上向上しない。前記培地には、生産性を向上させるためにリン酸化カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）０.１から５ｇ／Ｌ、硫化マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）０.５から５ｇ／Ｌが追加されうる。

キシリトール発酵液の精製方法
前記で収得された培養液から高純度に精製されたキシリトール粉末を製造するために、高さ６０ｃｍ、直径１０ｃｍのカラムに３００ｇの活性炭を充填した後、収得されたキシリトール培養液を通過させて脱臭および脱色した。得られた分取液は、高さ６０ｃｍ、直径１０ｃｍのカラムに陰イオン樹脂が充填された陰イオンカラムを通過させてキシリトール溶液内の不純物を除去した。このように得られたキシリトール溶液をＨＰＬＣで分析した結果、溶液内には、純粋なキシリトールのみが存在するということを確認した。

分取されたキシリトール溶液を、濃縮装置を利用して８００ｇ／Ｌ以上の濃度で濃縮した後、４℃で結晶化させ、酒精用エタノールを添加して攪拌し、結晶キシリトールのサイズを微細化した。これを、真空濾過装置を利用してエタノールおよび水分を一部除去し、真空乾燥器を使用してキシリトール粉末内に存在するエタノールおよび水分を除去し、最終キシリトール粉末を製造した。
（図面の簡単な説明）
図１は、初期キシロース濃度によるキシリトールの生産程度を示すグラフである。
図２は、初期菌体濃度によるキシリトールの生産程度を示すグラフである。
図３は、アルギン酸に固定化する時に使われる細胞濃度によるキシリトールの生産性および収率の変化を示すグラフである。
図４は、アルギン酸ビード量によるキシリトールの生産性および収率の変化を示すグラフである。
図５は、アルギン酸に固定化する際の酵母細胞の種培養時間によるキシリトール生産収率および生産量の変化を示すグラフである。
図６は、アルギン酸に固定化された酵母細胞を使用して、前記実験で最適化された条件で、２Ｌの発酵槽での経時的なキシリトール生産性および収率の変化を示すグラフである。
図７は、アルギン酸に固定化された酵母細胞を使用して、前記実験で最適化された条件で、１７Ｌの発酵槽での経時的なキシリトール生産性および収率の変化を示すグラフである。
図８は、収得されたキシリトール培養液を活性炭カラムに通過させて得られた分取液内のキシリトール濃度の変化を示すグラフである。
図９は、図８で得られた分取液を陰イオンカラムに通過させて得られた分取液内のキシリトール濃度の変化を示すグラフである。
図１０は、図９で得られた分取液を高速液体クロマトグラフィで分析したクロマトグラムである。
図１１は、図９で得られた分取液を濃度別に濃縮した後、結晶化される程度を示すグラフである。

下記の実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。

初期キシロース濃度によるキシリトール生成能
前述したように種培養を実施した後、キシリトール生産のための本培養では、酵母抽出物０.５、ペプトン５ｇ／Ｌ、スクロース１０から３０ｇ／Ｌが添加された培地にキシロースを１００から３００ｇ／Ｌに変化させて添加した後、培地体積を１０Ｌにして１５Ｌの発酵槽（韓国発酵器（株））を使用して発酵を行った。発酵過程中、攪拌速度は２５０ｒｐｍに調節し、通気量は１.０ｖｖｍ、培養温度は３０℃に調節した後、初期キシロース濃度によるキシリトール生成能を調べ、その結果を図１に示した。

図１に示したように、最大キシリトール生産量は、１８７ｇ／Ｌであり、生産収率は９３.５％と非常に優秀であり、スクロースを添加することによってキシリトール生産収率が向上するということが分かる。

初期菌体濃度によるキシリトール生成能
前述したように種培養を実施した後、キシリトール生産のための本培養では、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、スクロース１０ｇ／Ｌ、およびキシロース１００ｇ／Ｌが添加された培地体積を１０Ｌにし、１５Ｌの発酵槽（韓国発酵器（株））を使用して発酵を行った。発酵過程中に、攪拌速度は２５０ｒｐｍに調節し、通気量は１.０ｖｖｍ、培養温度は３０℃に調節した後、初期菌体濃度によるキシリトール生成能を調べ、その結果を図２に示した。
図２に示したように、最大キシリトール生産量は１３２ｇ／Ｌであり、使われたキシロース対比のキシリトール生産収率は９８％と非常に優秀であるということが分かるが、高濃度キシロースによるキシリトール生産速度が低下することを確認した。

