DE2305268A1 - Verfahren zur kontinuierlichen fermentativen herstellung von l-tryptophan und derivaten desselben - Google Patents
Verfahren zur kontinuierlichen fermentativen herstellung von l-tryptophan und derivaten desselbenInfo
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MÖNCHEN
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HAMBURG MÖNCHEN
8 MÖNCHEN 26 POSTFACH 37 LIEBHERRSTR. 20
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MÜNCHEN
AB B ο f. ο r s
S-690 2o Bofors, Schweden
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Verfahren zur kontinuierlichen fermentativem Herstellung von L-Tryptophan und Derivaten desselben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen fermentativen Herstellung von L-Tryptophan und Derivaten
desselben.
Chemische Synthesen als Herstellungsverfahren für Tryptophan und Derivate desselben haben sich bisher nicht als
möglicher Weg zur Herstellung von Tryptophan zu solchen niedrigen Preisen erwiesen, welche für den Fall zu fordern
sind, daß die Verbindung zur Anreicherung von pflanzlichen
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Proteinen mit Aminosäuren breitere Verwendung finden soll.
Es sind jedoch zahlreiche Verfahren bekannt geworden,
die die fermentative Herstellung unter Verwendung verschiedener Hefen und Bakterien betreffen. Die meisten dieser
Verfahren verwenden Indol als Vorläufer. Die Verfahren
stellen in der Regel partienweise bzw. diskontinuierliche Herstellungsweisen dar, welche auf normalen fermentativen
Substraten basieren. Diese Substrate enthalten Hefeextrakt, Fleischextrakt, beim Einweichen von Mais erhaltene
Flüssigkeiten (corn steep liquor) oder irgend ein anderes komplexes Nährmedium.
Als Ursache für die Tatsache, daß kontinuierliche Verfahren zur Herstellung von Tryptophan und Derivaten desselben
bisher nicht in Erwägung gezogen bzw. diskutiert wurden, könnten die erheblichen Probleme bezüglich des
Abbaues des hergestellten Tryptophans gelten. Weiterhin wird die Kultur während der kontinuierlichen !Cultivation
großen Gefahren bezüglich der Bildung unerwünschter Mutanten ausgesetzt. Ein kontinuierliches Verfahren
bietet jedoch unter ökonomischen und technischen Gesichtspunkten zahlreiche Vorteile.
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Die vorliegende Erfindung ermöglicht nun die Durchführung eines kontinuierlichen Verfahrens, welches den
Vorteil "bietet, daß L-Tryptophan oder ein Derivat desselben mit so niedrigen Kosten erhalten werden können,
daß sie als Zusätze für Nahrungs- und Futtermittel verwendbar sind.
,Das Verfahren der Erfindung beruht auf der Verwendung
einer isolierten Form (isolate) von Candida humicola, die bei der systematischen Untersuchung (screening) von mehr
als 600 Organismen aus verschiedenen Bodenproben erhalten wurde. r Die isolierte Form ist diagnostiziert und ist
beim Gentraal Bureau voor Schimmelcultures unter der
Nummer J IA CH XII (CBS 6434) hinterlegt.
Die Tryptophanderivate, die mittels Candida humicola
vorteilhafterweise hergestellt werden können, weisen die folgende allgemeine Formel auf:
in der E aus der Gruppe Wasserstoff, Hydroxy, Halogen,
niederes Alkyl und niederes Alkoxy ausgewählt sein kann. Viele dieser Derivate sind von großem Interesse für die
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pharmazeutische Industrie und befinden sich zu sehr hohen Preisen auf dem Markt.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung der oben genannten Derivate des Tryptophane ist im
wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Candida Mumicola unter aeroben Bedingungen
in einem kontinuierlich zugeführten Nährsubstrat unter getrennter kontinuierlicher Zufuhr des entsprechenden
Indolderivates kultiviert.
Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus ist
durch eine sehr hohe Produktionsleistung von L-Tryptophan
aus Indol gekennzeichnet. Da der Mikroorganismus gegenüber
einer zu hohen Indolkonzentration in der Kulturflüssigkeit empfindlich ist, muß die Zufuhr des Vorläufers
kontinuierlich erfolgen. Der Mikroorganismus kann auf einem vollständig definierten Substrat kultiviert
werden und benötigt für sein Wachstum außer Kohlehydraten und Thiamin keinerlei andere organische Stoffe.
Die isolierte Form von Candida humicola weist einen teilweise arbeitenden Tryptophanmetabolismus auf, welcher
einen durch die Aktivität von Tryptopnanpyrolase in Gang gesetzten Tryptophanabbau einschließt. Durch Veränderung
der Kultivationsbedingungen und der Zusammen-
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Setzung des Substrates kann der Abbau jedoch angepaßt
bzw. gesteuert werden, so daß keine Verminderung der Tryptophanausbeute festgestellt werden kann.
Infolge der Tatsache, daß der Stamm in dieser Beziehung mit wilden Typen verbunden ist, kann er während sehr
langer Zeiträume in kontinuierlichen Kulturen kultiviert werden, ohne daß irgend welche negativen Mutanten
erhalten werden.
Um die Bildung von Mutanten zu stimulieren, die keinen Tryptophanabbau ergeben, kann man dem Substrat Niacin
in Konzentrationen von O,o5 bis 0,5 g/l Substrat zusetzen.
Die zugeführte Indolmenge wird durch das Wandsystem der Zelle eingebracht und durch intrazelluläre Enzymsysteme
in Tryptophan umgewandelt. Dieser Vorgang erfolgt offensichtlich in überwiegendem Maße.
Vergleichsweise niedrige Konzentrationen an freiem Indol können die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen
verringern. Die Umwandlung des Indols zu Tryptophan verläuft Jedoch sehr rasch und eine Zufuhr von z.B.
0*5$ (Gewicht/Volumen) Indol in Bezug auf die Substratzufuhr
führt zu kleinen Mengen an freiem Indol in der
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Flüssigkeit des Fermentierungstanks. 1Es ist wichtig,
daß man das Indol in dem Förmentierungstank in Bezug
auf das die Zellen enthaltende Substrat vorausbestimmt bzw. abschätzt, da eine sehr große Menge des freien
Indols sich in den Zellen befindet.
Das Merkmal bzw. der Faktor, der den größten Einfluß auf die Konversionsgeschwindigkeit des Indols zu
Tryptophan und auf den Abbau des Tryptophane über das Kynurenin zu haben scheint, ist die Konzentration an
biologisch verfügbarem Eisen, z.B. in Form von Eisen (il)citrat. Die Konzentration an Eisen (Fe +) in der
Külturflüssigkeit muß unterhalb desjenigen Gehaltes liegen, der einen Abbau des Tryptophane ergibt, sie muß
jedoch oberhalb des Gehaltes liegen, bei dem das Wachstum der Kultur erheblich gestört und somit eine kontinuierliche
Kultur unmöglich wird.
Die Gehalte an biologisch verfügbaren Sauerstoff in der Flüssigkeit des Fermentierungstanks ist offensichtlich
auch für die Abbaugeschwindigkeit des Tryptophane wichtig, da Tryptophanpyrolase ein Enzym ist,
das eine Häm-Gruppe enthält und der Tryptophanabbau
somit ein oxidativer Prozeß ist.
Bei niedriger Zufuhr an gasförmigem Sauerstoff
2+ (Aeration) ist es möglich, einen etwas höheren Fe
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Gehalt in der Kulturflüssigkeit einzuhalten, während
2+
der Fe -Gehalt bei einer höheren Zufuhr von gasförmigem Sauerstoff niedrig sein sollte.
Diese Beobachtungen gelten für nicht mutierte Candida humicöla.
Während der kontinuierlichen Kultivierung für einen längeren Zeitraum können Mutanten gebildet werden, die
Tryptophan nicht abbauen, und zwar infolge von allgemeinen Kulturbedingungen (die Zusammensetzung des
Substrats (hauptsächlich Niacin), die Indolzufuhr).
