DE3500054A1

DE3500054A1 - Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin

Info

Publication number: DE3500054A1
Application number: DE19853500054
Authority: DE
Inventors: James Frederick Ashton Walter, Md.
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1984-01-05
Filing date: 1985-01-03
Publication date: 1985-08-01
Also published as: IT8519010A1; FR2557887A1; SE8500024L; JPS60160891A; NL8500022A; AU3728085A; IT8519010A0; GB8432701D0; IT1184303B; GB2152503B; GB2152503A; SE8500024D0

Description

Die Erfindung betrifft allgemein die Herstellung von L-Phenylalanin, (nachfolgend als Phenylalanin bezeichnet) durch biologische Transaminierung mit toten Zellen. Insbesondere verbessert das erfindungsgemäße Verfahren die herkömmliche Transaminierung zur Herstellung von Phenylalanin erheblich, indem man die Reaktion auf solche Weise vollständig ablaufen läßt, daß die Phenylalanin-Vorstufe völlig verbraucht wird und Phenylalanin-Ausbeuten von über 90 % erreicht werden.

Es ist bekannt, daß Phenylalanin-Vorstufen enzymatisch in ihre korrespondierenden L-Aminosäuren umgewandelt werden können. Beispielsweise beschreibt die US-PS 3 133 868 die Fermentierung von Pseudomonas denitrificans oder Serratia marcesens mit DL-Phenylmilchsäure zur Herstellung von L-Phenylalanin. Die US-PS 3 957 588 beschreibt ein enzymatisches Verfahren zur Umwandlung von trans-Zimtsäure zu Phenylalanin unter Verwendung von L-Phenylalanin-Ammoniaklyase. Die US-PS 3 183 170 beschreibt die Transaminierung von Phenylbrenztraubensäure in Gegenwart eines Multienzymsystems aus verschiedenen Quellen, einschließlich Bakterienzellen, getrockneten Zellen, Zeilmaceraten oder Enzymlösungen. Oishi beschreibt in "The Microbial Production of Amino Acids", (Yamada et al., Ed.), in Kapitel 16 "Production from Precursor Keto Acids", Seiten 440-46 (1972) die Verwendung von chemisch syntheti-

sierter Phenylbrenztraubensäure als Substrat für die Transaminierungs- oder reduktive Aminierungsaktivität von Mikroorganismen zur Herstellung von Phenylalanin.

Transaminierung wird gewöhnlich als Reaktion zwischen einer Aminosäure und einer Ketosäure definiert, die den Transfer der Amino- und Ketogruppen zwischen den beiden Ausgangsmaterialien zur Folge hat. Es ist allgemein festgestellt worden, daß die enyzmatische Transaminierung eine Gleichge-Wichtsreaktion ist. Beispielsweise wird in dem Kapitel von Oishi darauf hingewiesen, daß die Verwendung von Aminotransferasen eine hohe Konzentration des Aminogruppen-Donators erfordert, um eine hohe Produktausbeute zu erhalten. In der US-PS 3 183 170 wird berichtet, daß bei einer Transaminie-

-) 5 rungsreaktion mit L-Glutaminsäure als Aminogruppen-Donator(en) die Verschiebung des Gleichgewichts nach rechts begünstigt wird, wenn man die bei der Transaminierung gebildete alpha-Ketoglutarsäure ebenso schnell wie sie durch die reduktive Aminierung gebildet wird in L-Glutaminsäure

20 rückwandelt.

In herkömmlichen Transaminierungsverfahren sind eine Reihe von Verbindungen als Aminogruppen-Donator(en) verwendet worden. Oishi stellt auf den Seiten 435-452 der Schrift von Yamada et al. fest, daß die besten Aminogruppen-Donator(en) L-Asparaginsäure, L-Leucin, L-Isoleucin und L-Glutaminsäure sind, und daß bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn die Aminosäuren in Kombination, als wenn sie einzeln verwendet werden.

30

Oxalessigsäure (auch als Oxobernsteinsäure oder Ketobernsteinsäure bekannt) ist ein Nebenprodukt der Transaminierung, wenn Asparaginsäure als Aminogruppen-Donator(en) verwendet wird.

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Oxalessigsäure ist in anderem Zusammenhang untersucht worden, und es zeigte sich, daß sie nach verschiedenen Mechanismen abgebaut wird.

Bessman berichtet in Arch. Biochem., 26.' 418-21 (1950) "Preparation and Assay of Oxalacetic Acid" über den spontanen Abbau von Oxalessigsäure, der durch eine Reihe von Substanzen katalysiert wird. Krebs berichtet in Biochem. 3£, 303-05 (1942) "The Effect of Inorganic Salts on the Ketone Decomposition of Oxaloacetic Acid", daß zahlreiche anorganische Salze die Abbaurate von Oxalessigsäure in Brenztraubensäure und Kohlendioxid steigern.

Man kann die Transaminierung einer Phenylalanin-Vorstufe in -15 Phenylalanin kann mit hohen Phenylalanin-Ausbeuten vollständig ablaufen lassen, indem man Asparaginsäure als einzigen Aminogruppen-Donator(en) und einen biologischen Katalysator, beispielsweise getrocknete Zellen eines Mikroorganismenstammes, der zur Transaminierung fähig ist, und vorzugsweise in Gegenwart der Phenylalanin-Vorstufe angezogen wurde, verwendet. Nach diesem Verfahren ist es möglich, eine 100 %ige Umwandlung der Vorstufe und 85 bis 100 %ige Phenylalanin-Ausbeuten unter Verwendung einer etwa äquimolaren Lösung der Vorstufe und der Asparaginsäure zu erhalten.

Das Grundverfahren schließt ein, daß man Mikroorganismen selektiert und präpariert, die fähig sind, eine Phenylalanin-Vorstufe mit hoher Ausbeute zu L-Phenylalanin zu transaminieren, eine Lösung herstellt, die Asparaginsäure als einzigen oder hauptsächlichen Aminogruppen-Donator(en) enthält, eine Lösung zubereitet, die eine Phenylalanin-Vorstufe enthält, die präparierten Mikroorganismen und die Lösungen in solchen Mengen miteinander in Kontakt bringt, daß Asparaginsäure und die Phenylalanin-Vorstufe etwa in

äquimolaren Mengen vorliegen und die Transaminierungsreaktion stattfinden läßt. Die Reaktion sollte unter Bedingungen durchgeführt werden, die die Transaminseaktivität begünstigen.

