SU521849A3 - Способ получени цефалоспорина с - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНА С

Изобретение отнсслгс  к области микробиогогий , к полученилО витибиотнков. Известен с;;особ подучеии  цефалоспорина С, закпючающийс : в TOM, что игтамм 8650 культзгрь Серь.alosporiuTf 49137 (АТСС 14553) выращивают в аэро ных услови х на cpet.e. содержащей источники углерода, органкческие источ1шки азота и сер), а также г-.:.ивральнх- 1е соли, при в течение 7О час с последующим вы делением целэвого продукта извест1Ш ми приемами. Однако известный способ не обеспечивает высокого Бьгхода целевого родукта. С делью повьииен;-.г  выхода аитибиотика, используют штамм Cephalospoyiym sp-Г 12 (АТСС 2O339).Cepbalospo-rium spштамм Р 1 Г,  вл етс  мутантом Ceptiolosporluii; ж л-ТСС liSSOs хранитс  в Американской коллекции культур за номером АТСС 2О339 и в Центральном бюро плесневьзх культур з Баарке. Нидерпакды (Голлаьщи ) под номером CBS 53571.Се 5ЪаiosporisjTT . sp-штамм F 12 обладает следу ющими свойствамн. Колонии вьращивают при 2О С в темноте , а затем дл  образовани  пигмента на свету в течение 2 дней. После инокулирова ки  через 12 дней производ т макроскопические и микроскопические исследовани  ( т. е. после 1О дней роста в темноте и 2 дней на свету). А. Макроскопические свойства, 1.Агар на овс ной муке. Колонии достигают диа1м5етра 13-1S мм за 12 дней, плоские белые или светло-желтые с очень тонко скрученной поверхностью и дрожжевидным внешним видом, кра  регул рные, несплошные , несколько свободные, растительнь й мицелий белый. 2.Агар на солодовом экстракте. Колокии диаметром 12-14 мм на 12-и день, плоские5 светло-коричневые или светло-желтые с ТОН14ИМИ радиальными завитками, дрожлсеподобные, кра  рег л рные5 несплошные , свободные, растителыап мицелий кре- мово-же/пъ; и. 3.Агар ка карто41еле - моркови. Вид такой же, как у ai-apa на овс ной муке, но окраска темнее. 4.Сабораудный агар. Колонии достигаю диаметра 1О-13 мм через 12 дней, такого цвета, как у агара на солодовом экстр те, с заметными радиальными витками, не которые из которых углублены около цент многие, меньшие по размеру, у кра  колон кра  почти сплошные, не совсем круглые. 5.Агар на кукурузной муке. Колонии достигают диa лeтpa 15-18 мм через 12 дней, плоские, белые или светло-зеленые, дрожжевидные, регул рные, но несколько свободные кра , растительный мицелий такого же цвета. Ни Б одной из растительных сред не наблюдают образование диф4ундируемого пигмента. Б. Микроскопические свойства. Наблюде1ше поверхности колоний показы вает, что во всех растительных средах др жеподоб1 ый вид объ сн етс  почти полным отсутствием воздушного мицели , единственными воадушнь1ми структурами  вл ютс  конидифоры, которые возникают пр мо из непрерывной поверхности базального ми цели , Базальный минелий состоит из разветвленных , разделенных стенками швов ш риной 2-3 мкм. Фиалиды простые, поднимающиес  под пр мым углом с базальных швов (ортофиа лиды), иногда имеющие поперечные перегородки близ их основани . Длина их 20-55 , ширина 1,4-2,1 мкм в основании, сужаютс  к верхнему концу до 0,7-154 м Нет утолщенных стенок, проба на хромофильные свойства базальной части фиалид отрицательна. Конидии собираютс  вместе в почти круглые слизистые головки на концах фиалид . Они однопол рные, двухкоиусные, ино да слелка искривленные. Выршаивание культуры ведут в глубинных услови х питательной среды при 2О-З Источником углерода в питательной среде могут быть такие углеводы, как глю коза, сахароза, галактоза, лактоза, фруктоза , декстрин, растворимый и нераствори мый крахмал и свекловична  меласса. Углево ды в питательную среду ввод т в виде см си МОНО-, /щ и полисахаридов. Концентраци  углеводов в питательной среде должна быть 2-1О вес.%. В питательной среде должны быть глинериды или гидролизованные глицериды, например оливковое, арахисовое, кукурузное масло. Количество глицеридов или про дуктов их гидролиза в питательной среде 1-8 вес.%. Питательна  среда содержит также органический источник азота, которым служит растительный или животный протеин или продукт его разложени  или гидролиза, например полипептиды, пептон, триптон или аминокислоты. Органическим источником азота  вл етс  мука из сем н, рыбна , м сна , маисоваЯ; пшенична  мука, мука бобовых , дрожжевой экстракт, м сные экстракты . В качестве неорганической соли в питательной среде могут использовать углекис- льпй кш1ьций, буру уксуснокислый аммоний, сульфат аммони  или фосфаты щелочных металлов. Эти соли содержатс  в питательной среде в количестве 0,5 - 1,5 вес.%, способствуют лучшему биосинтезу цефало- спорина С. В качестве орга1шческого источника серы используют метионин в количестве 0,5- 2,5 вес.%, а также серусодержащие органические соединени  такие как тиогпиколева  кислота, тиоуксусна  кислота, метилТйогликол т4 метилтиоацетат, они содержатс  в питательной среде в количестве О,О5- 1 вес.%. Способ получехж  цефалоспорина С осуществл ют следующим образом. Сначала культуру выращивают на скошенной агаризованной среде (косом агаре), содержащей среду дл  выращивани , в течение 1О-15 дней при 28-ЗО С. Выращенный мицелий промывают водой и полученный раствор использун5Т в качестве посевного материала дл  посевной среды. Посевцую среру выдерживают в аэробных услови х при перемешиваш{К при 25-ЗО С в течеш е час. Полученную посевную среду используют цпк инокул ции конечной среды выращивани  и в конечную среду выращивани  внос т в количестве 5 вес.% от веса ферме1тгационной среды. Выращивание в инокулированной конечной среде осуществл ют в течение 96-13О час при 2О-30, цредпЬчтительно 22-28 С. Выход полученного цефалоспорина С определ ют спектрофотометрически или микробиологически . Способ осуществл ют в виде непрерывного процесса. Периодически отбирают (вывод т) часть ферментационного бульона и в культуру внос т соответствующий объем свежей среды. Обычно это делают после начального периода выращивани  (культивировани ) 75-11О час. Свежие питательные вещества ввод т в систему при помощи непрерывно действующего насоса, а количество элюе1гга регулируют таким образом, чтобы обеспечить посто нство рабочего объема и плотности попул ции в фер- мен.гере. Степень разбавлени  непрерывной культуры поддерживают 0,2-0,8, предпочтительно O, объема/день.

