SU1125250A1 - Штамм @ @ @ -82-продуцент холестериноксидазы - Google Patents

Abstract

ШТАММ STREPTOMCES LAVENDULAE ИНМИ А 8-2 (Всесоюзна  коллекци  микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер А - 840 Д) ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ,

Description

Изобретение относйтес  к микробиологическому синтезу ферментов и может быть применено дл  получени  ходестериноксидазы. Известен продуцент холестериноксидазы Streptomyces lavendulae ВКМ-А-591, который при культивирова нии на среде, содержащей глюкозу, аспарагин, дрожжевой экстракт и холестерин в качестве индуктора, в аэробных услови х образует до 2 г/л биомассы с активностью 3045 ед/г 0 . Недостатком этого продуцента  вл етс  невысока  холестериноксидазна  активность, а также то, что при культивировании, на жидких средах Str. .lavendulae ВКМ-А 591 .образуе пигменты меланоидного ипа, затрудн ющие получение и очистку ф рмент ного препарата. Наиболее близкими к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту  вл ютс продуценты холестериноксидазы Str. hygrpscopicus, а также Str. griseofuscus и Str. acidomycesicus. При культивировании на .среде сложного состава, содержащей дорогосто щие компоненты, такие как пептон, крахмал и.дрожжевой экстракт, в течение длительного срока(з-4 сут в клетка актиномицетов содержитс  10.6,1 284 ,6 ед/г холестериноксидазы 2J . Недостатком цветных продуцентов  вл етс  то, что выращивание провод т в течение длительного срока на многокомпонентной дорогосто щей среде. Целью изобретени   вл етс  штамм продуцент холестериноксидазы, облад щий высокой активностью при выращивании на среде простого состава в течение 1-2 сут и не образующий ,пигментов при культивировании на примен емых средах. Полученный штамм Streptomyces 1avendulае НИМИ- А8- 2(коллекци  института биохимии и физиологии микроорганизмов, коллекционный номе ВКМ А-840 Д),  вл ющийс  высокоактивным продуцентом холестеринокси дазы, обладает следующими признакам Культурально-морфологические признаки штамма. На ,агаризованной среде СР-1 Красильникова колонии 7-10-ти суточного возраста белого цвета, гладкие, плоские, с pqBHbWH кра ми, диаметром 8-10 мм, пигмента не образует. На среде Гаузе-1 колонии розоватолилового цвета(цвет лаванды), гладкие или складчатые, диаметром до 8 мм, субстратный мицелий пепельносерого цвета, пигемента не образует. На картофельном агаре рост в виде крупных (Ю мм)колонии белого или слегка розоватого цвета, воздушный мицелий хорошо развит, белого цвета, субстратный мицелий бурого цвета, пигмент не образует. На.МПА растет плохо, воздушный мицелий не обраэ ует, колонии светложелтого цвета, 5-7 мм в диаметре, пигмент не образует, На сусло-агаре колонии розоватолилового цвета с хорошо развитым воздушным мицелием, 8-10 мм в диаметре, субстратный мицелий темносерого цвета. Физиологические признаки. Желатину разжижает, молоко коагулирует и пептонизирует. Сероводород и индол не образует. Нитраты не восстанавливает ,, В качестве источника углерода потребл ет глюкозу, фруктозу, маннит и ксилозу. Не потребл ет сахарозу , рамнозу и инозит. На ломтиках картофел  растет обильно в виде серого налета. Оптимальна  температура роста 28-30°С. При 37°С рост слабый, при 45 С - не растет. Обладает антибиотической активностью против граммоположительных и граммотрицательных бактерий. Штамм выделен из попул ции коллекционного штамма Streptomyces lavendulae К 4004. При культивировании на жвдкой питательной среде определенного состава образует холестериноксидазу, активность которой составл ет 170,5380 , 5 ед. на грамм сухой биомассы. Сравнение преимуществ предлагаемого штамма с известными продуцентами приведено в таблице. Пример 1. В качестве исходного посевного материала используют культуру, выращенную на скошенном агаре в течение 10 сут и хран щуюс  в холодильнике при . Примен ют среду следующего состава г/л: глюкоза 20,0; NH4NOj2,0; белково-витаминный концентрат 3,0; вода водопроводна  с рН 7,2. Среду разливают в широкие пробирки по 7 мл и

i

колбы Эрл нмейерана 250 мл по 70 мл. Смывом со скошенного агара засевают среду в пробирках(0,2 мл на 7 мл ередьЛ . Выращивание провод т на качалке с 240 об/мин в течение 48 ч при Полученной жидкой культурой засевают среду в колбах(7 мл культуры на 70 мл среды). Выращивание провод т на качалке с 190 об/мин в . течение 22 ч при .

Биомассу отдел ют на центрифуге при 5000 об/мин и промьшают 1/15 М фосфатным буфером. Холестериноксидазную активность определ ют по рписанной методике. За единицу холестериноксидазной активности принимают количество микромоль холестенона, образующегос  под действием холесте т риноксидазы из холестерина за 1 мин при 37°С.

Активность биомассы составл ет 380,5 ед. на 1 г.

П р и м е р 2. Штамм Str.lavendulae ВКМ - А840 выращивают в ферменте ре емкостью 00 л. Объем среды 28 л. Состав среды г/л: глюкоза 28,0; ,0; ,0; белково-витамин ный концентрат 3,0, рН 6,9. Среду

5250.4

в ферментере засевают 48-ми часовой жидкой культурой, выращенной на среде того же состава в колбах на 3 л. Объем посевного материала ни 5 ферментер 2,0 л. Выращивание провод т 22 ч. Биомассу отдел ют сепари- рованием, дважды .промывают дистиллированной водой. Получают 3,0 г/л биомассы с холестериноксидазной активностью 364,0 ед. на 1 г.

Холестериноксидаза, полученна  из биомассы предлагаемого штамма, может найти применение как реагент дл  клинических анализов лри количественном определении холестерина , а также может представить интерес как средство дл  снижени  уровн  холестерина в крови. Высока  холестеринОксццазна  активность продуцента и отсутствие пигмента в биомассе и культуральной жидкости позвол ет значительно повысить выход фермента и упрощает процесс очистки ферментного препарата.„

На опытной установке ИНМИ АН СССР получены партии ферментного препара та холестерйноксидазы, которые -были очищены в 5-7 раз.