P+
In diesem Falle ist die Fe -Konzentration natürlich für den Abbau ohne Bedeutung und kann bei einem erheblich höheren Betrag gehalten werden. Daher kann Melasse als Kohlenstoffquelle verwendet werden, die normaler-
In diesem Falle ist die Fe -Konzentration natürlich für den Abbau ohne Bedeutung und kann bei einem erheblich höheren Betrag gehalten werden. Daher kann Melasse als Kohlenstoffquelle verwendet werden, die normaler-
2+
weise einen hohen Fe -Gehalt aufweist.
weise einen hohen Fe -Gehalt aufweist.
Um das Verfahren so zu steuern, daß die Indolzufuhr keine hohen Beträge an übrig bleibendem Indol in den
Gehalten des Fermentierungstanks ergibt, wodurch das Wachstum aufhören würde, werden eine Anzahl von Analysen
durchgeführt. Die Häufigkeit der Titration und der Spiegel der Sauerstoffsättigung steigt bei zunehmendem
Gehalt an zurückbleibendem Indol stark an, und zwar weil der aerobische Metabolismus in einen anaerobischen
309832/ 1 177
umgewandelt wird. Diese Werte werden verfolgt und können zur Steuerung der Zufuhr von Eisen (II) citrat
oder der Belüftung (Aeration) verwendet werden. Das Zellenvolumen wird auch verfolgt, wobei jedoch die
Veränderungen so langsam sind, daß sie nicht zur Steuerung des Verfahrens verwendet werden können.
Die Analysen auf zurückbleibendes Indol werden an
nicht aufgetrenntem Inhalt des Fermentierungstanks gaschromatisch durchgeführt, wobei im Metanol gelöstes
o-Nitrophenyläthanol als interner Standard dient. Analysen
an zellfreier Flüssigkeit des Fermentierungstanks ergeben keine brauchbare Information, weil das Indol
so schnell von der Zelle absorbiert wird. Zu hohe Gehalte an zurückbleibendem Indol können auch als Steuersignal
verwendet werden, um die Zufuhrgeschwindigkeit des Indols zu verringern und/oder die Eisenzufuhr und/
oder die Aeration zu steigern.
Um das Verfahren so zu steuern, daß die Tryptophanbildung
nicht durch eine zu hohe Eisenzufuhr gestört wird, werden kontinuierliche Analysen an einer Dextrangel-Säule
(Sephadex ' unter Verwendung eines UV-Spektographen (UV cord) durchgeführt, woran sich eine
getrennte UV-Analyse der Try/ptophanfraktiönen. anschließt.
309832/1177
Diese Analysen sind ein gutes Anzeichen für Metaboliten
des Tryptophane, insbesondere für Kynureninsäure. Es wurde auch gefunden, daß das Leistungsvermögen des verwendeten
Stammes bei der Tryptophansynthese nicht durch Feed-Back-Inhibierung begrenzt wird. Die Kultur erträgt
somit bis zu etwa I5 g/l Tryptophan ohne Änderung der Synthesegeschwindigkeit.
Ein die Durchführung des beschriebenen Verfahrenstyps
beschränkendes Merkmal 1st die Fähigkeit der Mikroorganismen zur Verarbeitung von Serin (serine production).
Versuche haben gezeigt, daß der Indolverbrauch des Stammes augenblicklich und erheblich ansteigt, wenn
Serin zugefügt wird.
Da Serin für die Verwendung als Substrat-Komponente eine zu teure Substanz ist, wurde die Wirkung einer
Glycinzufuhr untersucht. Es wurde gefunden, daß Glycin den gleichen Effekt wie Serin auf das System ausübt.
Dieser Effekt stellt sich jedoch lediglieh nach einer Anzahl von Stunden ein. Eine größere Zufuhrgeschwindigkeit
an Indol kann bei einer Glycinzufuhr von etwa 1 bis Io g/l eingehalten werden.
Für die Isolierung und Reinigung des hergestellten Tryptophans wurde ein Ionenaustauschverfahren an einer
■v.
