JPS5946598B2 - 微生物による長鎖脂肪酸類の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は直鎖炭化水素および／又は直鎖モノカルボン酸
から微生物を利用して相応するジカルボン酸もしくはジ
カルボン酸とモノカルボン酸を製造する方法に関する。

：′現在、長鎖の直鎖モノカルボン酸
は界面活性剤、油剤、安定剤などの製造原料として広く
利用されているが、その製造は多くの場合牛脂、やし油
などの天然油脂に依存するため原料的な制約がある。

なお、近年石油中に含まれる直鎖炭化水素を出発原料と
して種々の炭素数の直鎖モノカルボン酸を合成する方法
が提案されており、特に奇数個の炭素数を有する直鎖脂
肪酸も製造されるようになってその入手が容易にムつだ
に伴いその特異な性質を利用した種々の用途が期待され
ている。

一方、長鎖ジカルボン酸は可塑剤、ナイロン、合成樹脂
、合成潤滑油および香料などの製造原料として広範囲な
用途を有しており、種々の炭素数のジカルボン酸の工業
的製造方法の確立が要望されている。

また、従来微生物を利用して長鎖の七ノーならびにジカ
ルボン酸類を製造する方法として、石油留分中に含まれ
ているノルマルパラフィンのような直鎖炭化水素から相
応するモノカルボン酸を製造する方法、天然又は合成に
より得られる直鎖モノカルボン酸を原料としてジカルボ
ン酸を製造する方法も提案されているが未だ工業的に有
利な方法は確立されていない。

本発明者等は微生物を利用して長鎖モノカルボン酸なら
びにジカルボン酸を有利に製造できる方法について検討
した結果、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃ
ｅｓ）に属する酵母菌が・直鎖炭化水素もしくは直鎖モ
ノカルボン酸を酸化してジカルボン酸もしくはジカルボ
ン酸とモノカルボン酸を生成する能力を有することを見
出し本発明をなすに至った。

したがって、本発明はデバリオマイセス属に属する酵母
菌を利用してジカルボン酸もしくはジカルボン酸とモノ
カルボン酸を有利に製造できる方法を提供することを目
的とする。

以下本発明について詳しく説明する。

本発明によると、上記微生物を利用して（１）長鎖状直
鎖炭化水素から相応するジカルボン酸、もしくはジカル
ボン酸とモノカルボン酸との混合物が、（２）天然なら
びに合成の長鎖状直鎖モノカルボン酸から相応するジカ
ルボン酸が、ならびに（３）長鎖状直鎖炭化水素と直鎖
モノカルボン酸との混合物から相応するジカルボン酸が
それぞれ有利に製造される。

本発明において利用される微生物、デバリオマイセス属
に属するカルボン酸生産菌は、秋田系の製油所付近の土
壌から採取、分離された酵母菌であって、以下に示す菌
学的性状の所見からみてデバリオマイセス“ファフィ−
（ＤｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓＰｈａｆｆｉｉ）と同定さ
れ、その菌株ＢＲ−１５１は工業技術院微生物工業研究
所にＦＥＲＭ ＰＡ４３００で寄託されている（また
、この菌株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ２０４９９で寄
託されている）。

次に上記寄託菌株ＢＲ−１５１の菌学的性状を示す。

１、細胞の形状、大きさ マルトエキス液体培養（２５℃、３日培養）細胞は卵形
もしくは長楕円形、大きさは１．５〜５．５Ｘ３．５〜
１３μ、単独または対をなす。

沈澱状に生育する。

マルトエキス寒天培地（２５℃、７日培養）白色もしく
は灰黄色、わずかに湿潤光沢のコロニーを形成する。

周縁は波拠ポテト寒天上のスライドカルチュアー 擬菌糸の形成は認められない。

２、胞子の形成 １Ｘ８Ｍファントホツフ氏液浸石膏、Ｖ−８培地で胞子
が形成される。

胞子は中央部に一油滴を有し、表面に微細な突起が認め
られる。

３、糖の醗酵性 グルコース ＋ ガラクトース ＋（微弱） シュクロース ＋ マルトース ＋（微弱） ラクトース − ４、糖類の資化性 第１表のとおり ５、アルブチンの分解；分解する ６、 ＫＮＯ３の利用 ；利用されない７、 ビタ
ミンの要求性；なし ８、３７℃での生育 ；生育する 表−１糖類の資化性 グルコース ＋ ガラクトース ＋ Ｌ−ソルボース ＋ シュクロース ＋ マルトース ＋ セロビオース ＋ トレハロース ＋ ラクトース − メリピオース ＋ 可溶性でんぷん 十 Ｄ−キシロース ＋ エタノール ＋ グリセロール ＋ サリシン ＋ イノシトール 一 本発明において、ジカルボン酸もしくはジカルボン酸と
モノカルボン酸との混合物の製造原料（培養基質）とし
て用いられる直鎖炭化水素は炭素数８〜１８個を有する
ものであればよく、特に１１〜１６個の炭素数を有する
長鎖状のものが好ましい。