Eine der Hauptaufgaben der Erfindung i'st es, eine biologische Transaminierungsreaktion mit erheblich gesteigerter Zellproduktivität zu schaffen, die gesteigerte Phenylalanin-Ausbeuten bezogen sowohl auf die Asparaginsäure als auch auf die Phenylalanin-Vorstufe liefert. Durch die Verwendung dieses Reaktionssystems ist es möglich, die relativen Mengen der Vorstufe zu senken, die erforderlich sind, um die gewünschte Produktausbeute zu erhalten.

Damit im Zusammenhang steht die Aufgabe der Erfindung, Phenylalanin auf solche Weise herzustellen, daß das erhaltene Endprodukt wenig Verunreinigungen enthält, insbesondere hinsichtlich nicht umgewandelter Phenylalanin-Vorstufe und Nicht-Phenylalanin-Transaminierungsprodukte, so daß zeitrau-

20 bende und teure Trennschritte vermieden werden.

Erfindungsgemäß ist ferner beabsichtigt, daß das Erfordernis zur gleichzeitigen Fermentierung und Umsetzung ausgeschlossen wird, indem man das Zellwachstum von der interessierenden Umsetzung trennt.

Insgesamt ist es Aufgabe der Erfindung, die mit der Herstellung von Phenylalanin verbundenen Kosten drastisch und signifikant zu senken.

Das erfindungsgemäß beschriebene Verfahren schafft eine einzigartige Möglichkeit, die Transaminierung einer Phenylalanin-Vorstufe zu Phenylalanin mit hohen Ausbeuten bezogen auf sowohl Asparaginsäure als auch die Vorstufe zu begünstigen bzw. anzutreiben, während gleichzeitig die Vorstufe vollständig verbraucht wird. Das Verfahren macht

von einer Lösung Gebrauch, die etwa äquimolare Mengen von Asparaginsäure und Phenylalanin-Vorstufe enthält. Die enzymatische Aktivität des Katalysators wird drastisch gesteigert, wenn die Mikroorganismen in Gegenwart der Vorstufe angezogen werden.

Mikroorganismen, die sich erfindungsgemäß bereits als verwendbar erwiesen haben, sind Pseudomonas pseudoalcaliqenes, Escherichia coli und Brevibacterium thiogenitalis. Die erfindungsgemäß verwendbare Gruppe von Mikroorganismen ist selbstverständlich jedoch sehr viel breiter. Es sind auch andere Stämme von Pseudomonas, Brevibacterium und E. coli geeignet, obgleich die Reaktionsraten und die Wirksamkeit sich vermutlich von Stamm zu Stamm unterscheiden. Darüber hinaus ist zu erwarten, daß jegliche Mikroorganismen, die ihre gesamten Aminosäuren selbst produzieren, die erfindungsgemäß erforderliche Transaminaseaktivität aufweisen. Beispielsweise schließen geeignete Mikroorganismen zur Gattung Penicillum gehörende Pilze ein. Es wird ferner davon ausgegangen, daß Mischkulturen geeigneter Stämme verwendbar sind.

Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen, die in Gegenwart nicht hemmender Mengen der Phenylalanin-Vorstufe angezogen wurden, die Transaminierung der Vorstufe zu Phenylalanin mit einer höheren Rate katalysieren, als wenn sie ohne die Vorstufe angezogen wurden. Es ist außerordentlich wichtig, die Umwandlungs- oder Transaminierungrate zu steigern, da die Vorstufe phenylbrenztrauzbensäure in Lösung instabil ist und einem allmählichem Abbau unterliegt. Durch Steigerung der Transiminierungsrate wird die Gesamtproduktausbeute gesteigert, indem eine größere Menge der Vorstufe vor deren Abbau transaminiert werden kann. Beispielsweise wurde durch Anziehen von Pseudomonas pseudoalcaliqenes in Gegenwart von 0,5 g/l Pheny!brenztraubensäure ein System erhalten, das eine 75 %ige Phenylalanin-Ausbeute lieferte gegenüber einer

59 %igen Ausbeute bei Zellen, die ohne Vorstufe angezogen worden waren. Die Zellen können mit bis zu etwa 10,0 g/l der Vorstufe angezogen werden; oberhalb dieser Konzentration wird eine Hemmung des Zellwachstums beobachtet. Der am meisten bevorzugte Bereich zur Optimierung der katalytischen Aktivität der Mikroorganismen beträgt etwa 0,05 bis etwa 5,0 g/l Vorstufe.

Die Phenylalanin-Vorstufe ist eine alpha-Ketocarbonsäure oder deren Salz. Es ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich, eine hochgereinigte Form der Phenylalanin-Vorstufe zu verwenden. Im Gegensatz dazu erfordern oder bevorzugen die im Stand der Technik bekannten Verfahren eine gereinigte Vorstufe, da die Verunreinigungen das Zellwachstum und die Aktivität stören. Da erfindungsgemäß das Zellwachstum von der interessierenden Reaktion getrennt wurde, tritt dieses Verunreinigungsproblem nicht auf.

Die Vorstufe kann gereinigt sein oder kann in ungereinigter Form wie als Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid-Hydrolysat oder als Schwefelsaureprazipitat vorliegen.

Die Wachstumsbedingungen sollten bezogen auf den jeweiligen verwendeten Mikroorganismus ausgewählt werden und die Auswahl liegt im Rahmen des Könnens eines Fachmannes auf diesem Gebiet. Es ist bevorzugt, daß die Bedingungen ein schnelles Wachstum gesunder Zellen begünstigen. Wird beispielsweise Pseudomonas pseudoalcaligenes verwendet, so wird die Temperatur vorzugsweise bei etwa 35 bis etwa 39°C und der pH-Wert bei etwa 7,5 gehalten? es wird geschüttelt und/oder belüftet, um ein aerobes Milieu zu schaffen.

