SU421199A3 - Способ получения биомассы - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности.

Известны способы получени  биомассы, используемой в кормовых и пищевых цел х, заключающиес  во внесении посевного материала- микроорганизмов, выбираемых из родов Pseudomonas, Bacillus и Methanomas, в водную питательную среду, культивировании посевного материала и отделении биомассы от культуральпой среды.

При этом культивирование посевного материала осуществл етс  на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые дл  роста микроограниЗМов минеральные соли. Однако такие способы не обеспечивают получение биомассы, богатой аминокислотами , протеинами и витаминами так эффективно, как предлагаемый способ.

Цель изобретени  - обогащение биомассы перечисленными веществами и более полное использование питательной среды.

Это достигаетс  тем, что источник углерода внос т в питательную среду непрерывно после достижени  оптимальной фазы развити  микроорганизмов, а в -качестве источника углерода иопользуют смесь метана с кислородом .

При этом отделение биомассы от культуральной среды осуществл ют одновременно с внесением источника углерода в питательную

среду, а часть среды подвергают рециркул ции .

В рециркулируемую культуральную среду ввод т растворы минеральных солей в концентраци х , меньших первоначально добавл емых . При этом источник азота ввод т в виде газообразного аммиака, гидрата окиси аммони  или солей аммиака.

Получение биомассы по предложенному способу осуществл ют следующим образом.

В водную питательную среду .при рП от 6 до 7,5 внос т посевной материал.

Питательна  среда содержит по меньшей Мере 0,005 г/л иона магни , 0,0025 г/л иона кальци , 0,001 г/л иона железа, а также источник азота в .виде вышеперечисленных добавок .

Засе нную питательную среду выдерживают при температуре 20-40°С.

После достижени  оптимальной фазы развити  микроорганизмов в выдержанную питательную среду при ее перемешивании непрерывно ввод т газообразную смесь из метана и кислорода.

Эта смесь -может содержать 3-97 об. % кислорода и 1-97 об. % метана.

.При этом одновременно с непрерывной подачей газообразной смеси производ т непрерывный отвод из ферментатора жидкой ереды , отделение биомассы от культуралыюй среды и рециркул цию ее части в ферментаторе.

В состав рециркулируемой среды перед лодачей ее в ферментатор ввод т растворимые соли магни  и аммони . При этом растворимые соли аммони  добавл ют в количестве, обеспечивающем суммарную концентрацию иона аммони , образуемого за счет нодачи газообразного аммиака и упом нутых растворимых солей аммони , составл ющую 0,1 - 5 г/л.

Дл  отделени  биома.ссы от культуральной среды отводимую из ферментатора жидкую среду с кислотным продуктом фильтруют с последующей его промывкой жидкостью из воды и растворов солей.

Промытую таким образом биомассу высущивают на воздухе при комнатной температуре или путем ее нагревани  до температуры, не превышающей 105°F при атмосферном или пониженном давлении.

Посевным материалом могут служить микроорганизмы , например, из АТСС 21310 рода

Pseudomonas, который способен окисл ть метан и природный нефт ной газ в составе питательной среды, содержащей только одни минеральные соли, дл  получени  биомассы с высоким содержанием аминокислот, протеинов и витаминов.

Данную культуру можно выделить в чистом виде с использованием среды, содержащей названные минеральные соли, из смешанной культуры АТСС 19385.

Микроорганизмы АТСС 21310 культивируют на различных средах, содержащих минеральные соли, источники азота и углерода.

В качестве последнего может быть метан или природный нефт ной газ в смеси с кислородом или воздухом с добавлением углекиского газа или без него.

Скорость роста АТСС 21310 равна нулю при 20 и 40°С, умеренна  при 25°С и имеет оптимальное значение при температурах 30- 38°С.

Предпочтительные составы питательных сред дл  АТСС 21310 приведены в табл. 1.

Таблица 1

Среды А-Г пригодны дл  проведени  культивировани  по периодическому методу, а среды Д-Ж дл  непрерывных процессов.

Контроль за величиной рН при непрерывном процессе осуществл ют  утем раздельного добавлени  кислоты или щелочи.

Пример 1. Дл  определени  вли ни  различных концентраций иона аммони  на концентрацию продукта микроорганизма АТСС 21310 культивируют на среде А с различными концентраци ми сульфата аммони .

Концентрацию продукта определ ют -через 166 час -при 420 Ммк три териодичеокой подаче питающей смеси газа из 56% метана и 44% кислорода.

При непрерывной подаче газова  смесь состоит ИЗ 50% метана и 50% кислорода.