また、ジカルボン酸のみを選択的に製造するための製造
原料（培養基質）として用いられる直鎖モノカルボン酸
ならびに直鎖炭化水素もそれぞれ炭素数８〜１８個を有
するものであればよく、特に１１〜１６個の炭素数を有
する長鎖状のものが好ましい。

上述したように、本発明では目的とするカルボン酸、す
なわち、ジカルボン酸又はジカルボン酸とモノカルボン
酸との混合物の製造に応じてその製造原料（培養基質）
を選択するものである。

また、デバリオマイセス属に属するカルボン酸生産菌の
培養に際しては上記製造原料に加えて該菌が資化しつる
炭素源、窒素源さらには無機塩類、その他の栄養源を添
加した培地を用いる。

培地中における上記製造原料（基質）としての直鎖炭化
水素および／又は直鎖モノカルボン酸の用量は培地に対
して５〜３０Ｖ／Ｖ％が好ましい。

また、培地に添加される上記炭素源としては例えばグル
コース、スクロース、マルトースなどが用いられ、窒素
源としては、例えば硝酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウムのような無機態窒素化合物、ペプトン、コーンスチ
ープリカー、アミノ酸のような有機態窒素化合物が用い
られる。

また、無機塩類としては例えばリン酸ナトリウム、リン
酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸第１
鉄、硫酸マンガンなどが用いられ、その他の栄養源とし
てイーストエカストラクトなどが用いられる。

本発明においては、上記デバリオマイセス属に属するカ
ルボン酸生産菌の菌株又はその培養物もしくは該菌株を
予め生育させた菌体を上述した培地に加え菌の培地成分
とを十分に接触させるように、例えば攪拌、ノズルによ
る空気吹込み又は振盪などの手法を適用して好気的条件
下に培養（反応）を行わせる。

培養ｆこ際しての温度（反応温度）は２５〜３５℃に雄
実し、培地のｐＨは３〜９、好ましくは４〜８に調整す
る。

また、培養時間（反応時間）は使用する製造原料（基質
）により変化するが通常２４〜１２０時間で反応が完了
する。

なお、上述したように使用菌株の培養物又は該菌体を予
め生育させたものを培養させる場合には該菌株をそれが
資化しつる炭素源、例えばグルコース、スクロース、マ
ルトースのような糖類、種々のカルボン酸又は直鎖炭化
水素を含む培地に接種□して菌体の生育が最大に達した
時点またはその前□後の培養物もしくは生育菌体を培地
へ添加して培養（反応）を行う。

本発明において製造原料（培養基質）として直鎖炭化水
素と直鎖モノカルボン酸を併用する場合には、直鎖炭化
水素を製造原料（培養基質）として用いてジカルボン酸
とモノカルボン酸とを併産させるときに生成するモノカ
ルボン酸の一部を再利用すると直鎖炭化水素と培地の接
触効果を助長ｌ−る利やがあり、かつモノカルボン酸の
生産量の調整に役立つことにもなる。

上述したようにして培養（反応）を行うと培地中に実質
的量のジカルボン酸又はジカルボン酸とモノカルボン酸
の混合物が生成して蓄積するので、これらのカルボン酸
類を、抽出、固液分ｉ、中和析出、分留などの常法手段
〔こより分離精製し、モノカルボン酸、ジカルボン酸又
は両者の混合物として採取する。

本発明によると、後記実施例に示されるように、モノカ
ルボン酸ならびにジカルボン酸が微生物の利用１こより
簡易な培養操作で高収量で得られるので長鎖脂肪酸類の
製造上米するところが大きい。

以下に実施例を例示する。

実施例 ｌ フラスコ培地組成 スクロース ３０ｒ 塩化アンモニウム ４ノ リン酸二水素カリウム ２を 硫酸マグネシウム７水和物 ０．６ｆ 硫酸亜鉛７永和物 ０．０１１ 硫酸第一鉄７水和物 ０．０１Ｆ マイクロジカルペプトン ０．５ｆ イーストエキストラクト ０．５ｔ 本培地組成 リン酸二水素カリウム 塩化アンモニウム ５ｖ 硫酸マグネシウム７水和物 ０．６ｆ 硫酸第−鉄７水和物 ０．ＯＩＳ’ 硫酸亜鉛７水和物 ０．００８ ｆマイクロジカ
ルペプトン ０．５ｆ イーストエキストラクト ０．５１ フラスコ培地組成のものを蒸留水で総容量が１ｔになる
ように浴解し％ｐＨを６．５に調整する。

このように・して得られる水爵液を５００ｍ１容の三角
フラスコに１００−採取し、１１５℃で１５分間加圧蒸
気殺菌を行った培地にマルトエキストラッド−寒天培地
で３０℃で１日間培養して得られた菌体デバリオマイセ
スーファフィーＢＲ−１５１を３白金耳ずつ接種して２
８℃で２９時間往復振盪機上で培養する。

このようにして得られた種菌液１００ｒＩｌｌを前記本
培地組成のものを蒸留水でｌｔ容量にした培地８００１
ｒｌｌと別表直鎖炭化水素または直鎖カルボン酸、１１
０ ｒを１１５℃で１５分間加圧蒸気殺菌後２を発酵槽
（いわしや製）に加え、これに２規定の水酸化カリウム
液を添加してｐＨ６，５〜７．５に調整しつつ３０℃に
おいて通気によって好気的条件下で攪拌しながら９６時
間から１２０時間培養する。