- is - "35ÖÖ054

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß die gewählten Mikroorganismen in einem Medium angezogen werden, das eine komplexe oder natürliche Kohlenstoffquelle oder -quellen wie Proteinextrakte, Maisquellwasser etc. enthält. Wird die Kohlenstoffquelle als Peptid geliefert, so sind die Mikroorganismen gezwungen, die Kohlenstoffquelle in deren Aminosäurebestandteile abzubauen, wobei die gewünschte Transaminaseaktivität induziert wird. Umgekehrt wird dann, wenn die Mikroorganismen mit einer Kohlenstoffquelle wie Ethanol angezogen werden, eine verhältnismäßig niedrige Transaminaseaktivität gefunden.

Die Mikroorganismen werden bis zu der gewünschten Zelldichte angezogen. Die genaue Wachstumszeit und

15 Zelldichte ist nicht kritisch, da die Dichte, falls

gewünscht, im Anschluß an das Wachstum nach herkömmlichen Verfahren wie Zentrifugieren oder Filtrieren gesteigert werden kann. Innerhalb einer typischen Wachstumsperiode von etwa 48 Stunden wird gewöhnlich eine verwendbare Zellzahl

20 erreicht.

Die Zellen werden anschließend geerntet. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen zentrifugiert, gewaschen und getrocknet. Zum derartigen

25 Präparieren der Zellen werden herkömmliche Methoden

verwendet. Diese können mit irgendeiner biokompatiblen Substanz wie Phosphat- oder Trispuffer gewaschen werden. Die Zellen können nach herkömmlichen Trocknungsverfahren beispielsweise über Nacht in einem Vakuumofen bei 32 C

30 getrocknet werden.

Es wurde gefunden, daß die Verwendung des Biokatalysators in Form getrockneter Zellen die Stabilität der Enzyme im Vergleich zu Feuchtzellen, beschallten Zellen usw. verbessert. Da jedoch das Trocknen der Zellen einen zusätzlichen Verfahrensschritt für das gesamte Reaktionssystem bedeutet,

ist vorgesehen, daß auch andere Zellpräpationen verwendet werden können. Als alternative Ausführungsform können die Mikroorganismen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren in oder auf einem geeigneten Substrat immobilisiert werden. Die präparierten Zellen können anschließend bis zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Transaminierungsverfahren bei Raumtemperatur oder gekühlt gelagert werden. Im allgemeinen ist die Verwendung von mindestens etwa 2,0 bis etwa 10,0 g der getrockneten Zellen je Liter Substratlösung bevorzugt. Bei geringeren Katalysatormengen werden signifikante Mengen der Phenylalanin-Vorstufe abgebaut, bevor sie transaminiert werden. Es kann daher wünschenswert sein, die Beladung des Systems mit Katalysator zu steigern, um so viel als möglich der Vorstufe in der

15 Transaminierungsreaktion zu nutzen.

Der Aminogruppen-Donator(en) für die erfindungsgemäße Transaminierung muß Asparaginsäure sein oder sollte im wesentlichen Asparaginsäure enthalten. Es wurde gefunden, daß die höchsten Phenylalanin-Ausbeuten erhalten werden, wenn Asparaginsäure der einziger Aminogruppen-Donator(en) in dem erfindungsgemäßen Reaktionssystem ist. Ferner wird durch Verwendung von Asparaginsäure als Aminogruppen-Donator (en) Oxalessigsäure als Nebenprodukt der Transaminierung gebildet. Die Oxalessigsäure wird leicht zu Kohlendioxid und Brenztraubensäure abgebaut. Wie oben im Stand der Technik angegeben, berichtet Bessman eine spontane Abbaurate von etwa 1,7 χ 10 Mol/l/h. Die Abbaurate der bei der erfindungsgemäßen Transaminierung gebildeten Oxalessigsäure entspricht etwa derjenigen, die für den spontanen Abbau beschrieben wird. Die Beseitigung der Oxalessigsäure aus dem Reaktionssystem durch Abbau läßt die Umwandlung der Vorstufe in Phenylalanin vollständig ablaufen.

In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Substratlösung zubereitet, die etwa äquimolare Mengen von Asparaginsäure und Phenylalanin-Vorstufe in einem biokompatiblen Puffer enthält. Erfindungsgemäß bedeutet die Bezeichnung "etwa äquimolar" entweder Äquimolarität oder bis zu 20 % Abweichung von der Äquimolarität. Es ist jedoch bevorzugt, daß annähernd tatsächlich äquimolare Mengen verwendet werden, um die Notwendigkeit zum Abtrennen nicht umgewandelter Asparaginsäure oder Phenylalanin-Vorstufe zu verringern oder auszuschließen. Es kann irgendein biokompatibles Lösungsmittel oder Puffer verwendet werden, die den Reaktionsablauf nicht stören und das Reaktionssystem in dem gewünschten pH-Bereich von etwa 7,0 bis etwa 8,5 halten. Beispielsweise hat sich etwa 0,1 bis 0,5 M Phosphatpuffer als geeignet erwiesen. Alternativ kann der pH-Wert kontrolliert werden, indem man dem System ein Mittel zum Steuern des pH-Werts zusetzt, das die erforderliche Lauge liefert, um das Absinken des pH-Werts durch das beim Abbau der Oxalessigsäure frei werdende Kohlendioxid zu verhindern.

Die präparierten Zellen werden in einem geeigneten Reaktionsgefäß mit der äquimolaren Asparaginsäure-Vorstufe-Lösung in Kontakt gebracht. Die Verwendung toter oder nicht lebensfähiger Zellen, vorzugsweise getrockneter Zellen, ist bevorzugt. Zellen in dieser Form weisen den Vorteil einer gesteigerten Enzymstabilität im Vergleich zu feuchten oder beschallten Zellen oder einem rohen Enzymextrakt auf.

