SU444375A1 - Способ получени биомассы - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к микробиологии.

Известен способ получени  биомассы путем выращивани  микроорганизмов в водной питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных солей при аэрации кислородсодержащим и углеводородсодержащим газами, регулировании общего парциального давлени  кислорода и общего давлени  в питательной среде с последующим отделением микроорганизмов от питательной среды.

Цель изобретени  - улучщение условий выращивани .

Это достигаетс  тем, что регулирование давлени  кислородсодержащего газа и углеводородсодержащего газа в водной питательной среде осуществл ют так, что оно обеспечивает весовое отнощение растворенного кислорода к растворенному углероду в среде до 5-кратного по Сравнению со стехиометрическим весовым отношением потребленного кислорода к потребленному углероду при образовании биомассы , при этом производ т одновременное регулирование общего давлени  газа и общего парциального давлени  кислорода, чтобы в среде было менее чем 30 ч/млн общего растворенного кислорода.

Дл  проведени  описываемого процесса выбранный микроорганизм; использующий углеводород , или смесь микроорганизмов и водна  питательна  среда загрул аютс  в бродильный чан, приспособленный дл  поддержани  давлени  выше атмосферного. Особенно полезны микроорганизмы, использующие метан рода Bacillus, Pseudomonas к Methanomonas, в особенности микроорганизм рода Pseudomonas ATCC-2I, 310, который в выделенном сухом состо нии  вл етс  полезным как пища или

корм или кормова  добавка. Водна  питательна  среда содержит нар ду с водой питательные минеральные соли, включа  ион аммони  или нитрата, как источник азота и имеет рН около 7,0.

Брожение проводитс  при комнатной температуре путем подачи в бродильный чан углеводородной текучей среды и воздуха или другого кислородсодержащего газа таким образом , что сумма парциальных давлений в углеводородном питании обеспечивает весовое отношение растворенного кислорода к растворенному углероду в бродильной среде примерно до 5-кратного по сравнению со стехиометрическим весовым отношением потребленного

кислорода к потребленному углероду при образовании биомассы, и общее давление кислородсодержаших газов подачп и парциальные давлени  кислорода аналогично регулируютс  так, чтобы в среде обеспечивалось от 0,0001 до

0,0090% всего растворенного кислорода.

Полученна  биомасса отдел етс  от остающейс  жидкости, промываетс  и может использоватьс  или может быть высушена и затем использована как пищевой проду кт или добавка к нему,

Используемый микроорганизм Pseudomonas metlianica (AlCC-2i, 310), использующий углеводороды, может быть описан как состо щий в молодых культурах из больщих грамнегативных лалочек щириной 1-3 мк и длиной 4-8 мк. По составу брутто клеточные продукты по весу содержат Ьи-70% белка, 2U-4U7o углеводородов, 2-iU7o жира и 2-б7о золы. Организм может быть культивирован и выделен из различных сред минеральных солеи. Предпоч1ительным источником азота  вл етс  ион аммони  или из аммиачных солей, или из аммиака, но могут примен тьс  другие источники азота (за исключением элементарного азота), например нитраты. Субстратом быть метай или природный газ различного состава и кислород или воздух с углекислотой или без нее. Микроорганизм Pseudomonas (AiCC-21, 31U) будет расти в присутствии метана или метанола и может использовать некоторые высшие углеводороды, например гексан , когда растет в метане. Метан должен присутствовать в пределах от 1 до 97 об. %, кислород может подаватьс  в широком пределе концентрации вне токсичных количеств в газе нитанн . Ион магни   вл етс  важным ионом (иредиочтительио от 0,005 до 0,35 г/л иоиа магни ). Ион кальци  в виде растворимых солей должен присутствовать в среде в концентрации не менее 0,00025 г/л. Ион железа в виде растворимых солей должен присутствовать в среде в концентрации не менее 0,0001 г/л. Микроорганизм Pseudomonas (AiCC-21, 310) может использовать различные неорганические источники азота предпочтительно с ионом аммоии  в концентрации от .0,1 до 5,0 г/л. Скорость роста микроорганизма Pseudomonas почти нулева  при и при 40С, умеренна  при и оптимальна  при 30-ЗЬС. Брем  удвоени  организма зависит от условий роста, например, непрерывности потока или статического состо ни  газа питани  во взбалтываемых сосудах или в непрерывных системах , где лимитирующие факторы не присутствуют и врем  поэтому измен етс  от 5 до 100 час.

