FR2557887A1 - Procede de production de l-phenylalanine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PRODUCTION DE L-PHENYLALANINE. SELON L'INVENTION, ON CHOISIT ET ON PREPARE DES MICRO-ORGANISMES CAPABLES DE TRANSAMINER UN PRECURSEUR DE PHENYLALANINE EN L-PHENYLALANINE, ON PREPARE UNE SOLUTION COMPRENANT DE L'ACIDE ASPARTIQUE COMME SEUL DONNEUR AMINO, ON PREPARE UNE SOLUTION CONTENANT UN PRECURSEUR DE PHENYLALANINE, ON MET LES MICRO-ORGANISMES ET LES SOLUTIONS EN CONTACT DE FACON QUE DES PROPORTIONS A PEU PRES EQUIMOLAIRES DE L'ACIDE ASPARTIQUE ET DU PRECURSEUR DE PHENYLALANINE SOIENT PRESENTES, EN CONDITIONS FAVORABLES A L'ACTIVITE DE LA TRANSAMINASE, ET ON LAISSE LA REACTION DE TRANSAMINATION SE PASSER. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT A LA PRODUCTION DE L-AMINOACIDES.

Description

La présente invention se rapporte généralement à la production de L-

phénylalanine (appelée ci-après phénylalanine) par une transamination biologique de cellules mortes. Plus particulièrement, le procédé révélé ici améliore remarquablement la transamination convention- nelle pour la production de phénylalanine en menant la réaction à l'aboutissement de façon que le précurseur de phénylalanine soit totalement consommé et que l'on puisse

obtenir de la phénylalanine à un rendement supérieur à 90%.

On sait que les précurseurs de phénylalanine

peuvent être convertis, par voie enzymatique, en L-amino-

acides correspondants. Par exemple, le brevet US N 3 133 863 (Takesue et autres) révèle la fermentation de Pseudomonras denitrificans ou ce Serratia marcesens avec l'acide DL-phényl lactique pour produire de la L=phényl= alanine. Le brevet US N 3 957 588 (Yamada et autres) révèle une methode enzymatique pour la conversion de l'acide trans-cimamnique en phénylalanine en utilisant la L-phénylalanine ammonialyase.o Le brevet US NO 3 183 170 (Kitai et autres) révèle la transamination de 1 'acide phénylpyruvique en présence d'un système multi=enzyme obtenu de diverses sources, comprenant des cellules bactériennes, des cellules séchées, des macérats de cellules ou des solutions d'enzymes. Oishi dans le chapitre 16 de The Microbial Production of Amino Acids (Yamada et autres, Ed.), "Production from Precursor Keto Acids", pages 440-46 (1972), révèle l'utilisation de l'acide phénylpyruvique obtenu par synthèse chimique en tant que substrat pour la transamination ou l'amination

réductrice des microbes, afin d'obtenir la phénylalanine.

La transamination est normalement définie comme la réaction entre un aminoacide et un cétoacide qui a pour résultat le transfert des groupes amino et céto entre les deux matières premières. On a généralement reconnu que la transamination enzymatique était une réaction à l'équilibre. Par exemple, le chapitre de Oishi note que l'utilisation des aminotransférases a nécessité une haute concentration du donneur amino pour un fort rendement du produit. Le brevet US N 3 183 170 (Kitai et autres) rapporte que dans une réaction de transamination en utilisant l'acide L-glutamique comme donneur amino, l'équilibre est déplacé favorablement vers la droite

par reconversion de l'acide alpha-cétoglutarique, résul-

tant de la transamination, en acide L-glUtamique aussi

rapidement qu'il se forme par amination réductrice.

Dans des procédés conventionnels de transamina-

tion, on a utilisé un certain nombre de composés comme donneuramino. Oishi, aux pages 435-52 du texte de Yamada et autres, indique que les meilleurs donneurs amino sont l'acide L-aspartique, la L-leucine, la Lisoleucine et l'acide L-glutamique et que de meilleurs résultats sont

obtenus lorsque ces aminoacides sont utilisés en combinai-

son que lorsqu'ils sont utilisés seuls.