Ferner verzehren tote oder nicht lebensfähige Zellen die Phenylalanin-Vorstufe nicht. Es können beschallte Zellen verwendet werden, es muß jedoch sichergestellt sein, daß die Membranen zumindest der meisten Zellen zerstört sind. Ferner sind Zellen in dieser Form leichter zu handhaben, da sie etwas starrer und fester sind als andere Zellpräparate. Es kann ferner wünschenswert sein, die Zellen auf einem geeigneten Substrat zu immobilisieren.

Die Reaktionsbedindungen für das erfindungsgemäße Verfahren sollten so ausgewählt werden, daß die Enzymstabilität gesteigert wird. Der Temperaturbereich kann etwa 20 bis etwa 50⁰C, vorzugsweise etwa 30 bis etwa 40⁰C betragen. Der pH-Wert kann etwa 6,5 bis etwa 9,0, vorzugsweise etwa 7,5 bis etwa 8,0 betragen. Die Einstellung des pH-Wertes wird vorzugsweise mit Ammoniumhydroxid oder Kaliumhydroxid vorgenommen, wobei beide das Lösen der Vorstufe und der Asparaginsäure unterstützen. Die Umsetzung erfordert keine Belüftung, aber die Zellen sollten relativ zum Substrat etwas geschüttelt oder bewegt werden, um die Zell-Substrat-Wechselwirkung zu maximieren.

Der Abschluß der Transaminierungsreaktion kann in weniger als etwa 40 Stunden vorzugsweise weniger als 24 Stunden erwartet werden, wenn hohe Konzentrationen des Biokatalysators verwendet werden. Ein besserer Maßstab ist jedoch die spezifische Reaktionsrate, d.h. die Gramm-Phenylalanin-Vorstufe, die je g Trockenzellgewicht und Stunde umgewandelt wurden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt dieser Wert zwischen etwa 0,01 bis etwa 10,0 g gebildetes Phenylalanin je g Trockenzellgewicht je Stunde. Im typischen Fall beträgt die spezifische Rate jedoch etwa 0,1 bis etwa 2,0 g Phenylalanin je g Trockenzellgewicht je Stunde.

Das Transaminierungsnebenprodukt, die Oxalessigsäure, wird unter diesen Reaktionsbedingungen leicht abgebaut und liefert Kohlendioxid und Brenztraubensäure. Dieser Abbau kann durch das Vorhandensein vielwertiger anorganischer Kationen katalysiert werden. Das Kohlendioxid entweicht, wenn die Reaktion in einem offenen Gefäß durchgeführt wird, oder es kann zum Zwecke der Beseitigung oder zur Wiederverwendung in anderen Verfahren gesammelt werden. Es wird davon ausgegangen, daß zumindest eine winzige Menge der

3 SWO 5

Brenztraubensäure durch Transaminierung oder Decarboxylierung mit Asparaginsäure zu Alanin umgewandelt wird. Daher sind sowohl Brenztraubensäure als auch kleine Menge von Alanin vorhanden, die jedoch beide leicht nach herkömmlichen Trennverfahren beseitigt werden können.

Die erfindungsgemäße biologische Transaminierung kann extrem hohe Phenylalanin-Ausbeuten ergeben, bezogen sowohl auf die Asparaginsäure als auch auf die Phenylalaniii-Vorstufe. Das heißt, es können 85 % oder mehr der Asparaginsäure in der Reaktion transaminiert werden und 85 % oder mehr der Phenylalanin-Vorstufe zu Phenylalanin umgewandelt werden.

Nach vollständiger Umsetzung wird das Produkt Phenylalanin nach herkömmlichen Verfahren gewonnen. Die Gewinnung und Abtrennung ist nach dem erfindungsgemäßen Verfahren weniger komplex als wenn herkömmliche Fermentationsverfahren verwendet werden. Durch die Trennung der Fermentation von der Transaminierungsreaktion ist es nicht notwendig, Fermentationsnebenprodukte und Metaboliten (beispielsweise extrazelluläre Proteine, Lipide) aus der Reaktionslösung zu beseitigen. Ferner werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren weniger verunreinigende Aminosäurenebenprodukte gebildet, die beseitigt werden müssen. Da die Transaminierung vollständig abläuft, bleibt darüber hinaus keine nicht umgesetzte Vorstufe in der Reaktionslösung. Typische Verfahren zur Gewinnung des gewünschten Produktes Phenylalanin schließen Ionenaustausch- und/oder fraktionierte Kristallisationsverfahren ein.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen unter Verwendung der folgenden Mikroorganismenstämme erläutert:

Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 E. coli ATCC 13005 E. coli ATCC 13070

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 31723 5

Eine detaillierte Beschreibung der allgemeinen Eigenschaften des Stammes Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 findet sich in J.Gen. Microbiol. £3, 243 bis 247 (1966). Der ursprünglich als Pseudomonas alcaligenes klassifizierte Stamm wird in dieser Veröffentlichung unter der Nr. 417 beschrieben und seine Klassifizierung als Pseudomonas pseudoalcaligenes vorgeschlagen.

Die Stämme E. coli ATCC 13005 und 13070 sind in den US-Patentschriften 2 975 105 bzw. 2 937 122 näher beschrieben.

Ferner werden in der Beschreibung und den Beispielen die folgenden Abkürzungen verwendet:
20

HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie

UpM Umdrehungen/Minute

Tris/HCL tris(Hydroxymethy1)-aminomethan-HCL 25

Die in den Tabellen angegebenen Werte für die in den Beispielen erhaltene Selektivität, Umwandlung und Ausbeute wurden wie folgt berechnet:

■"35ÖDÖ54

Selektivität

Menge produziert Menge verbraucht

Umwandlung

Menge verbraucht Ausgangsmenge

Ausbeute

= Selektivität χ Umwandlung

_ Menge produziert Ausgangsmenge

Beispiel 1

Transaminierung unter Verwendung verschiedener mikrobischer Katalysatoren

Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815, E. coli ATCC 13005, E. coli ATCC 13070 und Brevbibacterium thiogenitalis ATCC 31723 wurden wie folgt angezogen und präpariert: Kulturen jedes Stammes wurden auf Trypticase-Soy-Schrägagar 24 Stunden lang bei 35 C angezogen. Jede Schragagarkultur wurde mt 5,0 ml phosphat-gepufferter steriler Salzlösung bespült und die gebildete Suspension in 100 ml Trypticase-Soy-Brühe in 500 ml Schüttelkolben übertragen. Die Trypticase-Soy-Brühe wurde von der "BBL Division of Becton", Dickinson & Co., bezogen. Der Trypticase-Soy-Schrägagar wurde aus 20 g/l Agar und 30 g/l Trypticase-Soy-Brühe hergestellt.