Цефалоспорин С выдел ют из культурной жидкости обычными способами, полученную неочищенную ферментационную смесь очищают фильтрацией, пропусканием через активированный уголь, адсорбцией на ионообменной смоле, элюированием водным основанием , например пиридином, и упариванием растворител  до получени  кристаллического вещества.

Пример 1.В аэрируемый ферме тер из нержавеющей стали {с мещалкой)

емкостью 27 л внос т питательную среду следующего состава, ч:

Арахисова  мука60

Крахмал

Метилолеат

Л р ДОЙЛЬ60

Сахароза

D -Глюкоза

Углекислый кальцийЮ

БураO.S

BL -Метионин15

ВодаДо 1000

рН среды довод т до 7,2-7,8 и среду стерилизуют паром при 12О С в течение 25-ЗО мин.

Ферментер затем инокулируют 5-10 об, % культуры Сepbalospori urn sp.штамм Г 1 полученной инокул цией спор микроорганизма в среду следующего состава, %: Л рдойль 0,1 Замочна  жидкость маиса (пшеницы) 2

Ниже приведен выход цефалоспорина С (ьйкт/г-лл собранной среды).

Выход цефалоспорина С1ОО10О16О1ОО

Ацетат аммони 0,6

Сахароза2

и инкубацией инокулированной среды в аэрируемой копба в 7 час при .

Инокулированный ферментер, содержащий питательную среду, выдерживают 13О час при 22-28°С и в течение этого периода поддерживают уровень аэрации в 1л/мин при перемешивании со скоростью ЗОО45О об/мин. Полученна  культура содержит 45ОО-5ООО мкг/мл цефалоспорина С (среднее значение).

