DK168490B1 - Aureobasidium sp.-mikroorganismer, fremgangsmåde til opnåelse af disse og fremgangsmåde til fremstilling af erythritol ved anvendelse af disse - Google Patents

Description

DK 168490 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte mikroorganismer, en fremgangsmåde til opnåelse af disse og en fremgangsmåde til fremstilling af erythritol ved fermentering under anvendelse af disse prganismer. Især 5 angår opfindelsen Aureobasidium sp. SN-l24A-stammen og dens kunstige mutanter, Aureobasidium sp. SN-G42 og SN-y96, en fremgangsmåde til opnåelse af sådanne mikroorganismer og en fremgangsmåde til fremstilling af erythritol ved omdannelse af fermenterbare sukkerarter 10 til erythritol med disse mikroorganismer.

Det er velkendt, at fremstille erythritol ved fermentering under anvendelse af mikroorganismer. De mikroorganismer der hidtil har været kendt for at være i stand til at danne erythritol omfatter f.eks. dem der 15 hører til Debaryomyces sp. (U.S. patentskrift nr. 2 986 495), Pichia sp. (U.S. patentskrift nr. 2 986 495), Candida sp. (U.S. patentskrift nr. 3 756 917), Moni-liella sp.(Antonie van Leeuwenhoek, 37(1971)107-118 og sådanne) og Aureobasidium sp. (Japansk, offentliggørel-20 sesskrift nr. 61-31091).

Sådanne kendte mikroorganismer har imidlertid hidtil ikke været anvendt i industriel skala pga. alvorlige ulemper, der ikke i praksis kan negligeres.

Nærmere betegnet beskrives der i U.S. patent-25 skrift nr. 2 986 495 en fremgangsmåde til fremstilling af arabitol, glycerol og erythritol udfra monosacchari-der ved anvendelse af Pichia sp.- og Debaryomyces sp. -mikroorganismer. Ifølge denne fremgangsmåde kan der imidlertid kun fremstilles en lille mængde erythritol 30 som biprodukt, som skal skilles fra og opsamles med betydelig vanskelighed.

I U.S. patentskrift nr. 3 756 917 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af erythritol udfra car-bonhydrider ved anvendelse af Canadian sp.-mikroorga-35 nismer. Denne fremgangsmåde giver imidlertid lavt udbytte og er således uøkonomisk pga. nødvendigheden af, DK 168490 B1 2 at substratkoncentrationen er højst 20%. En anden ulempe er, at produktet ikke kan anvendes til nærings- og nydelsesmidler, idet der er en sandsynlighed for, at udgangscarbonhydriderne kan forblive i produktet.

5 I Antonie van Leeuwenhoek, 37, 107-118 (1971) og

Applied Microbiology, 12, [3]240-246 (1964) beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af erythritol ud fra glucose under anvendelse af Moniliella (Torula) sp.-mikroorganismer. Denne fremgangsmåde er kendetegnet 10 ved, at omdannelsesgraden af glucose til erythritol er høj, og at kulturmediets substratkoncentration kan øges til et relativt højt niveau, men den har den ulempe, at en stor mængde xanthangummi skal anvendes til afskum-ning, idet væsentlig skumning forekommer i kulturen.

15 I japansk fremlæggelsesskrift nr. 61-31091 bes krives fremgangsmåder til fremstilling af erythritol ud fra monosaccharider ved anvendelse af Aureobasidium sp.-mikroorganismer. Disse fremgangsmåder gør det muligt at fremstille erythritol under anvendelse af en 20 relativt høj substratkoncentration i kulturmediet og er således værdifuld på sin egen måde.

Disse fremgangsmåder er imidlertid ikke altid tilfredsstillende, idet de har de ulemper, at eryth-ritoludbyttet ikke kun er utilfredsstillende i forhold 25 til mængden af dyrkede mikroorganismeceller men også at det optimale pH-område og temperaturområde er så snævert, at der er et bemærkelsesværdigt fald af ery-thritoludbyttet, hvis sådanne faktorer blot afviger en lille smule fra det optimale område.

'30 Som et resultat af screening udført i lyset af de foranstående overvejelser af erythritolproduktivite-ten for mange mikroorganismer til opnåelse af erythri-toldannende mikroorganismer med stor industriel betydning, har det vist sig at hidtil ukendte mikroorganis-35 mer hørende til Aureobasidium sp. og isoleret fra slam i et stivelsesanglæg i Okinawa Prefecture, Japan har 3 DK 168490 B1 høj erythritolproduktivitet.

Et grundlæggende formål med opfindelsen er derfor at tilvejebringe hidtil ukendte mikroorganismer, som har høj erythritolproduktivitet og er af stor industriel betydning.

5 Et andet formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe mikroorganismer, der kan bevare høj erythritolproduktivitet selv i et kulturmedium med høj koncentration.

Yderligere et formål med den foreliggende opfin-10 delse er at tilvejebringe mikroorganismer, der kan danne stærkt hydrofile celler, som ikke giver skumning under dyrkning.

Endnu et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe fremgangsmåder til· opnåelse af så-15 danne nyttige mikroorganismer som nævnt ovenfor.

Yderligere et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe fremgangsmåder til effektiv fremstilling af erythritol ved anvendelse af sådanne mikroorganismer som nævnt ovenfor.

20 Andre formål med den foreliggende opfindelse vil fremgå af den følgende detaljerede beskrivelse.

Ifølge den foreliggende opfindelse opnås de ovennævnte formål ifølge opfindelsen med vildtype Au-reobasidium sp. SN-124A-stammen og SN-G42- og SN-y96-25 mutanterne, opnået ved kunstig mutation af denne SN-124A-stamme. Endvidere opnås de ovennævnte formål ifølge opfindelsen ved inokulering af disse stammer på et kulturmedium indeholdende fermenterbare sukkerarter og aerob dyrkning af disse til akkumulering af erythritol 30 i kulturmediet, og efterfølgende opsamling af dette.

Opfindelsen angår biologiske renkulturstammer som angivet og kendetegnet i krav 1-4.

Mikroorganisme stammen Aureobasidium sp. SN-124A ifølge opfindelsen oprensedes og isoleredes fra slam 35 fra et stivelsesanlæg i Okinawa Prefecture, Japan, på DK 168490 B1 4 sædvanlig måde (Applied Microbiology 12[l]87 (1964),

Can. J. Microbiol. 2, 72 (1956)). De vegetative celler antager en encellet eller æggeformet form og formerer sig ved multipolær celleafsnøring uden dannelse af 5 ascosporer overhovedet, og myceliet danner rigtige hyfer med et antal multi-laterale konidier af afsnøringstypen, der forekommer ved enden og siderne. Stammerne vokser hurtigt på YM-agarkulturmedium, således at en hvid koloni bliver til en sort koloni inden for 3 dage, 10 danner en film i flydende kultur, og er i stand til at omdanne fermenterbare sukkerarter til hovedproduktet erythritol og en lille mængde glycerol.

Mikroorganismestammerne Aureobasidium sp. SN-G42 og Aureobasidium sp. SN-y96 ifølge opfindelsen frem-15 stilledes ved bestråling og behandling af Aureobasidium sp. SN-124A-Stammen (moderstammen) med ultraviolette stråler og et mutagent middel og desuden om ønsket ved bestråling med gammastråler.

Fremgangsmåden til fremstilling af kunstige mu-20 tanter af Aureobesidium sp. SN-124A-stammen, der udviser høj tolerance for høj sukkerkoncentration, danner hydrofile celler, og som kan dyrkes uden væsentlig skumdannelse, er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 5 angivne.