Die Kulturen wurden 56 Stunden lang bei 35 C in den Schüttelkolben angezogen, wobei während der ersten Hälfte der Anzuchtzeit 200 UpM angewendet wurden und anschließend die Einstellung versehentlich auf 250 UpM erhöht wurde. Jeder Stamm wurde getrennt geerntet, zentrifugiert, mit Salzlösung gewaschen und 12 Stunden lang bei 32°C in einem Vakuumofen getrocknet.

35ÜÜÜ54

Eine Lösung von 7,6 g/l gereinigter Brenztraubensäure (Aldrich Chemical Co. Inc.) und 18 g/l Asparaginsäure wurde in einem Kaliumphosphatpuffer zubereitet und der pH-Wert mit Ammoniumhydroxid auf 7,5 eingestellt. Es ist zu beachten, daß in diesem Beispiel nicht die erfindungsgemäße etwa äquimolare Asparaginsäure-Vorstufe-Lösung verwendet wurde. Zu je vier 10,0 ml Teilmengen dieser Lösung wurden jeweils 2,0 mg der getrockneten Zellen der vier Stämme je ml Lösung in mit Kappen versehene 20 ml Teströhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden in ein Schüttelbad mit

konstanter Temperatur bei 35°C und 200 UpM gesetzt. Nach 5, 8 und 24 Stunden wurden Proben entnommen und mit dem Eisen(III)-chlorid colorimetrischen Test auf Pheny!brenztraubensäure (wie nachfolgend beschrieben) und mit HPLC auf

-15 Phenylalanin und Asparaginsäure untersucht. Die in Tabelle I wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß die verwendeten Stämme die gewünschte Transaminaseaktivität aufwiesen.

ASP (g/l)
PPA³ (g/l)
PHE⁴ (g/I)
Ausbeute (PHE/PPA)
Ausbeute (PHE/ASP)

5 Stunden

Tabelle 1

(Transaminseaktivität aufweisende Mikroorganismen )

8 Stunden

12815 13005 13070 31723

13,60 10,32 15,2 14,20

2,20 3,78 4,1 0,20

4,85 1,81 2,0 0,75

64 % 17 % 27 % 3 SS

82 S 13 % 51 S 14 S

12B15 13005 13070 31723

9,35 10,24 9,21 10,20

0,00 1,30 2,00 2,10

5,27 3,67 3,03 2,88

70 Κ 53 % 44 % 40 %

47 % 36 % 46 % 56 Ä

	24 Stunden	13070	31723
12815	13005	6,63	9,48
5,59	9,21	0,00	0,00
0,00	0,00	4,03	5,36
5,56	5,87	53 %	73 %
79 S	77 %	28 %	54 %
30 %	51 %

Dieser Versuch wurde nicht nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt, sondern es sollen nur Beispiele für Mikroorganismen mit der Fähigkeit zum Transaminieren aufgezeigt werden, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind.

ASP = Asparaginsäure
PPA = Brenztraubensäure
PHE = Phenylalanin

CO

cn" ö·. α

cn

Anzucht von Mikroorganismen mit der Vorstufe

Zellen von Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 wurden 24 Stunden lang bei 35 C auf Trypticase-Soy-Schrägagar angezogen. Bei einem Schrägagar-Satz (Probe 1) wurde jeder Schrägagar mit 5,0 ml Salzlösung bespült und die resultierende Suspension in 100 ml Trypticase-Soy-PPA-Wachstumsmedium in 1 Liter Schüttelkolben überführt. Trypticase-Soy-PPA-Wachstumsmedium wurde mit Trypticase-Soy-Brühe ("BBL Div. of Becton ¹V Dickinson & Co.) hergestellt, dem 0,5 g/l Brenztraubensäure (PPA, Aldrich Chemical Co., Inc.) zugesetzt wurden. Die Kolben wurden 12 Stunden lang bei 35°C inkubiert und zum Inokulieren von 500 ml Trypticase-Soy-Brühe in 1 Liter Schüttelkolben verwendet. Bei einem zweiten Schrägagar-Satz (Probe 2) wurde das gleiche Verfahren jedoch ohne Zugabe von PPA durchgeführt. Die Kolben der beiden Proben 1 und 2 wurden 48 Stunden lang bei 35°C und 200 UpM angezogen, bevor geerntet wurde. Die Zellen wurden zentrifugiert und der Zellkuchen sofort getrocknet, indem man ihn für 12 Stunden in einen Vakuum-

20 ofen bei 37°C brachte.

Es wurde eine Lösung von 18,8 g/l Asparaginsäure und 23,2 g/l gereinigter Brenztraubensäure (Aldrich Co.) in Phosphatpuffer hergestellt. Der pH-Wert wurde mit Ammoniumhydroxid auf 7,5 eingestellt. Zu 100 ml Teilmengen dieser Lösung wurden jeweils 2,0 g/l der getrockneten Zellen von entweder Probe 1 oder Probe 2 gegeben. Die Mischungen wurden 24 Stunden lang bei 37°C und 200 UpM inkubiert. Nach 5, 17 und 24 Stunden wurden 2,0 ml Portionen jeder Probe entnommen und wie in Beispiel 1 analysiert. Wie die in Tabelle II wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, wird durch Zugabe von PPA zu dem Fermentationsmedium die spezifische Transaminierungsaktivitat dieser Mikroorganismen drastisch gesteigert.