309832/1177
vergleichsweise zellfreien Gärungstanksflüssigkeit
verwendet. Die Matrix des Ionenaustauschers wies einen
niedrigen Vernetzungsgrad auf oder bestand aus einer sogenannten nakro-retukulären Type. Die verwendete
Fließgeschwindigkeit betrug 0,1 Bett-Volumen (BV) pro Stunde. Das Waschen wurde mit destilliertem Wasser
und die Eluierung mit 5o$ Äthanol und 5ö$ 1-n Ammoniak
unter Rückwärtswaschen durchgeführt. Die so erhaltene
Tryptophanlösung wurde mit Salzsäure neutralisiert,
wobei man Tryptophankristalle erhielt. Die Ausbeute betrug etwa
Das Produkt wies, so wie es erhalten wurde, nach einem Test mit S. Feealis loo % biologische Aktivität
auf. Es waren keine Verunreinigungen zugegen, die in
den Ehrlich- und Ninhydrin-Tests positiv sind.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläute rung der Erfindung.
Beispiel 1
Niedrige Indolzufuhr und hoher Eisengehalt.
Gärungstank: Chemap GF 0014- mit mechanischem Schaumdämpfer
(foam quencher).
-Ig-
309832/1 177
Zahl der Umdrehungen Substratgeschwindigkeit
Volumen Verdünnungsgeschwindigkeit Temperatur
U/min. 2oo ml/h 4,8 1 4,1 * 26°C
Substrat:
Lösung A: Lösung B: Lösung C:
Indol 1 g
p-Aminobenzoesäure (PABA) O1I g
Hefeextrakt 25 g
Lösung A 2oo ml
Lösung B 2oo ml
Lösung C 2oo ml
Glucose 1 kg getrennt sterilisiert
destilliertes Wasser, ad Io 1
5,5
J5 % -CaCl22H20
Io %
5 %
0,125 % Fe-Citrat
0,015. # MnSO1^H2O
Io % NaGl
Aeration: 80 l/h und 1 Kultur.
Die Inokulation wurde mit etwa 50 ml einer 24-rStunden
alten Candida humicola-Kultur vorgenommen, die auf einem
- 11 -
309832/ 1
Rotationsschüttler gezüchtet worden war. Der pH-Wert
wa-4hrend der Kultivierung wurde bei etwa 6,5 gehalten
und die Titration wurde mit Ammoniak vorgenommen. Man ließ die Kultur 24 Stunden lang wachsen. Dann
Wurde mit dem Einpumpen des Substrats und des Indols begonnen. Die Geschwindigkeit der Indolzufuhr betrug
Ο,15 % (Gewicht/Volumen) derjenigen des Substrats.
Bei diesem Gehalt an Fe-(II)eitrat 24 mg/1 wurde
eine befriedigende Geschwindigkeit des Indols erhalten. Kein zurückbleibendes Indol konnte festgestellt werden.
Es trat überhaupt keine Tryptophanbildung auf infolge der Tatsache, daß das gebildete Tryptophan augenblicklich
unter anderem zu Kynureninsäure abgebaut wurde.
Beispiel 2
Niedrige Indol- und niedrige Eisengehalte.
Es wurden die gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 verwendet, wobei jedoch das Substrat die folgende Zusammensetzung
aufwies:
- 12 -
309832/1 177
| NH4Cl | 5o | g |
| Niacin | o, | 5 g |
| Pe-Citrat | Io | mg |
| Thiamin | 5o | mg |
| Lösung K | Io | ml |
| Lösung A | loo | ml |
| Lösung Bf | 2oo | ml |
| Lösung Bk | 2oo | ml |
| Lösung C | 2oo | ml |
| Saccharose | 1 | kg |
Destilliertes Wasser ad Io
Lösung A: 0,75 % Lösung Bf: 8 % KH2PO4
2,56 %
Lösung Bk: Io % KH2PO4
Lösung C: 7,88 % MgS047H20
0,11 % MnSO4H2O
0,02 % ZnSO47H2O
10 % NaCl Lösung K: 0,o68 g Ammoniummolybdat
0,3* g CuSO4
Die Inokulation, die Einhaltung des pH-Wertes und die
Kultivierung erfolgte wie in Beispiel
Die Geschwindigkeit der Indolzufuhr betrug 0,265 %»
berechnet auf Basis der Substratzufuhr. Die Tryptophan-
- 15 309832/1177
bildung während der Kultivierung betrug 3,6 g/l in 24 Stunden (Ausbeute 78$). Es konnte kein Abbau festgestellt
werden.