25 Fremgangsmåden til opnåelse af sådanne mutanter vil blive forklaret nærmere i det følgende. SN-124A-mikroorganismer dyrkes aerobt på et flydende kulturmedium med en glucosekoncentration på 22% til opnåelse af et dyrket produkt, som dernæst bestråles med 30 ultraviolette stråler i et givet tidsrum. Derefter anbringes og dyrkes det dyrkede produkt på et agarkulturmedium med en glucosekoncentration på 22% til opsamling af dyrkede stammer. De således opsamlede stammer dyrkes aerobt på et flydende kulturmedium med en gluco-35 sekoncentration på 33,5% til fraskillelse af cellerne, som igen behandles med en 1 mg/ml koncentration af DK 168490 Bl 5 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin i en pufferopløsning. Dernæst overføres og dyrkes det således behandlede produkt (celler) på et agarkulturmedium med en glu-cosekoncentration på 40% til opsamling af dyrkede stam-5 mer og derved opnåelse af Aureobasidium sp. SN-G42-stammen.

Dernæst dyrkes den således opsamlede stamme i et flydende kulturmedium med en glucosekoncentration på 40%, og det dyrkede produkt bestråles med en given do-10 sis af Co-gammastråler. Derefter overføres og dyrkes de behandlede celler på et agarkulturmediym med en glucosekoncentration på 45%, og stammerne med vækst opsamles som Aureobasidium sp. SN-y96-stamme.

Idet de således fremstillede mutanter Aureobasi-15 dium sp. SN-G42 og SNy96 har en erythritolomdannelses-grad, der er større end for moderstammen, (vild-type) Aureobasidium sp. SN-124A-stammen, overgår den i tolerance med hensyn til høje sukkerkoncentration og danner hydrofile celler, er de mere foretrukne til industriel 20 produktion af erythritol.

Aureobasidium sp. SN-124A-stammen ifølge den foreliggende opfindelse har de følgende mycologiske egenskaber.

25 i. væksttilstand på kulturmedium 1) Mikroskopisk undersøgelse

Størrelsen af vegetative celler (1 ): 4-7 x 4-15 ym.

30 Form af vegetative celler (l ): Hyfe eller gær lignende, encellet eller æggeformet.

Formering af vegetative celler (1 ): hyfe- eller multipolær afsnøring af gærlignende celler.

35 Mycelium (*2): Myceliet danner rigtige hyfer med et antal konider af afsnøringstypen ved DK 168490 Bl 6 spidsen og siderne.

Note l: Dyrket på YM-agarkulturmedium .ved 27 °C i 5 dage.

Note *2: Skråkultur med kartoffelglucoseagar.

5 2) Agarskråglas (*3) Vækst: tilfredsstillende

Glans: ikke observeret.

Farvetone: Kolonierne ændrer sig fra at 10 være hvide til at blive sorte.

&

Note 3: YM-agarkulturmedium.

3) Flydende kultur (*4)

Overfladevækst: Dannelse af tyk film.

15 Turbiditetsgrad: Transparent.

Skorpe: Markeret.

Note 4: YM flydende kulturmedium.

2. Dannelse af Ascosporer 20

Kartoffelglucoseagarkulturmedium: ikke dannet.

Majsmelagarkulturmedium: ikke dannet. YM-agarkulturmedium: ikke dannet. Gulerodsekstraktkulturmedium: ikke dannet.

25 Vq - kulturmedium: ikke dannet.

3. Fysiologiske egenskaber.

Oxygenbehov: Aerob.

30 Væksttemperatur: Indtil ca. 40 °C.

Optimal væksttemperatur: 35 til 37 °C.

Vækst-pH: 2,5 til 9,5.

Optimal vækst-pH: 4 til 7.

KN03-assimilation (*5): fundet.

35 (NH4)2S04-assimilation (*5): fundet.

Nedbrydning af urinstof: fundet.

7 DK 168490 B1

Gelatinesmeltning: ikke fundet.

Dannelse af carotenoid: ikke fundet.

Dannelse af organiske syrer: fundet.

Albutin: ikke fundet.

5 Dannelse af stivelsesmaterialer: ikke fundet.

Vitaminbehov ( 5): fundet.

Glucosekoncentration (*6): 50% vækst ++.

60% vækst ++.

10 Saltkoncentration ( 7): 2% vækst +.

6% vækst -.

Note 5: Bedømt ved fremgangsmåden ifølge J. Lodder et 15 al ved hvilken et Wickerham's synthetisk medium anvend tes.

"fc

Note 6: Agarmedium *7: Flydende medium 20 4. Evne til at fermentere sukkerarter.

Glucose ++

Lactose 25 Galactose Melibiose Sucrose ++

Raffinose Maltose + 30 Cellobiose Trehalose Inulin DK 168490 B1 8 5. Assimilation af sukkerarter, organiske syrer osv.

Glucose ++ D-Xylose +/- 5 Galactose Erythritol + D-Arabinose L-Arabinose D-Ribose + 10 Sucrose + L-Rhamnose Maltose +

Ethanol

Cellobiose + 15 salicin L-Sorbose Ribitol Galactitol Glycerol + 20 Trehalose Lactose Melibiose D-Mannitol +

Raffinose 25 Melezitose α-Methyl-D-Glucoside -Inulin +/-

Inositol

Opløselig stivelse 30 DL-Mælkesyre

Ravsyre +/-

Citronsyre +

Som et resultat af undersøgelser af den taxonome 35 position af stammerne ifølge opfindelsen med de mycolo-giske egenskaber som angivet i det foregående ved hen- 9 DK 168490 B1 visning til Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture (J.A. Von Arx; 1974) , har det vist sig at stammerne ifølge opfindelsen er karakteriseret yed at danne en koloni, der fra at være hvid bliver sort efter et styk-5 ke tid ved dyrkningens senere stadium på et YM-agarmedium, danner mycelier på vegetative celler og giver anledning til et antal afsnøringssporer uden nogen tyk sporedannelse. Stammerne ifølge opfindelsen er således vurderet som værende hidtil ukendte mikroorganis-10 mer hørende til slægten Aureobasidium, og betegnet Au-reobasidium sp. SN-i24A-stamme. De hidtil ukendte stammer adskiller sig fra den fra japansk fremlæggelsesskrift nr. 61-31091 kendte stamme, Aureobasidium sp. SN-45, ved, at de giver betydelig højere erythritolud-15 bytter ved fermentering af sukkerarter.

På den anden side har de mykologiske egenskaber af Aureobasidium sp. SN-G42- og SN-y96-stammerne meget stor lighed med egenskaberne af den før omtalte moderstamme Aureobasidium sp. SN-124A (vild-type). Med andre 20 ord har mutanterne de samme mykologiske egenskaber som moderstammen, bortset fra at den førstnævnte giver anledning til en koloni, der er foldet på overfladen, når den dyrkes på et agarkulturmedium, at den udviser let reduceret assimilation af nitrater og er ude af stand 25 til at nedbryde urinstof, og at den førstnævnte er noget forskellig fra den sidstnævnte med hensyn til assimilation af sukkerarter, organiske syrer og så videre som angivet i tabel 1. De to mutantstammer adskiller sig fra hinanden ved, at SN-y96-stammen har en højere 20 tolerance over for sukkerarter end SN-G42-stammen, jf. tabellen på side 32.

10 DK 168490 B1 TABEL 1

Assimilation af sukkerarter, organiske syrer o.s.v.