При проведении 15 опытов (7 - при непрерывной Подаче газа и -8-три периодической подаче газа) в -каждом отдельном случае примен ют различную концентрацию сульфата аммони  в пределах от О до 10 г/л.

Максимальный выход АТСС 21310, а также максимальное содержание протеина в продукте установлено на средах с концентрацией сульфата аммони  в пределах 0,5-3,5 г/л.

Пример 2. Культуру микроорганизма АТСС 21310 выращивают на среде А при непрерывном перемешивании и возрастающем добавлении NaOH или (NH2)SO4 дл  поддержани  рН среды в пределах 6,0-7,5,  вл ющейс  оптимальной дл  роста данного микроорганизма. 1 г NaOH и 1 г NH4SO4 добавл ют в 50 мл среды на 140 час 0,75 г NaOH и 1 г NH4S04 в 10 мл среды - на 168 и 185 час.

Состав питающего газа: 49% метана и 52% кислорода при его подаче 87 мл/мин через барботер.

При указанных услови х, -близких к непрерывной ферментации, выход клеточного материала превышает 5 г/л.

Пример 3. Серию культур выращивают при перемешивании и комнатной температуре на среде А с различными источниками азота.

В качестве источников азота используют азотнокислый натрий, азотнокислый аммоний, гидрат окиси аммони , азот и сернокислый аммоний.

В качестве источника углерода используют газовую смесь из 40% метана, 40% кислорода и 20% азота под давлением 0,141 кг/см.

Полученные результаты показывают, что содержание нротеина у клеток тгримерно одинаково и независимо от выбранного источника азота. Ион аммони  обеспечивает более короткие промежутки времени удвоени , более высокие плотности клеточного материала и более высокую степень утилизации азота по сравнению с одним нитрат - ионом или нитрат - ионом совместно с ионом аммони .

Пример 4. Исследуют вли ние снижени  концентраций иона магни  в среде А.

Культуру АТСС 21310 получают в колбах в среде А, в которой концентрации ионов магни  были понижены до 20, 40 и 60% от суммарного содержани  редкоземельных элементо-в в обычной среде А.

В соответствии с .полученными данными выход АТСС 21310 снижаетс  при уменьшении концентрации ионов магни  более, чем на 50% против обычно содержащихс  в среде А.

Пример 5. Среду, не содержащую клеток, извлекают после каждого из одинаковых опытов по ферментации. В каждом случае анализируют на содержание элементов металлов путем атомной абсорбционной спектрометрии. Полученные данные сравнивают с соответствующими данными анализа дл  свежей среды А.

Сравнение показывает, что ион магни  постепенно поглощаетс  клетками по мере прохождени  (Процесса ферментации. Следовательно, рециркулируемую среду необходимо пополн ть ионом магни  до подачи в фер:ментатор при работе  о непрерывному методу. Другие

Культуру микроогранизма выдел ют через 640 час культивировани .

Результаты исследова«и  клеток и сравнительные данные, получаемые во врем , форментации на среде с различными источниками азота, приведены в табл. 2.

Таблица 2

ионы металлов не потребл ютс  клетками в значительной степени и добавлени  этих ионов не требуетс .

При последующих опытах удаление микроэлементов , иных чем магний, вызывает дополнительное понижение роста и выхода АТСС 21310. Удаление иона магни  приводит, в основном , к прекращению роста, что свидетельствует с важности иона .магни .

Результаты

этих опытов приведены в табл. 3 и 4.

20

Таблица 3

25

Примечание. Среда 3 представл ет собой среду А, содержащую 10 % компонентов в виде микроэлементов (CaCIj, FeSOi-THaO, MnSOi-HaO, MoOj); среда И не содержит микроэлементов; среда К не содержит микроэлементов, а также MgSO4-7HjO. Все среды готов т на дистиллированной воде.