L'acide oxaloacétique (également connu sous le nom d'acide oxalacétique, acide oxosuccinique ou acide cétosuccinique) est un sous-produit de la transamination lorsque l'acide aspartique est le donneur amino. L'acide oxaloacétique a été étudié dans d'autres contextes et s'est révélé se décomposer par divers mécanismes. Bessman,

dans "Preparation and Assay of Oxalacetic Acid", Arch.

Biochem., volume 26, pages 418-21 (1950), rapporte la décomposition spontanée de l'acide oxalacétique qui est catalysée par un certain nombre de substances. Krebs "The Effect of Inorganic Salts on the Ketone Decomposition of Oxaloacetic Acid", Biochem., volume 36, pages 303-05

(1942), rapporte que de nombreux sels inorganiques augmen-

tent le taux de décomposition de l'acide oxaloacétique en

acide pyruvique et gaz carbonique.

La transamination d'un précurseur de phénylalanine en phénylalanine peut être menée à l'aboutissement avec de forts rendements de phénylalanine en utilisant l'acide aspartique comme seul donneur amino et en utilisant un catalyseur biologique, par exemple des cellules séchées appartenant à une souche microbienne capable de transamination, croissant de préférence en présence du précurseur de phénylalanine. Il est possible, par ce procédé, d'obtenir une conversion de 100% du précurseur

et des rendements de 85 à 100% de phénylalanine en utili-

sant une solution à peu près équimolaire du précurseur

et de 1 'acide aspartique.

Le procédé de base consiste à choisir et à préparer des micro-organismes capablesde la transamination d'un précurseur de phénylalanine en Lphénylalanine à de hauts rendements, à préparer une solution comprenant l'acide aspartique comme seul donneur amino ou donneur amino

prédominant, à préparer une solution comprenant le précur-

seur de phénylalanine, à mettre les micro-organismes et les solutions préparés en contact en quantités telles qu'il y ait des proportions à peu près équimolaires de l'acide aspartique et du précurseur de phénylalanine et à laisser la réaction de transamination se passer. La réaction doit être entreprise en conditions favorables

à l'activité de la transaminase.

L'un des buts principaux de l'invention consiste à produire une réaction de transamination biologique avec une productivité remarquablement accrue de cellules, ayant pour résultat des rendements accrus de la phénylalanine en se basant à la fois sur l'acide aspartique et le précurseur de phénylalanine. En utilisant ce système réactionnel, il est possible de diminuer les quantités proportionnelles du précurseur nécessairespour obtenir

le rendement souhaité du produit.

La présente invention a pour autre objectif la production de phénylalanine de façon à obtenir un produit final contenant peu de contaminants, en particulier par rapport au précurseur non converti de phénylalanine et aux produits de transamination de non phénylalanine, de façon à pouvoir éviter des étapes longues et coûteuses de

séparation.

De plus, il est prévu que cette invention élimine la nécessité d'une fermentation et d'une réaction simultanées en séparant la croissance des cellules de la réaction d'intérêt. La présente invention a pour objectif général la réduction remarquable et importante du prix associé à la production de phénylalanine. L'invention révélée ici offre un moyen unique de mener la transamination d'un précurseur de phénylalanine à la phénylalanine à de forts rendements en se basant à la fois sur l'acide aspartique et le précurseur, tout en provoquant simultanément une consommation complète du précurseur. Le procédé utilise une solution comprenant des quantités à peu près équimolaires de l'acide aspartique et du précurseur de phénylalanine. L'activité enzymatique du catalyseur peut être considérablement améliorée lorsque l'on fait croître les microorganismes en présence du précurseur. Les micro-organismes qui se sont déjà révélés utiles dans ce procédé sont Pseudomonas pseudoalcaligenes, Escherichia coli et Brevibacterium thiogenitalis. Le groupe des microorganismes qui sera utile dans cette invention sera bien entendu bien plus large. On peut s'attendre à ce que d'autres souches de Pseudomonas, Brevibacterium et E. coli soient appropriées, bien que les allures de réaction et les efficacités diffèrent probablement d'une souche à l'autre. Par ailleurs, on peut s'attendre à ce que tout micro-organisme connu comme étant capable de produire tous ses aminoacides puisse démontrer l'activité de transaminase requise dans ce procédé. Par exemple, des micro-organismes utiles peuvent