Substat SN-124A SN-G42 SN-96 5

Glucose ++ + + D-Xylose +/- L-Sorbose - + · + D-Mannitol + - 10 Raffinose - + +

Melezitose - + +

Inulin +/- + +

Ravsyre +/-

Citronsyre +/- 15

Som det klart kan ses af den foregående forklaring, har Aureobasidium sp. SN-G42 og SN-y96, dvs. mutanterne, mykologiske egenskaber som har meget stor lighed med de mykologiske egenskaber af Aureobasidium 20 sp. SN-l24A-stammen, dvs. moderstammen (vild-typen).

Som det vil blive illustreret i eksemplerne, der gives senere, adskiller disse mutanter sig imidlertid fra moderstammen, Aureobasidium sp. SN-124A, ved at tåle højere sukkerkoncentration, og ved at cellerne er hydro-25 file, således at der i det væsentlige ikke sker skumdannelse under dyrkning.

Nærmere betegnet udviser Aureobasidium sp. SN-124A-stammen (vild-typen) en forholdsvis tilfredstillende omdannelsesgrad til erythritol på ca. 37,0 30 til 41,5% under betingelser, hvor kulturmediets gluco-sekoncentration er indtil 33,5%. Der er imidlertid et brat fald i omdannelsesgraden til erythritol, når glu-cosekoncentrationen overskrider 39,5%. Ved en glucose-koncentration på 45% falder omdannelsesgraden til ca.

35 16%. Med Aureobasidium sp. SN-G42 og SN-y96-stammerne 11 DK 168490 B1 falder omdanneisesgraden til erythritol derimod praktisk talt ikke, heller ikke når kulturmediets glucose-koncentration overskrider 40%. Ved en glucosekoncentration, der er så høj som 45%, opnås en tilfredstillende 5 omdannelsesgrad. Især med SN-Y96-stammen bevares en høj omdannelsesgrad, højere end 40%, selv når kulturmediets glucosekoncentration overskrider 60%, og en omdannelsesgrad, der er så høj som 32% opnås, når kulturmediets glucosekoncentration er 75%. Endvidere er SN-y96- og 10 SN-G42-stammerne kendetegnet ved, at deres celler er så hydrofile, at der i det væsentlige ikke sker skumdannelse under dyrkningen.

Stammerne ifølge den foreliggende opfindelse er deponeret i henhold til Budapesttraktaten ved Fermen-15 tation Research Institution of Agency of industrial Science and Technology under FERM P-8745 (FERM BP-1429) for Aureobasidium sp. SN-l24A-stammen, FERM P-8940 (FERM BP-1430) for Aureobasidium sp. SN-G42 og FERM p-9400 (FERM BP-1431) for Aureobasidium sp. SN-y96.

20 I det følgende forklares fremgangsmåden til fremstilling af erythritol ved anvendelse mikroorganismerne ifølge opfindelsen. I beskrivelsen betyder % vægt/vol% undtagen hvor andet er angivet.

Fremgangsmåden er ejendommelig ved det i den 25 kendetegnende del af krav 7 angivne.

Stammerne ifølge opfindelsen dyrkes under aerobe betingelser på et flydende kulturmedium indeholdende en assimilerbar carbonkilde, en assimilerbar nitrogenkilde, uorganiske salte osv.

30 Som carbonkilde i det flydende kulturmedium kan man anvende fermenterbare sukkerarter, såsom glucose, fructose og sucrose. Sukkerkoncentrationens øvre grænse varierer afhængigt af de anvendte stammer, og er således ikke bestemt generelt. Imidlertid anvendes for-35 trinsvis en sukkerkoncentration på 10-40%, helst 20-30% ved SN-124A-stammen. Ved SN-G42-stammen anvender man en 12 DK 168490 B1 sukkerkoncentration på 10-55%, fortrinsvis 20-50%, og ved SN-y96-stammen anvender man en sukkerkoncentration på 10-95%, fortrinsvis 20-70%.

Som nitrogenkilder anvendes nitrogenforbindel-5 ser, der er tilgængelige for mikroorganismer, som f.eks. gærekstrakt, maltekstrakt, casaminosyrer, majsstøbevæske, ammoniumsulfat og urinstof. Disse nitrogenkilder anvendes fortrinsvis i mængder på 0,5 til 3% for gærekstrakt, og 1,5-10% for majsstøbevæske.

10 De anvendte uorganiske salte omfatter salte, så som jern(II)sulfat, natriumchlorid, dikaliumhydrogen-phosphat, calciumhydroxid og zinksulfat og anvendes fortrinsvis i en mængde på højst 0,1%.

Det skal bemærkes, at der foruden disse carbon-15 kilder, nitrogenkilder, og uorganiske salte, kan tilsættes forskellige organiske og uorganiske forbindelser, der er nødvendige for vækst af mikroorganismer, eller sædvanlige antiskummidler eller lignende.

Til dyrkning kan cellerne af mikroorganismer 20 ifølge opfindelsen inokuleres direkte på det flydende kulturmedium med den ovennævnte sammensætning, eller en separat podekulturopløsning opnået ved fordyrkning kan inokuleres derpå. En sådant podekulturopløsning fremstilles ved inokulering af en øjefuld gærlignende skrå-25 glaskultur dyrket på sædvanlig måde på et flydende kul- 13 DK 168490 B1 turmedium med pH 4 til 7 og indeholdende 40,0% glucose og 1,6% gærekstrakt, efterfulgt af dyrkning ved 34 til 37 °C i 2 til 4 dage.

Dyrkning udføres indenfor et temperaturområde, 5 ved hvilket mikroorganismen kan vokse, dvs. ved 30 til 38 °C, fortrinsvis 35 til 37 °C .

Kulturmediets pH-værdi indstilles til en værdi fra 4 til 9, foretrinsvis 4 til 7.

Dyrkningsperioden varierer afhængigt af den an-10 vendte type medium og koncentrationen af den sukkerart, der foreligger som carbonkilde, men den er sædvanligvis 4 til 15 dage. Dyrkningen kan enten udføres batchvist eller kontinuerligt.

Det ønskes, at kulturmediets næringskilde udnyt-15 tes mest muligt, og at dyrkningen afsluttes, når den dannede mængde erythritol i kulturopløsningen når et maksimum. I den forbindelse ønskes det, at dyrkningen udføres under måling af erythritolmængden i kulturopløsningen ved kendte fremgangsmåde, såsom GLC 20 (gasvæskekromatografi) og HPLC (højt ydeisesvæskekromatografi).

Erythritol akkumuleret i kulturopløsningen kan separeres derfra på sædvanlig måde efter afslutningen af dyrkningen. Hertil kan man anvende kendte frem-25 gangsmåder, der normalt anvendes indenfor teknikken, såsom filtrering, centrifugering, ionbytnings- eller adsorptions chromatografi, opløsningsmiddelekstraktion, destillation og krystallisation, som om nødvendigt kan kombineres passende. Eksempelvis fjernes cellerne fra 30 kulturopløsningen ved filtrering eller centrifugering, og den opnåede opløsning behandles med aktivt trækul til fjernelse af farvet materiale. Dernæst deioniseres opløsningen desuden med en ionbytterharpiks, hvorefter den koncentreres til en sirup, hvorfra erythritol til-35 sidst skilles fra ved krystallisation.

Den hidtil ukendte mikroorganismestamme SN-124A ifølge opfindelsen hører til slægten Aureobasidium, og 14 DK 168490 B1 mutanterne Aureobasidium sp. SN-G42 og Aureobasidium sp. SN-y96, har en høj erythritolomdannelsesgrad udfra sukkerarter og er således hensigtmæssig til industriel anvendelse. Især er mutanterne SN-G42 og SN-y96 overor-5 dentligt nyttige til industrielle formål, idet de har en meget høj tolerance mod sukkerkoncentrationer, har god varmeresistens og ikke giver anledning til skumdannelse, når de dyrkes.

