SU562205A3 - Способ получени алкалоидов спорыньи - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ СПОРЫНЬИ

3

Используемый сог тасно предлагаемому способу штамм культуры Claviceps purpurea был выделен следующим образом. Исходную культуру Claviceps purpurea культивировали на Sclerotium с высоким содержанием алкалоида . Были использованы три стадии инокул ции в пОВторных циклах. В отдельных циклах материал получалц на жидкой цитательной среде, исиользу  колонии, сн тые с твердой питательной среды. После этого, исиользу  полученный инокул нт, готовили жидкую культуру, продуцирующую алкалоид. Клетки, полученные на этой стадии, вновь трансинокулировали на твердую питательную среду. К каждой порции питательной среды добавл ли 1,0-10,0 г/л .нитрата аммони .

К жирной питательной среде добавл ли 0,5 г/л дигидрофосфата кали  и 20,0 г/л хлористого , натри .

Те культуры, которые на шестой или седьмой день культивации продуцировали наиболее подход щее количество алкалоидов пептидного типа, пересевали на твердую питательную среду. В результате выделили штамм Claviceps purpurea OKJ 88/1972, который хранитс  под указанным номером в национальном институте здравоохранени  в Будапеште .

Дл  идентификации этого штамма берут во внимание его следующце морфологические и биохи Мпческие признаки.

Морфологические признаки колонии , образовавшейс  на питательной среде SC101 после инкубационного периода в 30 дней, следующие: чсчко ограниченные растущие радиально складчатые колодии диаметром 25-30 мм. Бархатисто-бела  поверхность со светло-бежевым центром и коричневатой внутренней стороной. С поверхности агара твердые колонии снимаютс  трудно. Под микроскопом клетки, образующие колонию, выпуклые, хрупкие, зернистые.

После культивации культуры ла питательной среде SB 203 она о.крашена в светло-бежевый цвет, напоминает пух.

Таблица 1

Под микроскопом клетки культуры образуют сильно преломл ющие, разделенные перегородками пр мые черточки с небольшим количеством ответвлений толщиной 4-5 мкм. По мере старени  клетки станов тс  выпуклыми и зернистыми. по росту щтамма и образованию им алкалоида на питательной среде SB 203 приведены в табл. 1.

Вли ние органических источников азота на образование штаммов алкалоида приведено в табл. 2.

Таблица 2

Вли ние нитрата аммони  на образование щтаммом алкалоида приведено в табл. 3.

Дл  того чтобы выделить и идентифицировать алкалоиды, питательный бульон экстрагировали смесью хлороформа и изопропилового спирта в отношении 4 : 1. Экстракт, содержащий алкалоиды, хроматографировали в слое окиси алюмини . Отдельные компоненты вымывали и онредел ли их концентрацию по УФ-поглощению, использу  в каждом опыте идентичные известные стандарты.

Полученные при помощи штамма алкалоиды имеют состав, %: эргокриптинина 5, эргокорнинина 4, эргокриптина 30, эргокорнина 28, эргозина 5, эргометринина 4, эргометрина 22, другие растворимые в воде алкалоиды 2.

Таким образом, штамм Claviceps purpurea OKI 88/1972  вл етс  разновидностью, полученной без мутагенной обработки. Он спосоТаблица 3

бен продуцировать, алкалоиды в услови х садрофигина . При его с&держании в питательной среде 0,01 -1,0% нитрат аммони  оказывает не замедл ющее, г ускор ющее действие на рост щтамма и на образование им алкалоида . В образующих алкалоид питательных средах не наблюдалось образовани  темнофиолетового пигмента, характерного дл  щтаммов Claviceps. Максимальное количество алкалоида образуетс  на щестой-седьмой день культивации. На седьмой день культивации количество мицели  было ниже 3,5, а относительное образование алкалоида, рассчитанное на сухие клетки, составл ло 30 мг/г; 60-70% полученных таким образом алкалоидов состоит из двух компонентов группы эрготоксина и их изомеров соответствен .но практически в одиеаковых соотношени х .

Таким образом, предлагаемый способ относитс  к ферментативному процессу получени  алкалоидов спорыньи, главным образом эргоК|рипти .на и эргокорнина, путем культивации указанного щтамма на жидкой, подвергнутой аэрации питательной среде, содержащей сахарозу , неорганический источник азота и другие известные добавки.

Предлагаемый способ обладает по сравнению с известными М:ногими преимуществами. Так, он имеет хорощую воспроизводимость. При удалении органических источников азота из питательной среды и замене их нитратом аммони  воспроизводимость может бытьулучщена еще больще, экономичность процесса при этом повыщаетс .

Продолжительность процесса 5-6 дней, в то врем  как продолжительность известных способов 8-12 дней.

Алкалоиды свободно выдел ютс  из питательного бульона.

Образующиес  алкалоиды имеют в питательной среде удачное соотнощение: алкалоиды , принадлежащие к группе эрготоксина, образуютс  в равных количествах, так что при отделении этих двух алкалоидов и при добавлении к полученной смеси эргокрицтина эрготоксин может полностью вступать в соединение с обычным соотношением компонентов . Кроме того, при получении алкалоидов спорыньи образуетс  эргометрин - наиболее важный сопутствующий алкалоид, растворимый в воде. Этот алкалоид легко извлекаетс  в процессе работы и выдел етс  самосто тельно .

Пример 1. Типичную колонию щтамма Claviceps OKI № 88/1972 в возрасте 30 дней снимают с поверхности твердой питательной среды SC 101 и гомогенизируют в 10 мл стерильной воды. 100 мл питательной среды S2C, помещенные в колбу Эрленмейера на 500 мл, прививаютс  этой суспензией. Питательна  среда S2C имеет следующий состав, г: сахароза 200,0, лимонна  кислота 15,0, дигидрофосфат кали  0,5, сульфат магни  0,3, гидроокись аммони  до рП 5,2, вода до 1000,0.