Hohe Indolgehalte und chargenweise Zufuhr an Fe(II)eitrat.
Bedingungen wie in Beispiel 1
.Substrat wie in Beispiel 2
Inokulierung wie in Beispiel 1 . . pH-Wert wie in Beispiel 1
.Substrat wie in Beispiel 2
Inokulierung wie in Beispiel 1 . . pH-Wert wie in Beispiel 1
Kultivierung wie in Beispiel 1.
Die Indolzufuhr betrug 0,53$ (Gewicht/Volumen) der
Substratzufuhr. Die Tryptophanbildung während der Kultivierung betrug durchschnittlich 6,8 g/l in
24 Stunden (Ausbeute 74$). Eisen wurde bei jeder Zunahme
des Gehalts an zurückbleibendem Indol zugesetzt.
2+ Die Menge des jeweils zugesetzten Pe ergab einen
Eisengehalt t der dem des Substrats entsprach,
Beispiel 4
Kontinuierliche Zufuhr des Fe(Il)citrats
Bedingungen wie in Beispiel 1 Substrat wie in Beispiel 1
- 14 -309832/1177
Inokulierung wie in Beispiel 1
pH-Wert wie in Beispiel 1.
Die Kultivierung erfolgte wie in Beispiel 1, wobei jedoch die Aeration Io 1 pro Stunde und Liter der
Kultur betrug.
Die Eisenzufuhr während dieses Versuches war dergestalt, daß die Eisenkonzentration in dem Substrat etwa 2 ppm
betrug. Die Indolzufuhr betrug 0,4 % der Substratzufuhr. Die Tryptophanbildung während der Kultivierung
betrug durchschnittlich 5,9 g/l und 24 Stunden. (Ausbeute 8ö,5$). Es konnte kein Abbau festgestellt werden,
wenn die Kultivierung stabilisiert worden war,
Beispiel 5
Einfluß von Glycin.
Einfluß von Glycin.
Bedingungen wie in Beispiel 1 Substrat wie in Beispiel 1, wobei jedoch die Fe+-
Konzentration 2 ppm beträgt und 15 g Glycin / Io zugesetzt werden.
Inokulierung wie in Beispiel 1 pH-Wert wie in Beispiel 1
Kultivierung wie in Beispiel 1 Aeration etwa Io l/Stunde und Liter der Kultur.
- 15 3 0 9 8 3 2/1177
Die Indolzufuhr während dieses Versuches-betrug
0,8 % der Substratzufuhr. Die Tryptophanbildung betrug lo,4 g/l und 24 Stunden (Ausbeute 75 %)· Es wurde
während der gesamten Kultivierungszeit ein sehr niedriger Spiegel an zurückbleibendem Indol erhalten. Der
Tryptophanabbau hielt sich bei einem sehr niedrigen Niveau. Dies ergab sich aus der Tatsache, daß lediglich
0,2 g Kynureninsäure gebildet wurden.
- 10 -
309832/ 1177
Claims (4)
- Patentansprüche\ 1. Verfahren zur kontinuierlichen fermentation Herstellung von Derivaten des L-Tryptophans der allgemeinen FormelGH . NH2 OOOHin der R aus der Gruppe Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Alkyl und Alkoxy ausgewählt ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Candida humicola unter aeroben Bedingungen in einem kontinuierlich zugeführten Nährsubstrat bei getrennter kontinuierlicher Zufuhr eines entsprechenden Indolderivats der allgemeinen Formelin welcher R wie oben definiert ist, kultiviert.- 17 -309832/1177
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennzei ohne t, daß man ein Nährsubstrat verwendet, welches mindestens Thiamln und Kohlehydrate als. organische Substanzen enthält.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch.· g ekennzeichnet, daß man der Nährsubstanz Niacin zusetzt.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet,, daß man dem Nährsubstrat Glycin zusetzt.- 18 -309832/1177
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