Udførelsesformerne af den foreliggende opfindel-10 se forklares mere konkret i de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 (A) Fremstilling af podekulturopløsning 15

Cellerne af Aureobas idium sp. SN-124A-stammen (FERM BP-1429) overførtes til et skråglaskulturmedium indeholdende 20,0% (vægt/vægt) glucose, 0,5% gærekstrakt og 1,5% agar, og der udførtes stationær dyrkning 20 ved 35 °C i 3 dage.

Dernæst overførtes en platinøjefuld af de ovennævnte dyrkede celler til en Erlenmeyerkolbe med en vo-luemen på 500 ml, hvori der var fyldt 100 ml af det flydende kulturmedium (pH 5,5) indeholdende 20% 25 (vægt/vægt) glucose og 2,0 % majsstøbevæske (fremstillet af Oji Corn Starch Co., Ltd.), og dyrkningen udførtes ved 35 °C i 3 dage til opnåelse af et dyrket produkt.

30 (B) Dyrkning.

5 kg af et kulturmedium indeholdende 20% (vægt/vægt) glucose, 2,0% majsstøbevæske, der i forvejen var indstillet til en pH-værdi på 6,0, 0,1% sorbi-35 tanfedtsyreester og 0,03% af et siliciumbaseret antis-kummiddel fyldtes i en fermentor med en volumen på 7 15 DK 168490 B1 liter og steriliseredes dernæst ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes mediets pH-værdi til 5,5. Til dette medium sattes 200 ml af en podekul-turopløsning af Aureobasidium sp. SN-124A-stammen (FERM 5 P-8745, FERM BP-1429) fremstillet i det foregående trin (a). Dette medium dyrkedes ved 35 °C og 400 omdrejninger pr. minut under beluftning med 1 l/min i 7 dage.

Som et resultat heraf dannedes 467 g erythritol og en spormængde glycerol i denne kulturopløsning.

10 Cellerne centrifugeredes fra kulturopløsningen, som igen affarvedes med aktivt kul og afsaltedes med en ionbytterharpiks (IRA-410 ; IRA-120B =2: 1) og dernæst koncentreredes og opbevaredes ved 5 °c til opnåelse af krystaller. Krystallerne opløstes og omkrystalliseredes 15 på en lignende måde. De opnåede polyederiske hvide krystaller havde en behagelig sød smag og et smeltepunkt på 121 °C . Udfra resultaterne af NMR, den specifikke optiske drejning, HPLC og GLC, identificeredes de hvide krystaller som erythritol (meso-erythritol).

20 EKSEMPEL 2 50 g af et medium indeholdende 30% (vægt/vægt) glucose og 3,2% majsstøbevæske (indstillet til pH 6,0) 25 fyldtes i en 500 ml Erlenmeyerkolbe, hvorefter det steriliseredes og afkøledes. Dernæst indstilledes mediets pH-værdi til 6,0. På dette inokuleredes 2 ml af en po-dekulturopløsning lig den der anvendtes i eksempel 1 til 10 dages rotationsrystedyrkning ved 35 °C og 180 30 omdrejninger pr. minut. Som resultat heraf akkumuleredes 5,9 g erythritol og 1,4 g glycerol i kulturvæsken.

35 16 EKSEMPEL 3 DK 168490 B1 50 g af et kulturmedium indeholdende 20% (vægt/vægt) sucrose og 0,5% gærekstrakt fyldtes i en 5 500 ml Erlenmyerkolbe og steriliseredes ved 120 °C i 15 minutter. Efter afkøling indstilledes mediets pH-værdi til 6,0, og mediet inokuleredes med Aureobasidium sp. SN-124A-stamme (FERM BP-1429) i rotationsrystekultur ved 35 °C og 180 omdrejninger pr. minut i 7 dage. Som 10 et resultat heraf akkumuleredes 4,2 g erythritol i kulturopløsningen, mens der ikke fandtes akkumulation af glycerol.

EKSEMPEL 4 15 50 g af et kulturmedium indeholdende 0,5% gærek-strakt og 10 til 30% (vægt/vægt) glucose fyldtes i 500 ml Erlenmyerkolber og steriliseredes ved 120 °C i 15 minutter. Efter afkøling indstilles mediernes pH-20 værdier til 5,5, og de inokuleredes med 2 ml af en pode-kulturopløsning (opnået ved dyrkning af Aureobas idium sp. SN-124A-stamme (FERM BP-1449) på et kulturmedium indeholdende 20% glucose og 0,5% gærekstrakt ved 35 °C i 3 dage til rotations rystedyrkning) ved 35 °C og 180 25 omdrejninger pr. minut i 4 til 11 dage. Resultatet var som angivet i tabel 1.

30 35 17 DK 168490 B1 it

Glucosekon- Dyrknings- Udbytte(5) Glucose- centration periode Erythritol Glycerol rest (%) (dage) _ (%) 5 10 4 40,6 1,0 0 15 6 41,8 2,6 0 20 7 46,2 3,4 2,2 25 9 42,2 7,8 15,7 30 11 37,0 10,6 23,3 10 * i forhold til forbrugt glucose.

EKSEMPEL 5 15 50 g af et kulturmedium indeholdende 20% (vægt/vægt) glucose og 0,5% gærekstrakt fyldtes i hver af 8 500 ml Erlenmeyerkolber og steriliseredes. Efter afkøling indstilledes mediernes pH-værdier til at va-20 rierer fra 2,9 til 10,1 med 1 N saltsyre eller 1 N natriumhydroxid. Hver af de opnåede medier inokuleredes med podestammer (Aureobasidium sp.SN-124A-stamme, PERM BP-1429) til 7 dages rotationsrystedyrkning ved 35 °C og 180 omdrejninger pr. minut. Som et resultat heraf 25 opnåedes erythritol i udbytterne angivet i tabel 2.

30 35 18 DK 168490 B1

Kulturmedi- Udbytte* Glucose- ets pH- Erythritol Glycerol rest værdi_ _ _ (%) 5 2,9 35,8 6,4 27,5 4.1 42,0 8,1 14,0 5.1 46,6 9,2 16,1 6.1 45,6 7,2 12,8 6,7 46,2 8,0 15,0 10 7,8 47,2 5,0 23,0 9.1 41,6 3,0 35,7 10,1 1,0 0 81,9 * i forhold til forbruget 15 EKSEMPEL 6 (Fremstilling af mutanter).

20 Aureobasidium sp. SN-124A-stamme (FERM BP-1429) fordyrkedes på et kulturmedium indeholdende 0,5% gærek-strakt og 22% glucose i 2 dage. Det fordyrkede produkt fortyndedes 100 gange og bestråledes med en 15 W ultraviolet lampe (Toshiba Sterilizer Lamp GL15) fra en af-25 stand på 30 cm i 40 minutter. Efter fortynding anbragtes det bestrålede produkt på et agarkulturmedium (1,0% gærekstrakt, 33,5% glucose og 1,5% agar) til opsamling af stammer med vækst.

De således opsamlede stammer bestråledes igen 30 med ultraviolet lys til opsamling af stammer med vækst på en lignende måde.

Endvidere behandledes de således opsamlede stammer med en 1 mg/ml koncentration af

N-methyl-N'-nitro-N"-nitrosoguanidin i 30 minutter til 35 opsamling af stammer med vækst på en lignende måde og derved opnå Aureobasidium sp. SN-G42-Stamme (FERM

19 DK 168490 B1 P-8940, FERM BP-1430), som var mutanten.

EKSEMPEL 7 5 (a) Fremstilling af podekulturopløsning

Cellerne af Aureobasidium sp. SN-G42-stammen (FERM BP-1430) podedes på et skråglaskulturmedium indeholdende 33/5% glucose, 1,0% gærekstrakt og 1,5% agar 10 og stationær dyrkning udførtes ved 35 °C i 2-3 dage.