既存のキシリトール生成菌株とカンジダトロピカリスＣＪ−ＦＩＤ（ＫＣＴＣ１０４５７ＢＰ）との耐糖性の比較
前記で得られた本発明の菌株と既存のキシリトール生成菌株との耐糖性を比較して下記表１に示した。

既存のキシリトール生産可能酵母菌株との耐糖性比較

前記表１から分かるように、本発明による新たなカンジダトロピカリスＣＪ−ＦＩＤ（ＫＣＴＣ １０４５７ＢＰ）菌株は、従来公知の菌株に比べて高いキシロース濃度でも耐糖性に優れていることが分かり、これにより、高濃度のキシロース培地でキシリトールの量産が可能になる効果があるということが分かる。

アルギン酸に固定された菌体濃度によるキシリトール生成能
前述したように種培養を実施した後、アルギン酸ビード内に含まれる酵母細胞の濃度によるキシリトール生産能を測定するために、アルギン酸溶液と混合される細胞の濃度を１０〜１００（ＯＤ値）に変化させてビードを製造したあと、キシリトール生産のための本培養では、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、およびキシロース１００ｇ／Ｌが添加された培地体積を１０Ｌにして、１５Ｌの発酵槽（韓国発酵器（株））を使用して発酵を行った。発酵過程中、攪拌速度は２５０ｒｐｍに調節し、通気量は１.０ｖｖｍ、培養温度は３０℃に調節した後、初期菌体濃度によるキシリトール生成能を調べ、その結果を図３に示した。

図３に示したように、細胞の濃度が１０〜２０（ＯＤ値）であるとき、約０.５ｇ／Ｌ.Ｈであり、濃度が５０（ＯＤ値）以上で１.２５ｇ／Ｌ.Ｈに上昇し、濃度が１００（ＯＤ値）であるとき、最大キシリトール生産量の１.６５ｇ／Ｌ.Ｈであることが分かる。

ビード量によるキシリトール生成能
前記のようにビードを製造した後、キシリトールの生産に使われるキシリトール生産用培地に添加されるビードの量を２.５〜５０ｇに変化させて、２Ｌの発酵槽で前記実施例４の条件でキシリトール生産能を調べ、その結果を図４に示した。

図４に示したように、アルギン酸ビード量の変化に関係なく、キシリトールの生産量は一定に維持されるということが分かる。

種培養時期によるキシリトール生成能
前記のようにビードを製造する過程で使われる種培養細胞の培養時期によるキシリトールの生産能の変化を調べるために、酵母菌株の種をそれぞれ１２〜６０時間培養した後、実施例４の条件でキシリトール生産能を調べ、その結果を図５に示した。

図５に示したように、種培養時間に関係なく、キシリトールの生産量は一定に維持されるということが分かるが、特に、２４時間培養した場合に、最高の生産量を表しているということが分かる。

固定化された細胞の反復使用によるキシリトールの生産性および収率の変化
前記のようにビードを製造し、実施例４の発酵条件下でビードを１〜５回反復して使用した場合のキシリトールの生産性および収率を、以前発表されたアルギン酸ビードに固定化されたカンジダギリエルモンディ（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＦＴＩ２００３７と比較して下記の表２に示した。

固定化されたカンジダトロピカリスＣＪ−ＦＩＤ（ＫＣＴＣ １０４５７ＢＰ）菌株の反復的使用によるキシリトールの生産性および収率の変化

前記表２に示したように、固定化細胞を５回反復して使用してもその生産性および収率の低下は無いということが分かる。特に、以前発表されたカンジダギリエルモンディＦＴＩ２００３７菌株と比較して、生産性は５倍以上、収率は４５％以上高いということが分かる。

発酵時間によるキシリトール生成能
前記のようにビードを製造し、実施例４の発酵条件下で２Ｌおよび１７Ｌの発酵槽を利用した培養時間別のキシリトールの生産能を調べ、その結果を図６および図７に示した。

図６および図７に示したように、キシリトールの生産は、培養時間が６時間経過した時から増加し始めて、２Ｌの発酵槽で培養した場合、２４時間経過した時に最高生産量を示し、１７Ｌの発酵槽で培養した場合、３６時間経過した時に最高生産量を示すということが分かる。