contenir des champignons appartenant au genre Penicillum.

De plus, il est envisagé que des cultures mélangées de

souches appropriées soient utilisées.

On a trouvé que des micro-organismes croissant en présence de niveaux non inhibitoires du précurseur de phénylalanine catalysaient la transamination du précurseur en phénylalanine à une allure plus rapide que lors d'une croissance en l'absence du précurseur. L'augmentation de l'allure de conversion (ou de transamination) est très importante car le précurseur, l'acide phénylpyruvique, est instable en solution et est sujet à une décomposition graduelle. L'augmentation de l'allurede transamination augmente le rendement total du produit en permettant à une plus grande quantité du précurseur d'être transaminée avant décomposition. Par exemple, la croissance de Pseudomonas seudoalcaligenes en présence de 0,5 g/l d'acide phénylpyruvique a eu pour résultat un système donnant un rendement de 75% de phénylalanine, en opposition à 59% pour des cellules croissant sans le précurseur. On peut faire croître les cellules avec jusqu'à environ ,0 g/l du précurseur; au delà de cette concentration, la croissance des cellules semble 8tre inhibée. La gamme

préférée pour optimiser l'activité catalytique des micro-

organismes est d'environ 0,05 à environ 5,0 g/l du précurseur. Le précurseur de phénylalanine est un acide alpha-cétocarboxylique ou son sel. Il n'est pas nécessaire d'utiliser une forme très purifiée du précurseur de phénylalanine dans ce procédé. Au contraire, les procédés selon l'art antérieur nécessitent ou préfèrent que le précurseur soit purifié car des contaminants ont tendance

à interrompre la croissance et l'activité des cellules.

Comme dans cette invention on a séparé la croissance des

cellules de la réaction d'intérêt, ce problème de contami-

nation n'est pas rencontré.

Le précurseur peut être purifié, ou peut être sous une forme non purifiée comme un hydrolysat d'hydroxyde de sodium de potassium ou d'ammonium, ou un précipité

d'acide sulfurique.

Les conditions de croissance doivent 8tre choisies sur la base des microorganismes particuliers utilisés et sera dans la connaissance et la compétence de toute personne travaillant dans ce domaine. Il est préférable que les conditions favorisent la croissance rapide des cellules saines. Par exemple, si l'on utilise Pseudomonas pseudoalcaligenes, la température est de préférence maintenue à environ 35 à39 C, le pH à environ 7,5; on utilise une agitation et/ou une aération afin de

produire un environnement aérobie.

Dans le procédé de l'invention, il est préférable que les microorganismes choisis croissent dans un milieu comprenant une source complexe ou naturelle de carbone ou plusieurs sources, comme des extraits de protéine, des liqueurs de trempage de mais etc. Avec la source de carbone sous la forme de peptides, les micro-organismes sont forcés à rompre la source de carbone en aminoacides la composant, ce qui induit l'activité de transaminase souhaitée. Inversement, lorsque l'on a fait croltre les micro-organismes sur une source de carbone comme l'éthanol,

l'activité de transaminase se révèle être assez faible.

On fait croître les micro-organismes jusqu'à la densité souhaitée des cellules. La durée précise de la croissance et la densité des cellules ne sont pas critiques parce que la densité peut être accrue après la croissance, si on le souhaite, par un moyen conventionnel comme une centrifugation ou une filtration. Une durée typique de croissance d'environ 48 heures produira-usuellement un

nombre utilisable de cellules.