Dernæst overførtes en øjefuld af de ovenfornævn-te dyrkede celler til en Erlenmyerkolbe med et volumen på 500 ml, hvori der var fyldt 150 ml af et flydende kulturmedium (pH 4,0) indeholdende 20% glucose og 1,6% 15 ma jsstøbevæske (fremstillet af Oji Corn Starch Co.,

Ltd.), og dyrkning udførtes ved 35 °C i 3 dage. 9 ml af denne kulturopløsning inokuleredes dernæst i en 500 ml Erlenmyerkolbe, hvori der var fyldt 150 ml af et lign ende kulturmedium, og der udførtes rotationsrystedyrk-20 ning ved 35 °C i 3 dage.

(b) Dyrkning 15 1 af et kulturmedium indeholdende 20,0% glu-25 cose og 1,6% majsstøbevæske fyldtes i en fermentor med et volumen på 30 1, til hvilken der dernæst sattes 300 ppm af et antiskummiddel (Silicone KS-66 fremstillet af Shinetsu Kagaku, Co., Ltd.), hvorefter mediet dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling 30 indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,0 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 6% af pode-kulturopløsningen af Aureobasidium sp. SN-G42-stamme (FERM BP-1430). Der udførtes dernæst dyrkning ved 35 °C og 230 omdrejninger pr. minut under beluftning med 0,25 35 vvm.

Efter afslutning af dyrkningen viste analysen af kulturopløsningen, at alt glycerolet var forbrugt, og 20 DK 168490 B1 udbytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 49,3% og 2,2%.

En del af denne kulturopløsning befriede dernæst for celler ved centrifugering og affarvedes og afsalte-5 des endvidere med aktivt trækul og en ionbytterharpiks (IRA-410 : IR-120B = 2:1). Den resulterende væske kon-centredes til en sukkerkoncentration på mindst 50% og afkøledes langsomt til opnåelse af krystaller, som igen opløstes i vand og omkrystalliseredes på lignende måde.

10 De således opnåede polyederiske, hvide krystal ler havde en behagelig sød smag og et smeltepunkt på 121 °C . Udfra resultaterne af HPLC og GLC og måling af den optiske drejning og NMR-spektrum identificeredes de ovennævnte krystaller som erythritol (meso-erythitol).

15 EKSEMPEL 8 15 1 af et kulturmedium indeholdende 20% glucose og 1,6% majsstøbe væske fyldtes i en fermentor med et 20 volumen på 30 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskummid-del, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,0 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 6% af en podekulturopløsning af Aureoba-25 sidium sp. SN-G42-stamme (FERM ΒΡ-1430Γ) fremstillet med det samme medium som det ovennævnte medium efter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes dernæst ved 35 °C og 230 opm under beluftning med 0,50 vvm i 7 dage.

30 Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt glucosen var forbrugt, og udbytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 49,2% og 1,2%.

35 21 EKSEMPEL 9 DK 168490 B1 15 1 af et kulturmedium indeholdende 20,0% glucose og 1,6% majsstøbevæske fyldtes i en fermentor med 5 et volumen på 30 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskum-middel, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,0 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 6% af en podekulturopløsning af Aureoba-10 sidium sp. SN-G42-stamme (FERM BP-1430) fremstillet med det samme medium som det ovennævnte medium efter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes dernæst ved 35 °C og 230 opm under beluftning med 0,75 vvm i 7 dage.

15 Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt glucosen var forbrugt, og udbytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 46,5% og 2,7%.

20 EKSEMPEL 10 15 1 af et kulturmedium indeholdende 20,0% glucose og 1,6% majsstøbevæske fyldtes i· en fermentor med et volumen på 30 1, og tilsattes 300 ppm af et antis-kummiddel, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C 25 i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,0 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 900 ml af en podekulturopløsning af Aureobasidium sp. SN-G42-Stamme (FERM BP-1430) fremstillet med samme medium som det ovennvænte medium ef-30 ter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes dernæst ved 35 °C og 230 opm under en beluftning med 1,00 vvm i 7 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt glucosen var forbrugt, og ud-35 bytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 41,8% og 1,4%.

22 EKSEMPEL 11 DK 168490 B1 5 1 af et kulturmedium indeholdende 33,5% glucose og 4,47% majsstøbevæske fyldtes i en fermenter med et 5 volumen på 7 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskummid-del, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,2 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 300 ml af en podekulturopløsning af Au-10 reobasidium sp· SN-G42-stamme (FERM BP-1430) fremstillet med det samme medium som det ovennævnte medium efter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes dernæst ved 35 °C og 500 opm under be-luftning med 0,25 vvm i 5 dage.

15 Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt glucosen var forbrugt, og udbytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 39,7% og 7,9%.

20 EKSEMPEL 12 5 1 af et kulturmedium indeholdende 39,5% glucose og 4,0% majsstøbevæske fyldtes i en fermentor med et volumen på 7 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskum-25 middel, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,2 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 300 ml af en podekulturopløsning af Au-reobasidium sp. SN-G42-stamme (FERM BP-1430) fremstil-30 let med det samme medium som det ovennævnte medium efter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes dernæst ved 35 °C og 500 opm under beluftning med 0,25 vvm i 6 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analyse af 35 kulturopløsningen, at alt glucosen var forbrugt, og udbytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 38,6% og 9,5%.

23 DK 168490 B1 EKSEMPEL 13 5 5 1 af et kulturmedium indeholdende 39,5% gluco se og 5,3% majsstøbevæske fyldtes i en fermentor med et volumen på 7 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskummid-del, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-10 værdi til 4,2 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 300 ml af en podekulturopløsning af Au-reobasidium sp. SN-G42-stamme (FERM BP-1430) fremstillet med det samme medium som det ovennævnte medium efter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes 15 dernæst ved 35 °C og 500 opm under beluftning med 0,25 vvm i 5 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt glucosen var forbrugt, og udbytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 20 37,5% og 7,2%.

EKSEMPEL 14 5 1 af et kulturmedium indeholdende 39,5% glu-25 cose og 6,6% ma jsstøbevæske fyldtes i en fermentor med et volumen på 7 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskum-middel, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,2 med natriumhydroxid. Til dette medium 30 sattes dernæst 300 ml af en podekulturopløsning af Au-reobasidium sp. SN-G42-stamme (FERM BP-1430) fremstillet med det samme medium som det ovennævnte medium efter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes dernæst ved 35 °C og 500 opm under beluftning med 0,25 35 vvm i 4 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt glucosen var forbrugt, og ud 24 DK 168490 B1 bytterne af erythritol og glycerol deri var benholds vi s 37,1% og 4,8%.

EKSEMPEL 15 5 15 1 af et Kulturmedium indeholdende 45,0% glucose og 6,0% maj s støbevæske fyldtes i en fermentor med et volumen på 30 1, og tilsattes 300 ppm af et antis-kummiddel, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C 10 i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,0 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 6% af en podekulturopløsning af Aureobasidium sp. SN-G42-stamme (FERM BP-1430) fremstillet med samme medium som det ovennvænte medium ef-15 ter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes dernæst ved 35 °C og 230 opm under en beluftning med 0,33 vvm i 8 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt glucosen var forbrugt, og ud-20 bytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 37,3% og 4,5%.

