SU655327A3 - Способ получени глюкозоизомеразы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ ре, инкубируют, перемешива , при температуре от 1Ь до 40°С (предпочтительно при 25-ciO C) и скорости протекани  потока воздуха I объем в минуту в течение 1-7 суток. Скорость подачи воздуха можно измен ть от 0,3 до 1,5 объема в минуту. Дл  получени  максимального выхода фермента величину рН ферментационной среды поддерживают в интервале между Ь,0 и 8,5 (предпочтительно между 6,4 и 7,5). Максимальна  активность изомеразы в этих услови х достигаетс  но прошествии 3-5 суток. После этого отдел ют клетки микроорганизмов и иснользуют их как источник фермента. Возможен и другой вариант , когда фермент экстрагируют из клеток . Уровень активности, прибЛИжаюш,ийс  к 30 единицам на 1 мл -Оульона культуры, достигаетс  по прошествии 3-х суток, пдиница .активности определ етс  как то количество фермента, которое может образовать 1 мкмоль фруктозы из глюкозы за 1 мин при температуре в среде, характеризуюш .еИ€  1,5 М по глюкозе, 0,03 М по фосфатному буферу с величиной рН 7,0, 0,003 М по сульфату магни  и 0,0003 М по сульфату двухвалентного кобальта. Уровень активности изомеразы, достигаемый при практическом осуществлении насто щего изобретени , мен етс  в зависимости от примен емого штамма и используемой дл  выращивани  среды. Уровень активности, составл ющий 50 единиц на 1 мл бульона культуры, имеет место нри культивировании культуры Actinoplanes missouriensis NRRL Б-3342 на среде, содержащей жидкость после вымачивани  кукурузы. Хорошую активность получают и при культивировании Actinoplanes phillippensis АГСС 12427, Actinoplanes armeniacus АТСС 15676 и Actinoplanes sp. АТСС 23342. Исследование больщого количества видов Actinoplanes показало, что практически все виды этой культуры, их суокультуры , мутанты и разновидности способны продуцировать глюкозоизомеразу и поэтому могут быть пригодны дл  осуществле .ни  олисываемого способа. Такое положение объ сн етс  следующим . Поскольку стенки клеток микроорганизмов вида Actinoplanes содержат ксилозу (преимущественно Д-ксилозу), организм должен быть способным синтезировать пептозу . Единственным метаболическим путем дл  синтеза Д-ксилозы  вл етс  изомеризаци  Д-ксилозы изомеризирующим ферментом Д-ксилозоизомеразой, который также обладает способностью изомеризации глюкозы во фруктозу. Д-Ксилулоза может быть образована из Д-ксилулозо-5-фосфата при воздействии фосфатазы. Последнее соединение , т. е. Д-ксилулозо-5-фосфат,  вл етс  важным промежуточным соединением при образовании гексозо-монофосфато-пептозы . Ниже дана схема биосинтеза Д-ксилозы р Actinoplanes. Гексозо-монофосфатно-лептозный путь: Глюкоза-д ф-- С02 Д-ксилулозо-5-фосфат Д-ксилулоза Д-ксилоза изомеризаци  стенки клеток. Поскольку клеточные стенки Actinoplanes содержат Д-ксилозу, иоэтому все они, как можно ожидать, содержат изомеризуюш ,ий фермент. Пример. По этому принципу нолучают фермент глюкозоизомеразу путем культивировани  микроорганизмов следующих штаммов: Actinoplanes missouriensis NRRL В-3342, Actinoplanes phillippensis АТСС 12427, Actinoplanes armeniacus АТСС 15676 и Actinoplanes sp. АТСС 23342. Эти микроорганизмы хран т по отдельности в форме исходных культур на пластинках с 1,7% триптона, 0,3% сойтона, 0,25% глюкозы и 2,0% агар-агара. Продукт инокулировани  готов т путем перелоса исходной культуры в пробирку с 8 мл стерилизованной среды состава, %: триптон 1,7, сойтон 0,3, К2НРО4 0,25, глюкоза 0,25. Продукт инокулировани  культивируют в этой пробирке при в течение 2-3 суток при встр хивании, а затем его внос т в одну из приведенных ниже сред дл  выращивани  и получени  изомеризующего глюкозу фермента. Среда № 1 содержит следующие компоненты , вес. %: триптон 1,3; сойтон 0,3; К2НРО4 0,25; Д-ксилоза 1,0. Ее разбавл ют водой до нужного объема. Величину рН среды устанавливают на уровне 7,0. Питательные вещества (например, -сахар) перед виесением стерилизуют. Среда № 2 отличаетс  от среды № 1 тем, что вместо Д-ксилозы внос т 0,25% Д-глюкозы , в нее внос т также жидкость после вымачивани  кукурузы (3%), сульфат двухв алентного кобальта и сульфат двухвалентной меди. Средой jMb 3  вл етс  барда, средой № 4 и т. д. - пептоновый экстракт дрожжей, продукт гидролиза казеина , продукт гидролиза соевых бобов, продукт гидролиза белков рыб. Готов т среды и из смесей указанных веществ, К, выбранной из указанных выше сред прибавл ют продукт ннокулировани  из расчета 5 мл последнего на 75 мл среды с триптоном и сойтоном или на 95 мл среды из жидкости после вымачивани  кукурузы, Инкубирование ведут в течение 96 ч при 28С, среду встр хивают на вибрационной установке. По окончании инкубировани  клетки выдел ют центрифугированием 30 мл культуральной жидкости при скоростй вращени  15000 об/мин в течение 10 мин, промывают водоПроводной водой и суспендируют в 14 мл 0,12 М фосфатного буфера с рН 7,0. Полученную суспензию клеток обр-абатывают ультразвуком при 4°С в течение 4 мин, а затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. Верхний слой жидкости можно использовать как сырой источник фермента, вызывающий изомеризацию глюкозы.

Данные об удельной активности полученной глюкозоизомеразы в зависимости от вида культуры и питательной среды представлены в таблице.

Наибольшей активностью отличаетс  глюкозоизомер.аза, полученна  при культивировании Actinoplanes missouriensis NRRLB-3342 на среде, содержащей Д-ксилозу .

На качество получаемого фермента оказывает вли ние также способ подготовки жидкости после вымачивани  кукурузы. Рекомендуетс  нейтрализацию этой жидкости вести до рН 7,0 щелочью, а затем ее профильтровать.

При приготовлении питательной среды из этой жидкости добавл ют сульфат двухвалентного кобальта и сульфат двухвалентной меди с концентрацией соответственно 0,1 мМ и 0,05 мМ.

Наиболее высокие показатели дает применение гидрата окиси натри  (по сравнению с гидратом окиси кальци  и гидратом окиси аммони ).

Claims (2)

1. Способ получени  глюкозоизомеразы

путем культивировани  ее продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральной соли, отличающийс  тем, что, с целью повышени  активности фермента, из микроорганизмов продуцентов используют штаммы Actinoplanes missouriensis NRRL В-3342, Actinoplanes phillippensis АТСС 12427, Actinoplanes armeniacus АТСС 15676 и Actinoplanes sp. АТСС 23342.

2. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в качестве источника азота используют или жидкость вымоченной кукурузы , или барду, или гидролизат казеина, или гидролизат соевых бобов, или гидролизат белка рыб, или их смесь.

Источники информации, прин тые во вним-ание при экспертизе 1. Патент Великобритании № 1280396, кл. С ЗН, опублик. 1972.