Les cellules sont alors récoltées. Selon le mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules sont

centrifugées, lavées et séchées. Des méthodes convention-

nelbs sont utilisées pour préparer les cellules de cette façon. Elles peuvent être lavées avec toute substance biocompatible, comme un tampon de phosphates ou tampon Tris. Les cellules peuvent être séchées par une technique conventionnelle de séchage, par exemple pendant une nuit

dans un four sous vide à 32 C.

On a trouvé que l'utilisation du biocatalyseur sous la forme de cellules séchées améliorait la stabilité des enzymes, en comparaison aux cellules humides, aux cellules soniquées, etc. Cependant, comme le séchage des cellules ajoute une étape de procédé au système réactionnel total, il est envisagé de pouvoir utiliser d'autres

préparations de cellules. Comme alternative, les micro-

organismes peuvent être Immobilisé dans ou sur un substrat approprié pour une utilisation dans ce procédé. Les cellules préparées peuvent alors être stockées à la tempé- rature ambiante ou sous réfrigération jusqu'à ce qu'elles soient utilisées dans le procédé de transamination décrit ici. Il sera généralement préférable d'utiliser au moins environ 2,0 à environ 10,0 grammes des cellules séchées par litre de la solution du substrat. Des niveaux inférieurs du catalyseur permettront une décomposition de quantités sensibles du précurseur de phénylalanine avant de subir la transamination. Il peut par conséquent être souhaitable d'augmenter la charge du catalyseur dans le système afin d'utiliser autant du précurseur que possible

dans la réaction de transamination.

Le donneur amino pour la transamination de cette invention doit être l'acide aspartique ou doit contenir sensiblement de l'acide aspartique. On a trouvé que le plus fort rendement en phénylalanine était obtenu lorsque l'acide aspartique est le seul donneur amino présent dans le système réactionnel. Par ailleurs, en utilisant l'acide aspartique comme donneur amino, de l'acide oxaloacétique

se forme en tant que sous-produit de la transamination.

L'acide oxaloacétique se décompose facilement pour donner du gaz carbonique et de l'acide pyruvique. L'art antérieur, Bessman, cité cidessus, rapporte un taux de décomposition

spontanée d'environ 1,7 x 10-3 mole par litre par heure.

Le taux de décomposition de l'acide oxaloacétique formé par la transamination dans le contexte de l'invention est à peu près celui rapporté pour la décomposition spontanée. L'enlèvement de l'acide oxaloacétique du système réactionnel par décomposition mènera la conversion du

précurseur en phénylalanine à l'aboutissement.

Dans le mode de réalisation préféré de l'inven-

tion, une solution d'un substrat comprenant des quantités à peu près équimolaires de l'acide aspartique et du précurseur de phénylalanine dans un tampon biocompatible est préparée. Dans le contexte de cette invention, "à peu près équimolaire " signifie soit équimolaire ou jusqu'à environ 20% d'écart par rapport à l'équimolaire. Il est cependant préférable d'utiliser des quantités proches d'équimolaire réel, afin de réduire ou d'éliminer la nécessité d'une séparation de l'acide aspartique ou du précurseur de phénylalanine non converti. Tout solvant biocompatible ou tampon n'interférant pas avec le processus de réaction peut être utilisé, lequel maintiendra le système réactionnel à la plage souhaitée de pH d'environ 7,5 à environ 8,5. Par exemple, une quantité d'environ

0,1 à 0,5 M de tampons de phosphates s'est révélée appro-

priée. Alternativement, le pH peut être contrôlé en ajoutant un contrôleur du pH dans le système pour ajouter une base nécessaire pour empêcher le pH de baisser tandis que le gaz carbonique est libéré en tant que produit de

décomposition de l'acide oxaloacétique.