В табл. 4 дана оценка модификаций qpeды А. Примечание. Оптическа  плотность дл  двух культур. Услови  ферментации: ферментацию провод т при комнатной температуре в 200 мл среды , состав которой приведен в табл. 3. Исходна  газова  смесь содержит, об. %; метан 40, кислород 40, азот 20. Давление поддерживают на уровне 0,281 кг/см колбы. Пример 6. Исследуют вли ние концептрадии иона магни  на рост микроорганизма. Провод т серию ооытов, при которых АТСС 21310 культивируют в модифицированной среде А, котора  содержит MgSO4-71 20 в количествах от 0,0 до 2,0 г/л среды. Услови  ферментации: комнатна  температура, 100 мл среды А с заданными концентраци ми MgSO4-7H2O; исходна  газова  смесь, содержаща , %: метан 40, кислород 40, азот 20. Давление поддерживают на уровне 0,28 КГ/СМ2. Результаты, .полученные при .проведении серии опытов, доказывают, что чем выше концентраци  MgSO4-71-120, тем интенсивнее происходит рост микроорганизмов. При этом было установлено, что вход щие в состав среды ионы кальци  или железа, используемые в виде ра.створимых солей, существенно- снижают скорость роста и выход биомассы . Ионы молибдена и марганца могут быть удалены без торможени  роста. Пример 7. Исследуют вли ние состава исходного цитающего газа на скорость роста микрооргаиизма. Опыты провод т ;по выращива нию АТСС 21310 с использованием исходной газовой смеси следующего состава, %: Опыт 1 метан 3, кислород 97. О.ПЫТ 2 метан 40, кислород 40. Опыт 3 метан 97, азот 20, кислород 40. Ферментацию провод т в колбах по 1000мл при комнатной темлературе в 500 мл среды А. Исходный газ подают под давлением 0,281 кг/см2. Повторное заполнение колб газом провод т ежедневно.

Таблица 4 определ етс  дл  каждой переменной величины и  вл етс  средней При приведенных выше периодических услови х проведени  опытов установлено, что при оодаче газовой смеси, содержащей 97 об. % кислорода, роста по существу не наблюдаетс . При исходной газовой смеси, содержащей 97 об. % метана отмечаетс  лишь умеренный рост. Исходна  смесь, содержаща  равные объемы метана и кислорода  вственно способствует повышенным скорост м роста. При этом установлено, что предпочтительные составы газовой смеси, способствующие более высоким скорост м роста, соответствуют примерно стехиометрическим количествам растворенных в жидкой среде метана и кислорода. Могут примен тьс  смеси, содержащие не менее 3 об. % кислорода и не более 97 об. % кислорода . Пример 8. Этот пример иллюстрирует случай рециркул ции культуральной среды, извлекаемой из ферментатора. Перемещиваемую культуру Methonomonas methanica, выращенную в среде В, выдерживают при 25°С и непрерывной подаче газовой смеси, состо щей из природного нефт ного газа и воздуха в соотношении 20 : 80. В логарифмической фазе выращивани  культуру выдерживают до тех пор, пока плотность клеточного материала не достигает 1,0 г/л. После этого среду извлекают и биомассу отдел ют фильтрованием и центрифугированием. Затем регенерированную среду возвращают в ферментатор, где ее повторно засевают дозой отделенного клеточного материала. Концентраци  MgSO4-7H2O, (NH4)2SO4 в регенерированной среде, направленной в ферментатор, поддерживают на уровне 1,00 и 1,50 г/л путем периодического внесени  в нее соответствующих добавок. Биомасса микроорганизма АТСС 21310 по ее питательной ценности нрибл.ижаетс  к соевой рыбной муке. Сравнительный аминокислотный состав протеина , полученного из метана, а также из соевой и рЫбной муки приведен в табл. 5. Таблица 5 По разности; Отдельные определени . Предмет изо бретени  1. Способ получени  биомассы, используемой в кормовых и пищевых цел х, путем впе5 10 15 20 25 30 севи  посевного материала из родов Pseudomonas Bacillus, Methanomas в водную питательную среду, содержащую источники углерода , азота и необходимые дл  роста микроорганизмов минеральные соли, культивировани  .посевного материала и отделени  биомассы от культуральной среды, о т л .и ч а ю щ и йс   тем, что, с целью обогащени  биомассы аминокислотами, протеинами и витаминами и более полного использовани  среды, внесение источника углерода осуществл ют непрерывно с наступлением оптимальной фазы развити  микроорганизмов, использу  в качестве источника углерода смесь метана с кислородом , при этом одновременно с внесением его в питательную среду осуществл ют отделение биомассы от культуральной среды, отвод последней и рециркул цию ее части в процессе выращивани . 2. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что питательную среду перед введением в нее источника углерода выдерживают При 20- 40°С и рН 6,0-7,5. 3.Способ .по пп. 1 и 2, отличающийс  тем, что источник азота ввод т в .виде газообразного аммиака, гидрата окиси аммони  или солей аммони . 4.Способ по пп. 1-3, отличающийс  тем, что в рециркулируемую среду ввод т необходимые минеральные соли в концентраци х , меньщих первоначально добавл емых солей, ввод  необходимые их растворы.