EKSEMPEL 16 25 5 1 af et kulturmedium indeholdende 33,5% sucro se og 4,5% majsstøbevæske fyldtes i en fermentor med et volumen på 7 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskummid-del, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-30 værdi til 4,1 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 300 ml af en podekulturopløsning af Aureobasidium sp. SN-G42-stamme (FERM BP-1430) fremstillet med det samme medium som det ovennævnte medium efter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes 35 dernæst ved 35 °C og 500 opm under beluftning med 0,25 vvm i 6 dage.

25 DK 168490 B1

Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt sucrosen var forbrugt, og udbytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 41,9% og 7,4%.

5 EKSEMPEL 17 5 1 af et kulturmedium indeholdende 39,5% sucrose og 5,3% maj s støbe væske fyldtes i en fermentor med 10 et volumen på 7 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskum-middel, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,1 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 300 ml af en podekulturopløsning af Au-15 reobasidium sp. SN-G42-stamme (FERM BP-1430) fremstillet med det samme medium som det ovennævnte medium efter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes dernæst ved 35 °C og 500 opm under beluftning med 0,25 vvm i 6 dage.

20 Efter dyrkningens afslutning Viste analyse af kulturopløsningen, at alt sucrosen var forbrugt, og udbytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 42,4% og 5,8%.

25 EKSEMPEL 18 5 1 af et kulturmedium indeholdende 45,0% sucrose og 6,0% majsstøbevæske fyldtes i en fermenter med et volumen på 7 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskummid-30 del, hvorefter det dampsteriliseredes ved 120 °C i 20 minutter. Efter afkøling indstilledes kulturmediets pH-værdi til 4,1 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes dernæst 300 ml af en podekulturopløsning af Au-reobasidium sp. SN-G42-stamme (FERM BP-1430) fremstil-35 let med det samme medium som det ovennævnte medium efter fremgangsmåden ifølge eksempel 7. Dyrkning udførtes 26 DK 168490 B1 dernæst ved 35 °C og 500 opm under beluftning med 0,25 vvm i 6 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt sucrosen var forbrugt, og ud-5 bytterne af erythritol og glycerol deri var henholdsvis 41,7% og 3,8%.

EKSEMPEL 19 10 (Fremstilling af mutanter) 5 ml af et flydende kulturmedium indeholdende 22,0% glucose og 0,5% gærekstrakt inokuleredes med Au-reobasidium sp. SN-124A-stamme (FERM BP-1429) til 2 da-15 ges rotationsrystedyrkning ved 30 °C til opnåelse af et kulturprodukt.

Det således dyrkede produkt fortyndedes 100 gange med en 22,0% glucoseopløsning og bestråledes med en ultraviolet lampe på 15 W (Toshiba Sterilizer lamp GL 20 15) fra en afstand på 30 cm i 40 minutter under omrø ring i en petriskål.

Efter bestrålingen anbragtes den således behandlede opløsning i en petriskål over et agarkulturmedium indeholdende 22,0% glucose, 0,5% gærekstrakt og 1,5% 25 agar, og der udførtes stationær dyrkning ved 30 °C i 4 dage til opsamling af stammer med vækst.

Dernæst inokuleredes de således opsamlede stammer på et flydende kulturmedium indeholdende 22,0% glucose og 0,5% gærekstrakt til 2 dages rotationsryste-30 dyrkning ved 30 °C til opnåelse af et kulturprodukt.

Dette kulturprodukt fortyndedes dernæst på en lignende måde som ovenfor og bestråledes derefter igen med ultraviolette stråler i 20 minutter under de samme betingelser som nævnt ovenfor.

35 Efter bestrålingen anbragte den således behand lede opløsning over et agarkulturmedium indeholdende 27 DK 168490 B1 33,5% glucose, 1,0% gærekstrakt og 1,5% agar, og der udførtes stationær dyrkning ved 30 °C i 4 dage til opsamling af stammer med vækst.

De således opsamlede stammer 'inokuleredes der-5 næst på et flydende kulturmedium indeholdende 33,5% glucose og 1,0% gærekstrakt, og der udførtes rotationsrystedyrkning ved 30 °C i 2 dage til opnåelse af et kulturprodukt.

Cellerne centrifugeredes dernæst ud af det såle-10 des opnåede kulturprodukt og vaskedes desuden 2 gange med 0,2 M eddikesyrepuf feropløsning (pH 5,0) indeholdende 2 M glucose. Derefter suspenderedes cellerne i en pufferopløsning til en koncentration på 1 x 107 celler/ml, og de behandledes med N-methyl-N1 -nitro-N-15 nitrosoguanidin med en koncentration på 1 mg/ml ved 30 °C i 30 minutter.

Efter afslutning af behandlingen skiltes cellerne på sædvanlig måde fra, og de vaskedes dernæst med pufferopløsning. Derefter anbragtes cellerne på et ag-20 arkulturmedium indeholdende 40,0% glucose, 1,0% gærekstrakt og 1,5% agar, og stationær dyrkning udførtes ved 30 °C i 5 dage til opsamling af stammer med vækst.

De således opsamlede stammer inokuleredes på et flydende kulturmedium indeholdende 1,6% gærekstrakt og 25 40,0% glucose, og rystedyrkning udførtes ved 30 °C i 2 dage til opnåelse af et kulturprodukt. Det opnåede kulturprodukt fortyndedes dernæst til 1 x 107 celler/ml, og 3 ml af det fortyndede produkt fyldtes i et reagensglas, som blev bestrålet med 200 kRad af gammastråler 30 (60co) fra afstand på 18 cm.

Efter afslutning af bestrålingen anbragtes de behandlede celler på et agarkulturmedium indeholdende 45,0% glucose, 1,6% gærekstrakt og 1,5% agar, og stationær dyrkning udførtes ved 30 °C i 5 dage til opsam-35 ling af celler med vækst, hvor mutanter, dvs. Aureobasidium sp. SN-Y96-stammen (FERM P-9400, FERM

28 DK 168490 B1 BP-1431) opnåedes.

EKSEMPEL 20 5 (a) Fremstilling af podekulturopløsning

Aureobasidium sp. SN-Y96-stamme (FERM BP-1431) podedes på et skråglaskulturmedium indeholdende 40,0% glucose, 1,6% gærekstrakt og 1,5% agar til 5 dages sta-10 tionær dyrkning ved 35 °C. Et platinøje fuld af de ovennævnte skråglasdyrkede celler overførtes til en 500 ml konisk kolbe, hvori der var fyldt 100 ml af et flydende medium (pH 4,9) indeholdende 40,0% glucose og 1,6% gærekstrakt, til 3 dages dyrkning ved 35 °C. Der-15 næst inokuleredes 9 ml af denne kulturopløsning i en 500 ml konisk kolbe, hvori der var kommet 150 ml af et flydende kulturmedium, som det ovennævnte, og der udførtes rotations rystedyrkning ved 35 °C i 3 dage til opnåelse af et kulturprodukt.

20 (b) Dyrkning 15 1 af et flydende kulturmedium indeholde 40,0% glucose og 6,8% majsstøbevæske (som var steriliseret 25 separat) fyldtes i en fermentor med et volumen på 30 1, tilsatttes 300 ppm af et antiskummiddel ("Adecanol LG-109 fremstillet af Asahi Denka K.K.), og indstilledes til en pH-værdi på 4,2 med natriumhydroxid. Hertil sattes 900 ml af podekulturopløsningen af Aureobasidium 30 sp. SN-Y96-stamme (FERM BP-1431) fremstillet i det ovenstående trin (a). Dernæst udførtes dyrkning ved 35 °C og 400 opm under en beluftning på 1,0 wm i 4 dage.