Микроорганизм АТСС-19, 385  вл етс  смешанной культурой, выделенной из почвы или растени  элодиа и определенной среды минеральпых солей и атмосферы, содержащей метап , кислород, углекислоту и азот. Этот микроорганизм содержит грам-отрицательные палочки шириной 0,5-3,0 мк и длиной 2-10 мк в качестве преобладающего организма, малую бактерию и дрол жевые клетки.

Больша  часть организмов подвижна и несколько неустойчиво окрашиваетс  по Граму, но обычно они умеренно грам-отрицательны. АТСС-19, 385 растет только в присутствии метана , но при росте в метане может использовать высшие углеводороды. Кислород в газе питани  может подаватьс  с высокой концентрацией . Углекислота не существенна дл  роста , но  вл етс  предпочтительным компонентом гааз питани . АТСС-19,385 может использовать различные неорганические источники азота. Рост происходит в температурном пределе от 10 до 55°С и при рП от 5,0 до 8,0. Оптимальный рост при 20-37°С и рН от 6,5-7,5,

Дл  выделени  культуры пользуютс  стандартным методом, но примен ют питательиую среду из минеральных солей, почти свободную от меди и цинка, за исключением малых количеств в виде загр знений в других сол х.

Типична  солева  среда (2/500 мл) дл  выделени :

Количество, г

1,0 2O

ОД

0,045

0,01

0

0,001

0,0002

П2О

0,0002

0,0002

0,00004

Выделение культуры происходит следующим образом. В каждую из нескольких стерильных 250 мл колб Эрленмейера внос т 50 мл стерильной среды из основных солей, описанных в табл. 1, ночти не содержащих меди п цинка.

В среду каждой из нескольких колб затем добавл ют малыми порци ми, например 0,5 г, образцы растени  элоди . В несколько дополнительных .колб добавл ют 0,5-1,0 образцов почвы. Почву можно брать из любого места,

но почвы городских иредместей предпочтительнее , так как воздух в таких районах загр знен метаном и культура получаетс  легче. Содержимое колб перемешивают и насыщают газовой смесью, содержащей метан. После плотного закупоривани  колбы инкубируют при 30-35 С и врем  от времени встр хивают. Газова  смесь обновл етс  через каждые две недели . Признаки роста культуры по вл ютс  через 3-6 недель, когда растущую культуру

перенос т в новую среду.

Подготавливают новый комплект стерильных колб, содержащих по 50 мл стерильной среды. Исходные колбы, содержащие растущую культуру, хорошо встр хивают и из каждои колбы 2 мл суспензии перенос т в новую колбу. После перемешивани  новые «олбы инкубируют при 30-35°С после насыщени  стандартной газовой смесью. Как и прежде колбы периодически встр хивают и снова газируют

через некоторые промежутки, примерно через 2-4 недели. В это врем  растущую культуру перенос т во взбалтываемую колбу и в чашку с агаром. Дл  этого приготавливают агаровые чашки со стандартной основной средой и заражают элодией или почвенными микроорганизмами по обычному бактериологическому методу.

Эти чашки став т непокрытыми в газоплотный эксикатор с возобновл емой атмосферой. Через 2-4 недели по вл ютс  белые или желтоватые колонии. Одну или несколько таких колоний перевод т во встр хиваемую колбу. Растущую культуру примен ют дл  заражени  питательной среды дл  роста клеточного материала.

Пример . Усиление роста Pseiidomonas methanica (АТСС-21, 310) при различных питательных газах п увелнченных давлени х ноказываетс  путем сравнительных результатов, приводимых в табл. 1. Услови  ферментации:

Таблица 1

Скл нки емкостью 200 мл под давлением (№ 23187 фирмы luton Гласе К°), 100 мл ереды 377 (см. Гирш и Конти Arch. MicTobiolog 48,339-57, 1964), 1,0 мл посева дл  индукционного периода, ручна  мешалка, комнатна  температура, указанные статические давлени , выполн емые через 0,22, 46 и 65 час. Через 65 час ферментации в К льтурах 4 и 9 давление 0.

Из таблицы видно, что, .когда концентраци  растворенного кислорода менее 30 ч/млн независимо от давлени  питательного газа и отношение растворенного кислорода к углероду приблнзительно соответствует отношению потребленного кислорода к углероду, то скорость роста организма и клеточна  плотность наивысшие .

