JPS583678B2 - Ｌ−トリプトフアンの連続醗酵製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−トリプトファンの連続醗酵製造方法に関す
る。

従来、トリプトファンの製造方法として、これらの物質
に植物蛋白のアミノ酸の栄養強化用により広い用途を与
えようとする場合に要求されるような低価格でこれらの
物質を得ることを可能にする化学的な合成法は見出され
ていない。

しかしながら、多数の方法がこれまで知られており、こ
れらは種々の酵母およびバクテリアを包含する醗酵的製
造法として報告されている。

これらの方法の多くのものは、インドールを前駆体とし
て使用している。

これらの方法は、原則として、酵母抽出物肉エキス、コ
ーンスチープリカーを含有する通常の醗酵基質または他
のいずれかの複合栄養培地上に基いたバッチ式プロセス
である。

トリプトファンの連続的製造方法が従来検討されなかっ
たということは生産されたトリプトファンの分解に相当
な問題があったためと考えられる。

更に連続培養中に培養物は望ましくない変異株を生成す
るという大なる危険性に直面していることになる。

しかしながら、連続法は経済的ならびに技術的観点から
は多くの利点を有している。

本発明は、Ｌ−トリプトファンを食品や飼料の添加物と
して使用しうるような安い価格で提供するという利点を
有する連続法を可能ならしめたものである。

本発明の方法は、種々の土壌試料からの６００を超えた
微生物のスクリーニングを行い得られた、カンジダ・フ
ミコラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｈｕｍｉｃｏｌａ）の単離株
を使用することに基いている。

この単離菌は検索されており、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｂｕｒ
ｅａｕ Ｖｏｏｒ ＳｃｈｉｍｍｅｌＣｕｌｔｕｒｅｓ
にＪ ＩＡ ＣＨ ＸＩＩ （ＣＢＳ ６４３４）の番
号で寄託（ブダペスト条約に基づく寄託）されている。

カンジダ・フミコラにより有利に製造しうるトリプトフ
ァンは、次の式 を有している。

このものは製薬工業に非常に興味あるものであり、市場
では非常に高い価格を有している。

本発明による上述のトリプトファンの製造方法は、連続
的に供給されるサイアミン含有栄養基質中で、別に連続
的にインドールの供給を行いつつ、好気的条件下にカン
ジダ・フミコラＣＢＳ ６４３４株を培養することを実
質的な特徴としている。

使用された徴生物は、インドールからの非常に高いＬ−
トリプトファンの生産性を特徴としている。

この徴生物は培養液中のインドール濃度が高過ぎるとそ
の濃度には敏感なので、前記の前駆体（インドール）は
一時にではなしに連続的に供給しなくてはならない。

前記の徴生物は、完全に定義された基質上で培養するこ
とができる。

そしてその生育には炭水化物およびサイアミンの他には
、何ら他の有機物質を要求しない。

カンジダ・フミコラのこの単離菌は、トリプトファンピ
ロラーゼ活性により開始されるトリプトファン分解を含
めて部分的に働くトリプトファン代謝を有している。

しかしながら、前記の分解は培養条件および基質組成を
変化させることにより、トリプトファン収量の低下が起
らないように調整（制御）することができる。

この点この菌株は野生株タイプに関係しているという事
実の故に、何ら不活性の変異株を生ずることなしに連続
培養において非常に長期間培養することができる。

トリプトファン分解を生じない変異株の生成を促進する
ためにナイアシンを基質１ｌ当り約０．０５〜０．５ｇ
の濃度でその基質に加えることができる。

供給されたインドールは細胞壁を通ってもちこまれ、細
胞内酵素系によりトリプトファンに変換され、このもの
はその大部分が再び外に運び出される。

遊離インドールの濃度が比較的低いと細胞の成長速度は
減少するであろう。

しかしながら、インドールのトリプトファンへの変換は
非常に速やかに起り、例えば基質供給に関して０．５％
（Ｗ／Ｖ）のインドール供給は醗酵液中では微量の遊離
インドールを与えることになる。

非常に多量の遊離インドールが細胞内にあるので醗酵器
中の細胞含有基質についてインドールを評価することが
重要である。

インドールのトリプトファンへの変換速度およびトリプ
トファンのキスレニンを経ての分解に最大の影響を有す
ると考えられる事項は、生物学的に利用しうる鉄例えば
クエン酸第一鉄の形の鉄の濃度である。

培養液中の鉄（Ｆｅ２＋）濃度はトリプトファンの分解
を生ずる含量よりは低くなければならない。

しかし培養物の生育に甚だしく不利であり従って連続培
養を不可能にするような含量よりは高くなくてはならな
い。

醗酵液中での生物学的に利用しうる酸素の含量もトリプ
トファンの分解速度に関して明らかに重要である。

その理由は、トリプトファンピロラーゼはヘム基を含有
する酵素であり、従ってトリプトファンの分解は酸化過
程だからである。

酸素ガス供給（通気）が低い場合は、培養液中にやや高
いＦｅ２＋含量を保つことが可能であるが、一方、酸素
ガス供給がより高い場合にはＦｅ２＋含量は低くあるべ
きである。