Efter afslutning af dyrkningen viste analysen af kulturopløsningen ved HPLC, at glucosen var forbrugt, 35 fuldstændigt og erythritol- og glycerolindholdet var henholdsvis 18,9% (udbytte: 47,3) og 3,5% (udbytte: 8,8%) .

DK 168490 B1 29

Cellerne centrifugeredes derefter ud af 600 ml af denne kulturopløsning, som herefter affarvedes med aktivt trækul og afsaltedes med ionbytterharpiks (IRA-140 : IR-120 = 2:1). Dernæst koncentreredes den 5 resulterende opløsning til en koncentration på mindst 50%, og den afkøledes langsomt til udfældning af separate krystaller. Krystallerne omkrystalliseredes endvidere af vand til opnåelse af polyederiske, hvide krystaller, som havde et smeltepunkt på 121,0 °C og en be-10 hagelig sød smag. De hvide krystaller identificeredes videre som erythritol (meso-erythritol·) ved væskekromatografi og gaskromatografi og måling af den optiske drejning og NMR-spektret.

15 EKSEMPEL 21 15 1 af et flydende kulturmedium indeholdende 50,0% glucose og 6,8% majsstøbevæske (som var steriliseret separat) fyldtes i en fermentor med en volumen på 20 30 1, tilsattes 300 ppm af et antiskummiddel og ind stilledes til en pH-værdi på 4,2 med natriumhydroxid.

Til dette medium sattes 900 ml podekulturopløsning af Aureobasidium sp. SN-Y96-stammen (FERM BP-1431) fremstillet efter fremgangsmåden ifølge eksempel 20(a).

25 Dernæst udførtes dyrkning ved 35 °C og 400 opm under en beluftning på 1,5 wm i 6 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analysen af kulturopløsningen, at glucosen var forbrugt fuldstændigt, og at erythritol- og glycerolindholdene var hen-30 holdsvis 23,3% (udbytte: 46,5%) og 4,5% (udbytte: 9,0%).

35 DK 168490 B1 30 EKSEMPEL 22 2 1 af et flydende kulturmedium indeholdende 60,2% glucose og 2,0% gærekstrakt (som var steriliseret 5 separat) fyldtes i en fermentor med en volumen på 3 1 tilsattes 200 ppm af et antiskummiddel. Til dette medium sattes 80 ml og podekulturopløsning af Aureoba-sidium sp. SN-y96-stammen (FERM BP-1431) fremstillet efter fremgangsmåden ifølge eksempel 20(a). Dernæst ud-10 førtes dyrkning ved 35 °C og 1000 opm under en be luftning på 2,5 vvm i 7 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analysen af kulturopløsningen, at glucosen var forbrugt fuldstændigt, og at erythritol- og glycerol indholdene var hen-15 holdsvis 28,8% (udbytte: 47,7%) og 6,8% (udbytte: 11,3%).

EKSEMPEL 23 20 2 1 af et flydende kulturmedium indeholdende 75,5% glucose og 2,0% gærekstrakt (som var steriliseret separat) fyldtes i en fermentor med en volumen på 3 1 og tilsattes 200 ppm af et antiskummiddel. Til dette medium sattes 80 ml podekulturopløsning af Aureoba-25 sidium sp. SN-y96-stammen (FERM BP-1431) fremstillet efter fremgangsmåden ifølge eksempel 20(a). Dernæst udførtes dyrkning ved 35 °C og 1000 opm under en beluft-ning på 2,0 wm i 11 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analysen af 30 kulturopløsningen, at glucosen var forbrugt fuldstændigt, og at erythritol- og glycerolindholdene var henholdsvis 24,5% (udbytte: 32,4%) og 11,0% (udbytte: 14,3% 35 DK 168490 B1 31 EKSEMPEL 24 5 1 af et flydende kulturmedium indeholdende 50,0% sucrose og 6,8% majsstøbevæske (som var sterili-5 seret separat) fyldtes i en fermentor med en volumen på 7 1 og tilsattes 300 ppm af et antiskummiddel og indstilledes til en pH-værdi på 4,2 med natriumhydroxid. Til dette medium sattes 300 ml podekulturopløsning af Aureobasidium sp. SN-y96-stammen (PERM BP-1431) frem-10 stillet efter fremgangsmåden ifølge eksempel 20(a). Dernæst udførtes dyrkning ved 35 °C og 800 opm under en beluftning på 1,0 vvm i 5 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analysen af kulturopløsningen, at sucrosen var forbrugt fuldstæn-15 digt, og at erythritol- og glycerolindholdene var henholdsvis 23,6% (udbytte: 47,25%) og 5,0% (udbytte: 10,0%).

EKSEMPEL 25 20 2 1 af et flydende kulturmedium indeholdende 61,0% sucrose og 2,0% majsstøbe væske (som var steriliseret separat) fyldtes i en fermentor med en volumen på 3 1 og tilsattes 200 ppm af et antiskummiddel. Til det-25 te medium sattes 80 ml podekulturopløsning af Aureobasidium sp. SN-Y96-stammen (FERM BP-1431) fremstillet efter fremgangsmåden ifølge eksempel 20(a). Dernæst udførtes dyrkning ved 35 °C og 100 opm under en beluftning på 2,5 vvm i 6 dage.

30 Efter dyrkningens afslutning viste analysen af kulturopløsningen, at sucrosen var forbrugt fuldstændigt, og at erythitol- og glycerolindholdene var henholdsvis 24,6% (udbytte: 40,3%) og 7,8% (udbytte: 12,8%).

35 32 DK 168490 B1 EKSEMPEL 26 2 1 af et flydende kulturmedium indeholdende 93,9% sucrose og 2,0% gærekstrakt (som var steriliseret 5 separat) fyldtes i en fermentor med en volumen på 3 1 og tilsattes 200 ppm af et antiskummiddel. Til dette medium sattes 80 ml podekulturopløsning af Aureoba-sidium sp. SN-Y96-stammen (FERM BP-1431) fremstillet efter fremgangsmåden ifølge eksempel 20(a). Dernæst ud-10 førtes dyrkning ved 35 °C og 1000 opm under en beluft-ning på 2,0 wm i 15 dage.

Efter dyrkningens afslutning viste analyse af kulturopløsningen, at alt sucrosen var forbrugt, og indholdet af erythritol og glycerol deri var henholds-15 vis 21,6% (udbytte: 23,0) og 4,9% (udbytte: 5,3%).

EKSEMPEL 27 20 I dette eksempel vises resultaterne af en sam menligning af resistensen mod sukkerarter for de vilde Aureobasidium sp. SN-124A-stammer ifølge opfindelsen og deres mutanter af Aureobasidium sp. SN-G42-stammerne og Aureobasidium sp. SN-Y96-stammerne.

25 F remgangsmåder 100 ml af hver af flydende kulturmedier indeholdende 2,0% gærekstrakt (fremstillet af Difco, CO., 30 Ltd.) og givne mængder(22,0 til 83,3%) glucose fyldtes i koniske kolber med volumener på 500 ml og steriliseredes på sædvanlig måde. Dernæst inokuleredes de skråglas-dyrkede celler af Aureobasidium sp. SN-124A, SN-G42 og SN-Y96-stammerne på de respektive medier til 35 dyrkning af podekultur ved 35 °C i 1 til 5 dage.

Dernæst fyldtes 2 1 af hver af de flydende medier indeholdende givne mængder (22,0 til 83,3%) gluco- 33 DK 168490 B1 se og 20% gærekstrakt i en fermentor med et volumen på 3 1. Til mediet sattes 80 ml af hver af de ovennævnte podekulturopløsninger med de tilsvarende substratkoncentrationer. Dyrkning udførtes dernæst ved en dyr-5 kningstemperatur på 35 °C og ved 1000 opm under en be-luftning på 2,0 vvm indtil glucosen i hvert medium var fuldstændigt forbrugt (2 til 14 dage).