Tabelle II

(Induktion durch Anzucht mit Vorstufe)

5 Stunden

keine PPA PPA

17 Stunden

keine PPA PPA

25 Stunden

keine PPA PPA

PPA¹ (g/l)
ASP² (g/1)
PHE³ (g/l)

Selektivität (PHE/ASP) Umwandlung (PPA) Ausbeute (PHE/PPA)

Selektivität (PHE/ASP) Umwandlung (ASP) Ausbeute (PHE/ASP)

Rate (M PHE/h/g Zellen) Rate (M PHE/h/g Zellen)

16,2	12,1
12,8	11,3
4,5	8,6
64,0 %	80,0 %
30,0 %	48,0 %
19,2 %	38,4 !SS
60,0 S	93,0 8
37,0 SS	40,0 5
22,2 %	37,2 S
2,7x1 θ"³	5,2x10 ³-
_ . -3	_2

5,4x10

1 PPA = Phenylbrenztraubensäure

2 ASP = Asparaginsäure

3 PHE = Phenylalanin

1,0x10

8,20

8,98

11,30

75,00 65,00 48,70

91,00
54,00
49,10

1,3x10 2,5x10

-3
-3

3,26

3,46

17,10

85,00 !

86,00

73,10

90,00 83,00 74,70

2,3x10 4,6x10

-3

61,00 !
100,00

61,00 :

1,7x10
3,4x10

,-3
-3

0,00

2,13

21,00

90,50 % 100,00 % 90,50 Ä

101,00 8 89,00 % 89,90 %

2,5x10 5,0x1 θ"

Beispiel 3

Erhöhte Beladung mit Katalysator

Getrocknete Zellen von Pseudomonas pseudoalcaliqenes ATCC 12815 wurden nach dem Verfahren für Probe 1 gemäß Beispiel 2 zubereitet. Es wurde eine Lösung A hergestellt, die 25 g/l Pheny!brenztraubensäure (Aldrich Co.) und 20 g/l Asparaginsäure bei einer Konzentration von 0,15 M in Phosphatpuffer enthielt. Der pH-Wert wurde mit Ammoniumhydroxid auf 7,5 eingestellt. Es wurde eine Lösung B hergestellt, die 20 g/l Pheny!brenztraubensäure und 16 g/l Asparaginsäure bei einer Konzentration von 0,12 M in Phosphatpuffer enthielt, der pH-Wert wurde mit Ammoniumhydroxid auf 7,5

15 eingestellt.

Die getrockneten Zellen wurden diesen Lösungen mit einer Konzentration von 5,0 g/l bzw. 2,0 g/l zugegeben und 24 Stunden lang bei den Reaktionsbedingungen gemäß Beispiel 2 inkubiert. Die Proben wurden nach 5 und 24 Stunden wie in Beispiel 1 analysiert. Die in Tabelle III wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß mit einer erhöhten Beladung mit Katalysator erhöhte Ausbeuten erzielt werden.

Tabelle Hl

(Erhöhte Beladung mit Katalysator) 5 Stunden 24 Stunden

1 2 g Zellen/l 5 g Zellen/l

2 g Zellen/l 5 g Zellen/l

PPA	(g/l)
ASP⁴	(g/O
PHE⁵	(g/0
Alanin	(g/0

Selektivität (PHE/PPA) Umwandlung (PPA) Ausbeute (PHE/PPA)

Selektivität (PHE/ASP) Umwandlung (ASP) Ausbeute (PHE/ASP)

Rate (M PHE/h/g Zellen) Rate (M PHE/h/g Zellen)

16,20	16,20	0,00	0,00
13,50	15,20	0,23	2,48
3,32	4,72	14,50	20,50
0,28	0,00	0,42	0,20
87,0 %	54,00 %	75,00	85,00
19,0 %	35,0 0 %	100,00	100,00
16,5 Ä	18,90 %	75,00	85,00
107,0 %	79,00 %	76,00	96,00
15,0 %	24,00 S	98,50	88,00
16,0 %	18,90 *	74,90	84,50
2,2 χ 1θ"'	2,0 χ ΙΟ"'	1,8 χ 1Ο~^	1,0 χ 10~'
4,4 χ 10	1,0 χ 10~	3,6 χ 10~	5,0 χ 10~

1 2 g Zellen/lt 0,12 M Lösung (20 g/l PPA; 16 g/l Asparaginsäue)

2 5g Zellen/l: 0,15 M Lösung (23 g/l PPA; 18,8 g/l Asparaginsäure)

3 PPA = Phenylbrenztraubensäure

4 ASP = Asparaginsäure

5 PHE = Phenylalanin

CO".

cn. cd; cd CD cn

Beispiel 4

Aminogruppen-Donatoren

Getrocknete Zellen von Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 wurden nach dem Verfahren für Probe 1 gemäß Beispiel 2 zubereitet. Es wurden drei Reaktionslösungen hergestellt, von denen jede 16,4 g/l Phenylbrenztraubensäure (Aldrich Chemical Co., Inc.) in Phosphatpuffer enthielt. Lösung 1 enthielt 13,92 g/l Asparaginsäure. Lösung 2 enthielt 15,83 g/l Glutaminsäure. Lösung 3 enthielt 6,68 g/l Asparaginsäure und 8,78 g/l Glutaminsäure. Zu jeder Lösung wurden 2,0 g/l getrocknete Zellen gegeben und die Mischung 26 Stunden lang bei den Reaktionsbedingungen gemäß Beispiel 1 inkubiert. Proben wurden nach 5 und 26 Stunden wie in Beispiel 1 analysiert. Die in Tabelle IV wiedergegebenen Ergebnisse zeigen drastisch die überlegenen Ausbeuten mit Asparaginsäure als einzigem Aminogruppen-Donator.