Пример 2. Эффект концентрации кислорода на рост АТСС-19, 385 при различных давлени х в скл нках показываетс  сравнительными результатами, приведенными в табл. 2.

Таблица 2

Услови ми ферментации: скл нки емкостью 200 мл (№23187 фирмы luton Гласе К°),50мл среды 691, стерилизованной автоклавированием , 2,0 мл посева дл  культур 1-5, 1,0 мл посева дл  культур 6-10, комнатна  температура , механическа  мешалка, статистическое давление питательного газа во врем  отбора образцов, питательный газ состава (в %): 35,5 СН4, 0,42 СзНб, 0,05 СзНз, 0,09 СОг, 1JO О2, 0;08 Аг, 62,2 Ng, приготовленный из сухого воздуха баллонов Матесона, технического метана и очищенного азота.

Состав среды 691 (в г/л): 3,24 К2НР04; 2,72 КНгРО ; 1,5 (NH4)9-HPO4; 0,25 MgSO4-7H2O; 0,00001 СаСЬ; 0,001 FeSO,,-7H2O.

Пример 3. В перемешиваемом бродильном чане был проведен опыт ферментации с использованием посева Candida lypolytica в дрожжевой азотистой базе (Дифко) с н. Додеканом в качестве углеродистого субстрата и воздухом. Углеродистый субстрат и воздух подавались в бродильный чан непрерывно и раздельно . Температура 30°С, начальное давление воздуха 4 фунт/дюйм (1 фунт/дюйм 0,070307 кгс/см). Когда клеточна  плотность достигла 1,0 г/л, давление воздуха было повышено до 15 фунт/дюйм когда клеточна  плотность достигла 5,0 г/л, давление воздуха было повышено до 50 фунт/дюйм н поддерживалось таким до конца.

Другой вариант описываемого способа улучшает процесс микробного превращени  углеводородов в белок клеток в новой непрерывной многоступенчатой системе ферментации. Растуща  биомасса непрерывно подвергаетс  различному давлению питательного газа в каждом бродильном чане, причем в первом чане подвергаетс  самому низшему и в последнем чане самому высокому давлению. Газы, отход щие из чана, рецир.кулируютс  в одиц или несколько чанов, имеющих меньщую клеточную плотность.

Описываемый способ по сн етс  чертежом.

Среда, содержаща  углеводороды и кислородсодержащий газ, по отдельности или смешанные непрерывно пропускаютс  через многоступенчатую систему ферментации, содержащую углеводороды, микроорганизмы и питательные вещества. В результате бродильный

чан 1 подвергаетс  самому низшему давлению питательного газа, в бродильном чане 2 давление увеличиваетс , а бродильный чан 3 подвергаетс  самому высокому давлению, и следовательно , система поддеоживаетс  в посто нных услови х ферментации. Использование питательного газа и скорость производства клеточного белка одновременно максимально увеличиваютс  в результате Здлиненного временц пребывани  субстратов и постепенно увеличивающихс  давлений у вытекающего потока , где клеточна  плотность и требование на кислород и углерод наивысщие. Свежа  или рециркулируема  питательна 

среда, питательные газы и клетки могут рециркулироватьс  в различные чаны р да и измен тьс  могут другие параметры, включа  объем и геометрию чанов, число их и скорости пропускани  свежей среды или жидких сред

в один или более чанов, состав жидкости и питательного газа.

Предмет изобретени 

Способ получени  биомассы путем выращивани  микроорганизмов в водной питательной среде, содержащей источники углерода и азота , в присутствии минеральных сол-ей при

аэрации кислородсодержащим и углеводародсодержащим газами, регулировании общего парциального давлени  кислорода и общего давлени  в питательной среде с последующим отделением микроорганизмов от питательной

среды, отличающийс  тем, что, с целью улучшени  условий выращивани , регулирование давлени  кислородсодержащего газа и углеводородсодержащего газа в водной питательной среде осуществл ют таким образом,

что оно обеспечивает весовое отношение растворенного кислорода к растворенному углероду в среде до 5-кратного по сравнению со стехиометрическим весовым отношением потребленного кислорода к потребленному углероду

при образовании биомассы, при этом производ т одновременное регулирование общего давлени  газа и общего парциального, давлени  кислорода, чтобы в среде было менее чем 30 ч/млн общего растворенного кислорода.