Efter afslutningen af dyrkningen måltes mængden af erythritol i hver kulturopløsning ved HPLC.

10

Resultater

Udbytterne af erythritol i forhold til forbrugt glucose var som følger: 15

Glucosekon- Udbytte af Erythritol i % centration i % Moderstammer Mutanter Mutanter _ (SN-124A) (SN-G42) (SN-y96) 1 2 3 4 5 6 22,0 41,5 50,6 48,2 2 33.5 37,0 48,0 45,9 3 39.5 29,7 46,8 47,5 4 45,0 16,2 43,5 45,3 5 53.3 - 40,5 42,5 6 60,2 - 32,4 43,1 67,9 - - 38,6 75.5 - - 32,4 83.3 - - 26,4 30 EKSEMPEL 28 I dette eksempel vises resultaterne af en sammenligning af opskumning, flokulation og den hydrofile natur af Aureobasidium sp. SN-124A-stammens og dens mu-35 tanter, Aureobasidium sp. SN-G42-Stammen og SN-Y96-stammen.

34 DK 168490 B1

Fremgangsmåder 5 ml af et flydende kulturmedium indeholdende 1,0% gærekstrakt og 33,5% glucose fyldtes i et reagens-5 glas og dampsteriliseredes ved 120 °C i 15 minutter. Efter afkøling indstilledes mediets pH-værdi til 5,5, og mediet inokuleredes med de skråglasdyrkede celler af Aureobasidium sp. SN-124A-stamme eller SN-G42-stamme og rotationsrystedyrkedes dernæst ved 30 °C i 5 dage.

10 Efter afslutning af dyrkningen holdtes kulturopløsningen stationær i 15 minutter til observation af cellernes skumudvikling og flokulationstilstand (skummende og flokulerende natur).

Dernæst tilsattes en ligeså stor mængde benzen 15 under kraftig omrøring til kulturopløsningen, og den resulterende opløsning holdtes dernæst stationær i ca.

30 minutter til observation af transporten af celler til benzenfasen (hydrofil natur).

Lignende observationer udførtes med Aureobasi-20 dium sp. SN-y96-stammer på en flydende kultur indeholdende 1,6% gærekstrakt og 40,0% glucose.

Resultater 25 Når moderstammen Aureobasidium sp. SN-124A dyr kedes aerobt på et flydende kulturmedium skete der en betydelig skumning. Skummet bestod i et længere tidsrum til efterstandsning af rystning. Cellerne i kulturopløsningen flokuleredes øjeblikkeligt efter afbrydelse 30 af omrøring til opnåelse af sedimenter*.

Imidlertid observeredes der ingen skumning heller ikke når mutanterne, Aureobasidium sp. SN-G42- og SNy96-stammerne, dyrkedes under samme betingelser som nævnt ovenfor. Der forekom heller ikke flokulation af 35 cellerne efter standsning af rystningen.

Endvidere viste det sig, at cellerne af moderstammerne gik over i benzenfasen uden at efterlade spor

Claims (10)

1. Biologisk renkultur af en stamme af Aureobasidium sp., kendetegnet ved, at stam-men er Aureobasidium sp. SN-124A (FERM BP-1429) eller kunstige mutanter deraf med væsentlig samme egenskaber, og at den danner og akkumulerer erythritol i en kulturopløsning, når den dyrkes aerobt på et flydende kulturmedium indeholdende en assimilerbar carbonkilde og en 15 assimilerbar nitrogenkilde, og er nyttig til fremstilling af erythritol ved fermentering af sukkerarter.

2. Biologiske renkulturstammer ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de er stammer af kunstige mutanter af Aureobasidium sp. SN-l24A-stammen (FERM

20 BP-1429) med væsentlig samme egenskaber, og at de danner og akkumulerer erythritol i en kulturopløsning uden nogen væsentlig forekomst af skum pga. fermenteringen, når de dyrkes aerobt på et flydende kulturmedium indeholdende en assimilerbar carbonkilde i en mængde på 25 mindst 40% og en assimilerbar nitrogenkilde, danner hydrofile celler og er nyttige til fremstilling af erythritol ved fermentering af sukkerarter.

3. Biologisk renkulturstamme ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den kunstige mutant af

30 Aureobasidium sp. SN-124A-stammen er Aureobasidium sp. SN-G42-stammen (FERM BP-1430).

4. Biologisk renkulturstamme ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den kunstige mutant af Aureobasidium sp. SN-124A-stammen er Aureobasidium sp.

35 SN-y96-stammen (FERM BP-1431). DK 168490 B1

5. Fremgangsmåde til fremstilling af kunstige mutanter af Aureobasidium sp. SN-124A-stammen/ der udviser høj tolerance for høj sukkerkoncentration, danner hydrofile celler,og som kan dyrkes uden væsentlig skum- 5 dannelse, kendetegnet ved, at den omfatter: (1) bestråling af kulturceller af Aureobasidium sp. SN-124A-stammen (FERM BP-1429) med ultraviolette stråler og dernæst stationær dyrkning af cellerne på et agarkulturmedium med en relativt lav glucosekoncentra- 10 tion til opsamling af stammer med vækst, (2) bestråling af de således opsamlede celler igen med ultraviolette stråler og dernæst stationær dyrkning af cellerne på et agarkulturmedium med en glucosekon-centration der er højere end den foregående koncentra- 15 tion til opsamling af celler med vækst, (3) behandling af de således opsamlede celler med et mutagent middel og dernæst stationær dyrkning af cellerne på et agarmedium med en glucosekoncentration, der er meget højere end den foregående koncentration, til 20 opsamling af celler med vækst, og (4) om ønsket en bestråling af de således opsamlede celler med gammastråler af 60Co og dernæst stationær dyrkning af cellerne på et agarkulturmedium med en glucosekoncentration, der stadig er meget højere end den 25 foregående koncentration til opsamling af stammer med vækst, hvorved mutanten opnås.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det mutagene middel er N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af erythritol ved fermentering af sukkerarter, kendetegnet ved, at den omfatter inokulering af en stamme valgt blandt Aureobasidium sp. SN-124A (FERM BP-1429) og mutanter deraf med væsentlig samme egenskaber på et fly- 35 dende kulturmedium med en pH-værdi fra 4 til 9 og indeholdende en assimilerbar carbonkilde og en assimilerbar DK 168490 B1 nitrogenkilde og aerob dyrkning af denne mikroorganisme ved en temperatur fra 30 til 38 °C til dannelse og akkumulation- af erythritol i kulturmediet til opsamling.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af erythritol 5 ved fermentering af en sukkerart, kendetegnet ved, at den omfatter inokulering af en kunstig mutant af Aureobasidium sp. SN-124A-stammen (FERM BP-1429) med væsentlig samme egenskaber på et flydende kulturmedium med en pH-værdi fra 4 til 9 og indeholdende en assimi-10 lerbar carbonkilde i en mængde på mindst 30% og en as-similerbar nitrogenkilde og aerob dyrkning af denne ved en temperatur fra 30 til 38°C til dannelse og akkumulation af erythritol i kulturmediet til opsamling.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kende-15 tegnet ved, at den kunstige mutant af Aureobasidium sp. SN-124A-stammen er Aureobasidium sp. SN-G42-stammen (FERM BP-1430).

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den kunstige mutant af Aureobasi- 20 dium sp. SN-124A-stammen er Aureobasidium sp. SN-y96-stammen (FERM BP-1431).