PPA¹ (g/l) ASP² (g/l) GLU³ (g/l) PHE⁴ (g/l)

Selektivität (PHE/PPA) Umwandlung (PPA) Ausbeute (PHE/PPA)

Tabelle IV

(Asparaginsäure gegenüber Glutaminsäure gegenüber eine_r Asparaginsäure-Glutaminsäure-Mischung) O Stunden 5 Stunden 26 Stunden

ASP GLU ASP/GLU

16,40 16,40 16,40

13,92 0,00 6,68

0,00 15,83 8,78

0,00 0,00 0,00

ASP GLU ASP/GLU

8,40 14,60 13,50

12,38 0,00 6,06

0,00 15,60 8,96

2,74 0,22 1,30

34 % 12,0 SS 45 SS

49 SS 11,0 % 18 SS

17 SS 1,3 55 8 %

ASP	GLU	ASP/GLU
1,30	12,79	9,87
3,08	0,00	2,78
0,00	14,97	8,21
14,01	0,69	5,40
93 SS	19,0 SS	83,0 %
92 SS	22,0 SS	40,0 %
86 SS	4,2 %	33,0 SS

Selektivität (PHE/ASP) Umwandlung (ASP) Ausbeute (PHE/ASP) 177 SS 0,0 SS 210 SS 11 SS 0,0 SS 9 S 20 SS 0,0 Si 19 %

130 % 0,0 % 138,0 Sä

78 % 0,0 SS 58,0 SS

101 SS 0,0 SS 81,0 SS

Selektivität (PHE/GLU) Umwandlung (GLU) Ausbeute (PHE/GLU) 0 SS 96,0 SS 141 SS OS 1,5 % 10 SS 0 SS 1,4 Ä 15 %

0 % 80,0 % 947,0 SS OK 5,4 S 6,5 % O SS 4,3 % 61,0 SS

1 PPA = Brenztraubensäure

2 ASP r Asparaginsäure

3 GLU = Glutaminsäure

4 PHE = Phenylalanin

5 M PHE/h/g Zellen

1,7x10"³ 0,2xip"³ 0,85x10"³ 1,6x10"³ 0,12x10"³ 0,61x10"³

CG¹, Cn

Beispiel 5

Zubereitungen von getrockneten im Vergleich mit

feuchten Zellen

Zellen von Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 wurden nach dem Verfahren für Probe 1 gemäß Beispiel 2 angezogen. Die Zellen wurden geerntet und ein Teil wurde durch Zentrifugieren konzentriert und anschließend 12 Stunden lang in einem Vakuumofen getrocknet. Es wurde bei 35°C eine 0 _f12 äquimolare Lösung von Pheny!brenztraubensäure (19,8 g/l) und Asparaginsäure (16,0 g/l) in Phosphatpuffer (pH 7,5) hergestellt und 100 ml Portionen dieser Lösung wurden in zwei 0,2 1 Kolben gebracht, die bei 37°C gehalten und geschüttelt (150 UpM) wurden. Zu einem Kolben wurden 2,0 g/l getrocknete Zellen gegeben. Zu dem anderen Kolben wurden feuchte Zellen entsprechend 2,0 g/l Zelltrockengewicht (85 % Feuchtigkeit) gegeben. Die Reaktionsmischungen wurden 18 Stunden lang inkubiert. Der Flüssigkeit wurden nach 5, 5 und 18 Stunden Proben entnommen und wie in Beispiel 1 auf Phenylalanin, Asparaginsäure und Pheny!brenztraubensäure untersucht. Die in Tabelle V wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß getrocknete Zellen höhere Ausbeuten und Selektivität liefern.

Tabelle V

(Zubereitungen getrockneter Zellen im Vergleich zu feuchten Zellen)

PPA¹ (g/l)
ASP² (g/l)
PHE³ (g/l)

Selektivität (PHE/PPA) Umwandlung (PPA) Ausbeute (PHE/PPA)

Selektivität (PHE/ASP) Umwandlung (ASP) Ausbdeute (PHE/ASP)

	5,5 Stunden	getrocknete	18 Stunden
getrocknete	Zellen feuchte Zellen	0,00	Zellen feuchte Zellen
8,52	8,29	2,94	1,01
11,30	10,30	16,68	2,27
5,82	4,62	85 %	14,32
51 %	40 %	100 %	76 %
57 %	58 %	85 %	96 %
29 %	23 %	98 %	73 %
98 %	65 SS	85 %	84 %
29 %	31 %	84 S	85 %
28 %	20 %	72 Ä

Rate (M PHE/h/g Trockenzellen) 3,3 χ

1 PPA = Phenylbrenztraubensäure

2 ASP = Asparaginsäure

3 PHE = Phenylalanin

2,6 χ 10

-3

2,7 χ 10

-3

2,4 χ 10

-3

CX? O O CD

Eisen(III)-Chlorid colorimetrischer Nachweis für Phenylbrenztraubensäure, Natriumsalz

Prinzip: Phenylbrenztraubensäure (PPA) bildet mit Eisen(III)-Ionen einen grünen Komplex. Die Intensität der Grünfärbung ist proportional der vorhandenen PPA-Menge.

Reagentien:

1. Entwicklungslösung - (1000 ml). Die folgenden Bestandteile werden vermischt und in einem Eisbad auf Raumtemperatur gekühlt. Die Bestandteile werden in einen 1 Liter Meßkolben gefüllt und das Volumen mit entionisiertem Wasser aufgefüllt. Bestandteile: 0,5 g FeCl-..6 H₂O, 20 ml Eisessig, 600 ml Dimethylsulfoxid, 200 ml entionisiertes Wasser.

2. Na-PPA Standardlösung (10 g/l). 500 mg Na-PPA-H₃O (Aldrich Chemical Co., Inc., Reinheit 98 bis 100 %) werden zu 40 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer (ph 8,0) bei 34°C gegeben. Es wird bis zum Lösen gerührt. Die Lösung wird in einen 50 ml Meßkolben überführt und das Volumen mit Tris/HCl-Puffer aufgefüllt. Die Aufbewahrung erfolgt im Kalten. Herstellung von 0,1 M Tris/HCl-Puffer: zu 900 ml entionisiertem Wasser werden 12,11 g Tris gegeben, der pH-Wert wird mit HCl auf 8,0 eingestellt, die Lösung wird in einen Meßkolben gegossen und mit entionisiertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

30 Eichkurve:

In gläserne Spektrophotometerröhrchen werden Na-PPA Standardlösung und 4,95 ml Entwicklungslösung gefüllt und auf einem Vortex-Mischer vermischt. Man läßt die Röhrchen genau 10 Minuten stehen (die Zeitmessung beginnt mit der Zugabe von Entwicklungslösung zu dem ersten Röhrchen). Die

35ΌΌΌ54

optische Dichte (OD) wird bei 640 nm abgelesen. Es wird eine Na-PPA.H₃O Standardexchkurve aufgestellt (die Adsorption wird auf die vertikale Achse und die mg Na-PPA.H₂O/ml Entwxcklungslösung auf die horizontale Achse aufgetragen).