、培養中に発泡が認めら、れる時にばあらかじめ１１５
℃で１５分間加圧蒸気殺菌した消泡剤（東芝シリコン（
株）製ＴＳＡ７３０）１５％水溶液を適宜注入する。

培養終了後発酵槽に水酸化カリウム粒を加えｐＨ１０Ｇ
こして培養液を抜き出し、これに濾過助剤を加え減圧濾
過、洗浄したのち濾液を硫酸でｐＨ２にしてエーテル抽
出し、エーテル留去をして得られる生成物をジアゾメタ
ンでメチル化してガスクロマトグラフィーで分析３する
。

その結果を第２表に示す。実施例 ２ 実施例１で示した本培地組成のもの蒸留水ｌｔに溶解し
、ｐＨを５．５に調整し炭素源としてスクロース５（ｌ
を添加したものを５００ｍ／容の振盪フラスコに５０ｒ
ｒｌｌとり、これに実施例１で用いた菌株２白金耳を接
種し、３０℃で２６時間生育培養させ、得られた培養液
を遠心分離機にかけて菌体を分離する（乾燥菌体として
約Ｉｆ）。

０．５ Ｍ ＩＪン酸バッファー（ｐＨ７，０） １０
０ｍ１とノルマルドデカン１０ｍ７！を混合して反応液
を調製する。

反応液と上記菌体を３０℃の温度で７２時間反応させる
。

反応生成物を水酸化カリウムでｐＨ１０にして実施例１
と同様の操作で分析した結果、反応液中にラウリン酸５
．３．ｍ９／ｌ １．１０デカンジカルボン酸４．１■
／ｌが得られた。

なお、本実験操作でも培地、基質および菌の生育に関与
する器具については常用により予め加熱蒸気殺菌等の操
作を実施し、無菌的条件下で実施した。

実施例 ３ □ｂＣ人寒天培地組成 リシ酸水素ニアンモニウム １０ｔリン酸二水禦
カリウム ２ｆ硫酸マグネシウム７水和物
０．３ｆ硫酸第一鉄７水和物 ０．
０１ｆ硫酸亜鉛７水和物 ｏ、ｏｏｓｒイー
ストエクストラクト ０．５Ｆ寒天
１５ｆ １、ｌＯデカンジカルボン酸 １０ｒ実施例１で
用いた菌株をマルトエフトラクト寒天培地で３０℃で２
４時間培養した菌体を０．２％塩化カリウム水浴液で洗
い出して遠心分離機（久保田製作所製ＫＨ−８０型１０
．００ Ｏｒ、ｐ、ｍ、 ６分）で菌体を沈降させ、上
澄みをデカンテーション操作で除去したのち、これに０
．２％塩化カリウム水浴液を加え攪拌、遠心分離、デカ
ンデージョンを繰り返し洗浄後ｌ×１０３セル／ｒｎｌ
の菌懸濁・液を調製する。

上記懸濁液にヘーメナルーへ′−ニトローＮ−ニトロソ
グアニジンを２００γ／−になるように添加して３０分
間振盪後、０．２％塩化カリウム水溶、液で洗浄後得ら
れたＮＴＧ処理菌懸濁液をマルトエクストラクト寒天培
地上で３０℃で培養し、ＤＣＡ寒天培地組成物を蒸留水
１ｔｐＨ７，ｏに調製した寒天培地にレプリカする。

マルトエキストラクト培地に生育しＤＣＡ培地で生育し
なかった菌のみを釣取して得られた菌株について実施例
１に示す方法で直鎖炭化水素としてトリデカン１２０−
を用いて９６時間培養を行った結果１，１１−ウンデカ
ンジカルボン酸が２５．５ｆ／ｌの濃度で産生した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ デバリオマイセス属に属するカルボン酸生産菌を、
   直鎖炭化水素を基質として含む培地中で好気的条件下に
   培養することを特徴とするジカルボン酸又はジカルボン
   酸およびモノカルボン酸を製造する方法。 ２ デバリオマイセス属に属するカルボン酸生産菌を、
   直鎖モノカルボン酸を基質として含む培地中で好気的条
   件下に培養することを特徴とするジカルボン酸を製造す
   る方法。 ３ デバリオマイセス属に属するカルボン酸生産菌を直
   鎖モノカルボン酸および直鎖炭化水素を基質として含む
   培地中で好気的条件下に培養することを特徴とするジカ
   ルボン酸を製造する方ム４ デバリオマイセス属に属す
   るカルボン酸生産菌を予め該菌が資化しつる培地中で生
   育させ、ついで直鎖炭化水素又は直鎖モノカルボン酸も
   しくは直鎖炭化水素および直鎖モノカルボン酸を基質と
   して含む培地中で好気的条件下に培養することを特徴と
   するジカルボン酸又はジカルボン酸およびモノカルボン
   酸を製造する方法。