Культуру встр хивают при 24°С в течение

6дней, затем отбирают фракцию 10 мл, которую далее используют дл  прививки 100мл питательной среды SB 101, помещенной в

колбу Эрленмейера на 500 мл. Питательна  среда SB 101 имеет следующий состав, г: сахароза 100,0,  нтарна  кислота 10,0, нитрат кальци  1,0, нитрат аммони  1,0, дигидрофосфат кали  0,5, сульфат магни  0,3, хлористый натрий 10,0, гидроокись аммони  до рН 5,2, вода до 1000,0.

Культуру встр хивают при 24°С в течение

7дней. Содержание сухого материала в культуре составл ет 3,42%.

100 мл культуры, полученной как описано выще, экстрагируют 50 мл смеси хлороформа и изопропилового спирта, вз тых в соотнощеНии 4:1. 10 мл экстракта выпаривают, остаток помещают в 1 мл смеси1 хлороформа и

метилового спирта 1 : 1 и раствор хроматографируют в слое сухой окиси алюмини . П тна алкалоида обнаруживаютс  в УФсвете; их вымывают 50%-ным раствором ме тилавого спирта в воде, содержащим 1 % винной кислоты; количество соответствующих алкалоидов определ ют по УФ-поглощению. Полное содержание алкалоида в культуре составл ет 1687 у/мл в то врем , как содержание из эргокорнина - эргокриптина до

стигает 1187 УМ л.

Эргокриптин и эргокорнип могут быть выделены в кристаллическом виде из любой культуры известными методами. Пример 2. Штамм и тверда  питательна 

среда из агара те же, что в примере 1. Св занный слой мицели  около 150 см. Культуру в возрасте 30 дней извлекают с поверхности твердой питательной среды из агара. Вещество суспендируют и гомогенизируют в

100 мл воды. I

Из полученной таким образом суспензии

отбирают фракции по 20 мл и используют их

дл  прививки двух колб Эрленмейера на

750 мл, содерлсащих по 200 мл питательной

среды SC 100. Состав питательной среды SC 100 следующий, г: сахароза 100,0, лимонна  кислота 10,0, сульфат магни  0,3, дигийрофосфат кали  0,5, хлористый натрий 10,0, гидроокись аммони  до рН 5,2, вода до

1000,0.

Смесь встр хивают при 24°С в течение 6 дней, после чего 400 мл полученного таким образом привитого материала используют дл  инокул ции 6 л питательного бульона

SB 103, помещенного в лабораторный ферментер на 10 л. Состав питательной среды Sn 103 следующий, г: сахароза 100,0,  нтарна  кислота 10,0, хлористый натрий 10,0, нитрат аммони  3,0, нитрат кальци  1,0, дигидрофосфат кали  0,5, сульфат магни  0,3, гидроокись аммони  до рН 5,6, вода до 1000,0.

Этот питательный бульон перемешивают при 25°С со скоростью 240 об/мин и насыщают воздухом со скоростью 0,5 л воздуха/л ,Мйн. Ферментаци  . продошжаетс  5 Дней. Содержа.ние сухого материала в полученном таким о.бразом иитательном бульоне 3,14%. .Общее содержание алкалоида, определ емое по методике, описанной в примере 1, составл ет 1046 Y/мл. Содержание эргометрина достигает 310 у/мл, содержание эргокорнвна - эргокриптина 636 у/мл. Питательный бульон обрабатывают, как описано в примере 1.

Пример 3. Использу  штамм, идентифицированный в примере 1, получают слой мицеЛи  на твердой питательной среде SB 010 при инкубацИ - в течение 30 дней. Состав питательной среды SB 010 следующий, г: сахароза 100,0,  нтарна  кислота 10,0, нитрат аммони  10,0, ни.Т1рат кальци  1,0, дигидрофосфат кали  0,25, сульфат магни  0,25, гидроокись аммони  (до рН 5,2), волокнистый агар 25,0, вода до 1000,0.

Культуру, выделенную с поверхности агара , используют дл  приготовлени  npHiBHB04ного материала, как описано в примере 2, с ислользованием питательной среды SC 100. На 6-ой день культивации порци ми по 400 мл полученного инокул та прививают по 6 л стерильной питательной среды SB 101, помещенной в ферме1нтер на 10 л. Культиваци  продолжаетс  в течение 5 дней, как описано в примере 2. На этой стадии полученные питательные бульоны объедин ют, и этот инокул т (18 л) используют дл  прививки .200 л жидкой питательной среды SC 101, помещенной в ферментер опытной установки на 300 л. Эта среда не содержит волокнистого

агара, в остальном о,на имеет выщеуказанный состав. Питательный бульои перемешивают со скоростью 300 об/мин и насыщают воздухом со скоростью 9 .

Ферментаци  продолжаетс  в течение 6 дней при 25°С. На 55-й и 60-й час ферментации добавл ют гидроокись аммони , поддержива  рН культуры 4,5.

На 6-й день «ультивации содержание сухого .материала в бульо.не 3,42%, общее содержание алкалоида 1246 у/мл, в то врем  как содержание эргокорнина-эргокриптина достигает 646 Y/мл. Содержание эргометрина 202 7/мл.

Бульон обрабатываетс  далее по аметодике , описанной в примере 1.

Claims (1)

1. Патент Великобритании № 1170600, кл. С 2G, опублик. 1968.