これらの知見は変異していないカンジダ・フミコラに対
して有効である。

長時間連続的に培養している間には、トリプトファンの
分解を生じない変異株が一般的培養条件〔基質の組成（
主としてナイアシン）、インドール供給〕の故に生成す
るかもしれない。

この場合Ｆｅ２＋の濃度は、勿論分解には重要ではなく
、これをかなり高いレベルに保つことができる。

従って、通常高いＦｅ２＋含量を有する糖蜜も炭素源と
して使用することができる。

醗酵器中へのインドール供給が微生物の生育を停止させ
るような高い残留インドール値を与えないように過程を
制御するために、多数の分析が行われる。

滴定頻度および酸素飽和レベルは、好気的代謝が嫌気的
代謝に変るという事実の故に残留インドール含量が増加
すると甚だしく増加する。

これらの値は追跡されクエン酸第一鉄の供給および通気
量の制御に対して使用することができる。

細胞の体積も追跡されるが、この場合はその変化は非常
に遅いのでこれらをこの方法の制御に対して使用するこ
とはできない。

残留インドールの分析は、メタノールに溶解したｏ−ニ
トロフエニルエタノールを内部標準として使用するガス
クロマトグラフィーにより醗酵器内容物についてそれを
分離することなしに行う。

セル・フリーの醗酵液は価値あるデータを与えない。

その理由は、インドールは非常に速やかに細胞により吸
着されるからである。

過度に高い残留インドール含量は、インドール供給速度
の減少および／または鉄供給の増加および／または通気
量の増加をなすための制御シグナルとして使用すること
ができる。

トリプトファン生産が過度の鉄供給により妨害されない
ように制御するためには、ＵＶコードを備えたデキスト
ランゲルカラム（セファデツクス■）上で連続的に分析
を行いその後でトリプトファンフラクションのＵＶ分析
を別に行なう。

これらの分析はトリプトファンの代謝物質が主としてキ
ヌレン酸であることを示している。

本発明者は使用した株のトリプトファン合成能力がフィ
ードバック阻害により制約されないことも見出した。

すなわち、前記の培養は、合成速度を変えることなく、
約１５ｇ／ｌのトリプトファンまで耐えられる。

上記の方法タイプの生産を制限する一つの特徴的事項は
、前記の微生物のセリン産生能である。

試験によると、セリンが供給される場合には、この株の
インドール消費が一時的に非常に増加することが証明さ
れた。

セリンは基質成分として使用するには高価すぎる物質で
あるから、グリシン添加の効果が研究され、そして前記
の系においてはグリシンがセリンと同じ効果を有してい
ることが見出された。

ただしこの効果は約２時間後に現われてくる。

約１〜１０ｇ／ｌのグリシン添加を使用すればより大な
るインドール供給速度を保持することができる。

産生されたトリプトファンの単離精製のためには、比較
的に細胞のない醗酵液についてはイオン交換法が使用さ
れた。

このイオン交換マトリックスは低い度合の交叉結合を有
しており、すなわちいわゆる巨大網状（ｍａｃｒｏ−ｒ
ｅｔｉｃｕｌａｒ）タイプのものであった。

使用された流れは、毎時０．１床容積（ＢＶ）であった
。

洗浄は蒸留水で行われ、溶出は５０％エタノールおよび
５０％１規定アンモニアを逆洗浄で使用することにより
行われた。

このようにして得られたトリプトファン溶液ＨＣｌで中
和し、トリプトファン結晶を得た。

収量は約９５％であった。

この得られた生成物は、Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓを使用し
た試験によれば１００％の生物学的活性を有していた。

エールリツヒおよびニンヒドリン試験陽性の混入物は存
在しなかった。

以下の実施例により本発明を説明するが、これらの実施
例は本発明を限定するものではない。

例１ 本例は低いインドール供給および高い鉄含量の場合の例
である。

醗酵器は機械的消泡機を備えたケマップ （Ｃｈｅｍａｐ）ＧＦ００１４を旋回数２０００ｒ／分
において使用した。

基質速度は２００ｍｌ／ｈであり、総体積は４．８ｌ、
従って希釈速度は４．１％であった。

醗酵温度は＋２６℃とした。基質は次の組成を有する。

インドール １ｇｐ−アミノ
安息香酸（ＰＡＢＡ） ０．１ｇ酵母抽出物
２５ｇ溶液Ａ（３％ＣａＣｌ２
２Ｈ２Ｃ） ２００ｍｌ溶液Ｂ（１０％ ＫＨ２Ｐ
Ｏ４） ２００ｍｌ溶液Ｃ（５％ ＭｇＳＯ４
・２Ｈ２Ｃ、 ２００ｍｌ０．１２５％クエン酸鉄、 ０．０１５％ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、 ０．０２％ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、 １０％ＮａＣｌ） グルコース１Ｋｇを別個にオートクレープにかけた。