Na-PPA Standard mg Na-PPA-H₂O je ml Entwicklungislösung

10 ⁵/^ul °'⁰¹

10,Ul 0,02

15,ul 0,03

20,Ul 0,04

25/ul 0,05

30/Ul 0,06

15 /

25 Berechnung;

NA-PPA-H₂O (mg/ml) = OD χ 100 χ Verdünnung

Steigung der Standardkurve

oder
30

PPA (g/l) = OD χ 100 χ Verdünnung χ 164.16

Steigung der Standardkurve 204.16

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Mikroorganismen selektioniert und präpariert, die fähig sind, eine Phenylalanin-Vorstufe mit hoher Ausbeute zu L-Phenylalanin zu transaminieren,

b) eine Lösung herstellt, die Asparaginsäure als einzigen oder hauptsächlichen Aminogruppen-Dona ~

tor(en) enthält,

c) eine Lösung herstellt, die eine Phenylalanin-Vorstufe enthält,

d) die präparierten Mikroorganismen und die gemäß den Stufen (b) und (c) erhaltenen Lösungen auf solche Weise miteinander in Kontakt bringt, daß die Asparaginsäure und die Phenylalanin-Vorstufe in etwa äquimolaren Mengen unter für die Transaminaseaktivität günstigen Bedingungen vorliegen und

e) die Transaminasereaktion stattfinden läßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen aus den Gattungen Pseudomonas, E. CoIi, Brevibacterium und Penicillium auswählt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen in Gegenwart nicht hemmender
Mengen von Phenylalanin anzieht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen in Gegenwart von bis zu 10,0 g/l

der Vorstufe anzieht.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen in Gegenwart einer komplexen

20 Kohlenstoffquelle anzieht.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen durch Trocknen präpariert.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phenylalanin-Vorstufe Phenylbrenztraubensäure verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß

die verwendete Phenylbrenztraubensäure gereinigt oder ein Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid-Hydrolysat oder ein Schwefelsäurepräzipitat ist.
10. Verfahren nach Anspruch t, dadurch gekennzeichnet, daß man Stufe (d) bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 50⁰C und einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 9,0 durchführt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur etwa 3
bis etwa 8,0 beträgt.

die Temperatur etwa 30 bis 40⁰C und der pH-Wert etwa 7,5
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bei der Transaminierung gemäß Stufe (e) gebildete Oxalessigsäure in situ abgebaut wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den Abbau der Oxalessigsäure spontan erfolgen läßt.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Phenylalanin-Vorstufe während der Reaktion vollständig verbraucht wird.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausbeute an L-Phenylalanin mindestens 90 bis 100% beträgt.

20
16. Verfahren zur vollständigen Transaminierung einer Phenylalanin-Vorstufe zu L-Phenylalanin, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen biologischen Katalysator verwendet, um die Transaminierungsreaktion zu begünstigen,

b) Asparaginsäure als hauptsächlichen Aminogruppen-Donator(en) verwendet und

c) die Oxalessigsäure als Nebenprodukt der Transaminierung aus dem Reaktionssystem beseitigt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete biologische Katalysator Zellen ausgewählt aus den Gattungen Pseudomonas, E. CoIi, Brevibacterium und Penicillium enthält.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen der Gattung Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 verwendet.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man tote oder nicht lebensfähige Zellen verwendet.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man geerntete und getrocknete Zellen verwendet.
21. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Katalysator verwendet, dessen Transaminaseaktivität durch Anziehen der Zellen in einem nicht hemmende Mengen von Phenylbrenztraubensäure enthaltenden Medium gesteigert wurde.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß in dem verwendeten Wachstumsmedium bis zu etwa 10,0 g/l Phenylbrenztraubensäure vorhanden sind.
23. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man den biologischen Katalysator im Überschuß verwendet, um die Reaktion vollständig ablaufen zu lassen.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den biologischen Katalysator in Konzentrationen von etwa 2,0 bis etwa 10,0 g/l verwendet.
25. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man Asparaginsäure als einzigen Aminogruppen-Donator(en) verwendet.
26. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Asparaginsäure und die Phenylalanin-Vorstufe in dem Transaminierungs-Reaktionssystem in etwa äquimolaren Mengen vorliegen.

ORIGINAL INSPECTED
27. Verbessertes Verfahren zur biologischen Transaminierung von Asparaginsäure und einer Phenylalanin-Vorstufe zur Bildung von L-Phenylalanin, dadurch gekennzeichnet, daß man tote oder nicht lebensfähige Mikroorganismen, die zur Transaminierung fähig sind, mit einer Lösung oder Lösungen in Kontakt bringt, die etwa äquimolare Mengen von Asparaginsäure und der Phenylalanin-Vorstufe enthalten.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phenylalanin-Vorstufe Phenylbrenztraubensäure verwendet.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Phenylbrenztraubensäure gereinigt oder ein Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid-Hydrolysat oder ein Schwefelsäurepräzipitat ist.
30. Verfahren nach Anpruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß

man die Mikroorganismen aus den Gattungen Pseudomonas, E. CoIi, Brevibacterium und Penicillium auswählt.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen in Gegenwart nicht hemmender Mengen der Phenylalanin-Vorstufe anzieht.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen in Gegenwart von bis zu 10,0 g/l der Vorstufe anzieht.
33. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen in Gegenwart einer komplexen Kohlenstoffquellen anzieht.
34. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen durch Trocknen präpariert.