Пример 2. Рост с 1 дм косого агара культуры Ceptialosporium $р.штамм F 12 суспендируют в 5 мл стерильной воды и используют дл  инокул ции 5ОО мл посевной среды, следующего состава, ч.: Замочна  маисова  жидкость 25 Сахароза2О

Ацетат аммони 4,5

Л рдойль0,5

ВодаДо 1ООО

Затем инокулированную среду инкубируют при 24-28°С в качалке с 22О об/мин 3 течение 72 час в присутствии различных соединений серы в количестве одного эквивалента серы (0,01 мол  в 1ООО мл). Затем по 6О мл каждой из сред (I-IV ), с1риведеш1Ь5х в табл. 1 инокулкруют полученной вегетативной средой и выдерживают 114 час при 22-28 С в колбе-качалке с 25О об/мин.

Таблица 1

IИ1И|У

Пример 3. Инокулируют посевной средой, полученной в примере 2, 6О мл среды следующего состава, ч. : Арахисова  мук  60

Крахмал4О

Метиололеат6

Л рдойль6О

Сахароза5

Церелоза7

Углекислый кальций1О

Бура0,5

DL -Серин2

Тиоуксусна  кислота1

ВодаДо 10ОО

Инокулированную среду инкубируют при 22-28°С Б колбе-качалке с 250 об/мин в течение 1ОО час и получают бульон, содержащий 330-36О мкг/мл цефалоспорина

Пример 4. Повтор ют опыт примера 1, но берут питательную среду следующего состава, ч:

Арахисова  .vryKa3

КрахмалВО

Метилолеат25

Сахароза5

Гл го коз а7

Углекислый кальцийЮ

Бура0,5

DL Метионин15

ВодаДо 1ООО

Г1ол -ченна  культура содержит 4500 5ООО кг/мл цефалоспорина С.

П р и м ер 5. В аэрируемый ферман- тер из нержавеющей стали с мещалкой емПродол хит ель ностъ Быращив анк ,, час

к

82 116 14О 164 188 213 236 260 284 308 332

костью 27 л внос т питатехгыую среду следующего состава, ч :

6О 40 25

ука

5

7 1О

кальций

0,5

ин 15 1ООО

До

рН довод т до конечного значени  7,2- 7,8 и среду стерилизуют паром при 12О С в течение 20 мин. Ферментационную среду инокулируют 5-10 об.% культуры Cepttalosporiy-msp- , полученной инокул цией спор микроорганизма в следую и,ую среду (части на 1ООО):

Л рдойль

1

Замочна  лсидхость маиса 2О

6

Сахароза 2О

к инкубацией шгокулированной среды в аэ рглэуемой колбе 72 час гфи 28-ЗО С,

Икокулированный ферментер,, содержащий пнтателыдао среду, выдерживают 92 час при 22-28 С. В культурапьш тй котел подают культуральную среду из расчета 260 мл/чаСу так чтобы степень разбавлени достчггла О 25 объел1:/день. Температуру

выдерживают в интервале 22 24-С, перемешивают со скоростью 35О об/мин, поддерхшвают уровеггь аэрации OjS-l л/мин в течение всего процесса Быращйва1ш . За 15 диен от начала непрерывного процесса собираю-т 93,6 л среды с концентрацией цефалоспорина С. указанной в табл. 2.

Таблица

онцентраци  цеалоспорина С, ;-лкг/мл

2180

2090

2260

2010

2375

2400

2130

221О

2175

2200

2190

5218 9

11родолла;гельнос1Ь вьфашивани ,

час

35620ОО

38О2260

4О4219О

4282290

4522070

Собранный o6beivi О, на всех последующих этапах - 6240 мл.:

Claims (1)

1. Формула изобретени  лерода, азота и минеральные соли, с послеСпособ получени  цефалоспорина С, пу-повышени  выхода антибиотика, используют

   М выращивани  культуры рода Cephatos- ; штамм CephaLosporium sp.F 12 (АТСС riuTn на среде| содержащей источники уг-20339).

   .7 К.)

   ПрСДси/жение табл. 2

   Кониентраци  iie-j фалоспорина С, j

   мкг/ мл

   .дующим выделешш.м целевого продукта, 20 отличающийс  тем, что, с целью