蒸留水 １０ｌとする量ｐＨ
５．５通気量は培地１ｌ
当り８０ｌ／時とした。

菌接種はロータリー・シェーカー上に成育させたカンジ
ダ・フミコラＣＢＳ ６４３４の２４時間培養物約５０
ｍｌを使用して行った。

培養の間のｐＨは、約６．５に保たれ、滴定はＮＨ３を
使って行った。

培養物を２４時間生育させ、次いで基質およびインドー
ルをポンプにより入れ始めた。

インドール供給速度は、基質のそれの０．１４％（Ｗ／
Ｖ）であった。

このクエン酸鉄含有量すなわち２４ｍｇ／ｌにおいては
、秀れた速度のインドール変換が得られ、残留インドー
ルはみられなかった。

前記のトリプトファンの生産は生成したトリプトファン
が特にキヌレン酸に分解するという事実の故に、全く見
出されない。

例２ 本例は低いインドール含量および低いＦｅ含量の場合を
示すものである。

例１と同じ条件を使用するがただし基質は次の組成を有
する。

ＮＨ４Ｃｌ ５０ｇナイアシ
ン ０．５ｇクエン酸鉄
１０ｍｇサイアミン
５０ｍｇ溶液Ｋ （０．０６８ｇモリブデン酸ア
ン １０ｍｌモン、０．３４ｇ ＣｕＳＯ４） 溶液Ａ （０．７５％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ） １０
０ｍｌ溶液Ｂｆ （８％ ＫＨ２ＰＯ４、２．５６％
２００ｍｌＫ２ＨＰＯ４） 溶液Ｂｋ （１０％ＫＨ２ＰＯ４） ２００ｍ
ｌ溶液Ｃ （７．８８％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２
００ｍｌ０．１１％ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、 ０．０２％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、 １０％ ＮａＣｌ） 蔗糖 １Ｋｇ蒸留水
全量１０ｌとする量接種、ｐＨおよび
培養は例１のとおりであった。

インドルール供給速度は、基質供給から計算して、０．
２６５％であった。

培養中のトリプトファン産生は２４時間に３．６ｇ／ｌ
（収率７８％）であった。

分解はみられなかった。例３ 本例は高いインドール含量およびクエン酸鉄のバッチ法
による供給を例示するものである。

条件は例１の通りであり、基質は例２の通りであり、接
種は例１の通りであり、ｐＨは例１の通りであり、そし
て培養は例１の通りであった。

インドール供給は基質供給の０．５３％（Ｗ／Ｖ）であ
った。

培養の間のトリプトファン産生は平均２４時間で６．８
ｇ／ｌ（収率７４％）であった。

Ｆｅの供給は残留インドール含量が増加するごとに行わ
れた。

各回に供給されたＦｅ２＋の量は基質のそれに相当する
Ｆｅ含量を与えた。

例４ 本例は連続的なクエン酸鉄供給を例示するものである。

条件は例１の通りとし、基質は例１の通りとし、接種は
例１の通りのとし、そしてｐＨは例１の通りとした。

例１の通りに培養を行うがただし通気量は培地１ｌ当り
１０ｌ／時であった。

この実験の間の鉄供給は基質中の鉄濃度を約２ｐｐｍ（
１／１００００００）にするようなものであった。

インドール供給は基質供給の０．４％であった。

培養中のトリプトファン産生は平均２４時間５．９ｇ／
ｌ（収率８０．５％）であった。

培養が安定化した場合には分解はみられなかった。

例５ 本例はグリシンの影響を示すものである。

条件は例１の通りとする。

基質も例１の通りとするがただしＦｅ２＋は２ｐｐｍで
あり、１５ｇグリシン／１０ｌを加えた。

接種は例１の通りであり、ｐＨは例１の通りであり、そ
して培養は例１の通りとした。

通気量は培地１ｌ当り約１０ｌ／時とした。

この実験の間のインドール供給は基質供給の０．８％で
あった。

トリプトファンの産生は２４時間で１０．４ｇ／ｌ（収
率７５％）であった。

全培養時間の間、非常に低い残留インドールレベルが得
られた。

トリプトファンの分解は非常に低い水準に保たれていた
。

このことはわずか０．２ｇのキヌレン酸しか生成しなか
ったという事実によりわかる。

本発明は勿論、上記実施例中に列記された条件に限定さ
れるものではなく、本発明の範囲内で種種の変形を行う
ことができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 好気的条件下に、連続的に栄養基質を供給しつつ、
   そして別個にインドールを連続的に供給し、カンジダ・
   フミコラＣＢＳ６４３４菌株を培養することを特徴とす
   る、Ｌ−トリプトファンの連続醗酵製造法。