キシリトール発酵液の精製
前記発酵液の精製方法のように、活性炭カラムおよび陰イオンカラムを通過させて得られた分取液内のキシリトール濃度の変化を図８および図９に示し、図９から得られた分取液を高速液体クロマトグラフィで分析したクロマトグラムを図１０に示し、図９から得られた分取液を濃度別に濃縮した後に結晶化される程度を図１１に示した。

図８に示したように、キシリトール発酵液を活性炭カラムに通過させた場合、分取液４部分で最高濃度を示し、図９の陰イオンカラムを通過させた場合、分取液３から５部分で最高濃度を示すということが分かり、前記活性炭カラムおよび陰イオンカラムを通過させて得た分取液が高度に精製されたキシリトールであるということを図１０のクロマトグラムを通じて確認できる。前記のように精製されたキシリトール液を濃度別に結晶化した結晶化収率は、キシリトール液の濃度が高いほど比例して、結晶化収率が向上するということが分かる。

キシリトール発酵および精製工程の段階別キシリトールの濃度および精製収率
前記発酵および精製過程でのキシリトール濃度および精製収率を、下記表３のように各段階別に調べた。

キシリトール溶液の精製工程段階別の精製収率の変化

前記表３に示したように、発酵および精製段階を通じたキシリトールの最終収率は、７７.４％の高収率であるというが分かり、各段階別に損失がほとんど無いということが分かる。

前記本発明では、記載された具体的な実施例および実験例を中心に詳細な説明があるが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これらから多様な変形および均等な他の実施形態が可能であるということが分かるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想によって決定されねばならない。

本発明による新たなカンジダトロピカリス菌株ＣＪ−ＦＩＤ（ＫＣＴＣ１０４５７ＢＰ）およびそれによるキシリトールの生産方法は、各種の培養条件および培地組成を最適化することによって、高収率、高生産性および高純度のキシリトールを生産する方法を提供することができる。

初期キシロース濃度によるキシリトールの生産程度を示すグラフである。 初期菌体濃度によるキシリトールの生産程度を示すグラフである。 アルギン酸に固定化する時に使われる細胞濃度によるキシリトールの生産性および収率の変化を示すグラフである。 アルギン酸ビード量によるキシリトールの生産性および収率の変化を示すグラフである。 アルギン酸に固定化する際の酵母細胞の種培養時間によるキシリトール生産収率および生産量の変化を示すグラフである。 アルギン酸に固定化された酵母細胞を使用して、前記実験で最適化された条件で、２Ｌの発酵槽での経時的なキシリトール生産性および収率の変化を示すグラフである。 アルギン酸に固定化された酵母細胞を使用して、前記実験で最適化された条件で、１７Ｌの発酵槽での経時的なキシリトール生産性および収率の変化を示すグラフである。 収得されたキシリトール培養液を活性炭カラムに通過させて得られた分取液内のキシリトール濃度の変化を示すグラフである。 図８で得られた分取液を陰イオンカラムに通過させて得られた分取液内のキシリトール濃度の変化を示すグラフである。 図９で得られた分取液を高速液体クロマトグラフィで分析したクロマトグラムである。 図９で得られた分取液を濃度別に濃縮した後、結晶化される程度を示すグラフである。

Claims (4)

1. キシリトール(ザイルリトル)を生産することを特徴とするカンジダトロピカリス菌株ＣＪ−ＦＩＤ（ＫＣＴＣ １０４５７ＢＰ）。
2. アルギン酸水溶液にカンジダトロピカリス菌株を加えて均質に攪拌した後、この溶液をカルシウム塩に滴下して形成されるアルギン酸ビード。
3. キシリトールの生産方法において、
   キシロースおよびスクロースを含有するキシリトール生産発酵培地を製造するステップと、
   前記製造された発酵培地に請求項２に記載のカンジダトロピカリス菌株含有のアルギン酸ビードを接種するステップと、
   前記接種された発酵培地を発酵槽で発酵するステップと、を含んでなることを特徴とするキシリトールの生産方法。
4. 前記発酵ステップで生産されたキシリトール含有の発酵液を、活性炭カラムを通じて精製するステップと、
   前記活性炭カラムで精製されたキシリトール液を、陰イオンカラムを通じて精製するステップと、
   前記陰イオンカラムを通じて精製されたキシリトール液からキシリトール粉末を製造するステップと、をさらに含んでなることを特徴とする請求項３に記載のキシリトールの生産方法。