Dans un récipient réactionnel approprié, les

cellules préparées sont contactées par la solution équi-

molaire acide aspartique-précurseur. Il est préférable

d'utiliser des cellules mortes ou non viables, de préfé-

rence des cellules séchées. Les cellules sous cette forme semblent avoir l'avantage d'une stabilité enzymatique accrue en comparaison à des cellules humides ou soniquées ou des extraits d'enzymesbruts. Par ailleurs, les cellules mortes ou non viables ne consomment pas le précurseur de phénylalanine. Les cellules soniquées peuvent être utilisées mais il faut prendre soin de s'assurer que les membranes d'au moins la plupart des cellules auront été interrompues. De plus, des cellules sous cette forme sont plus faciles à manipuler, étant un peu plus rigides et plus dures que d'autres préparations de cellules. Il peut également être souhaitable d'immobiliser les cellules sur

un substrat approprié.

Les conditions de réaction pour le procédé de l'invention doivent être choisies pour améliorer la stabilité des enzymes. La plage de températures peut être d'environ 20 à environ 50 C, de préférence d'environ 30 à environ 40 C. Le pH peut être de l'ordre de 6,5 à environ 9,0, de préférence d'environ 7,5 à environ 8,0.

L'ajustement du pH est de préférence fait avec de l'ammo-

niac ou de l'hydroxyde de potassium, dont chacun aidera

à la solubilisation du précurseur et de l'acide aspartique.

La réaction ne nécessite pas d'aération, mais il doit y avoir une certaine agitation ou un mouvement des cellules par rapport au substrat afin de maximiser l'interaction cellules-substrat. On peut s'attendre à ce que la réaction de transasmînation soit terminée en moins d'environ 40 heures, de préférence moins d'environ 24 heures lorsque l'on emploie de fortes concentrations du biocatalyseur. Un meilleur indicateur cependant sera le taux spécifique de réaction, c'est-à-dire les grammes du précurseur de phénylalanine converti par gramme du poids de cellules sèches par heure. Dans le procédé de l'invention, cet indicateur peut être compris entre environ 0,01 et environ ,0 grammes de phénylalanine produite par gramme de poids de cellules sèches par heure. Typiquement cependant, le taux spécifique sera d'environ 0,1 à environ 2,0 grammes de phénylalanine par gramme de poids de cellules sèches

par heure.

Le sous-produit de transamination, l'acide oxaloacétique, est facilement décomposé dans ces conditions de réaction pour donner du gaz carbonique et de l'acide pyruvique. Le gaz carbonique se dissipera si la réaction est entreprise dans un récipient ouvert ou bien il peut être recueilli soit pour une évacuation ou pour une utilisation dans d'autres procédés. On pense qu'au moins une partie minuscule de l'acide pyruvique est convertieen alanine par transamination ou décarboxylation avec l'acide aspartique. Ainsi, l'acide pyruvique et de faibles quantités d'alanine seront présents, mais les deux peuvent

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facilement être retires par des méthodes conventionnelles

de séparation.

La transamination biologique de l'invention peut avoir pour résultat des rendements extrêmement élevés de phénylalanine par rapport à l'acide aspartique ou au précurseur de phénylalanine. En effet, il peut y avoir transamination de 85% ou plus de l'acide aspartique

dans la réaction et 85% ou plus du précurseur de phényl-

alanine peuvent être convertis en phénylalanine.

Après accomplissement de la réaction, la phénylalanine produite peut être récupérée par des méthodes conventionnelles. La récupération et la séparation seront moins complexes en utilisant ce procédé que si l'on

avait utilisé un procédé traditionnel de fermentation.

Du fait de la séparation de la fermentation et de la réaction de transamination, il ne sera pas nécessaire de

retirer les sous-produits de fermentation et les métabo-

lites (comme les protéines extracellulaires, les lipides), de la solution réactionnelle. Par ailleurs, le procédé de l'invention donne moins d'aminoacides sous-produits contaminants à retirer. De plus, comme la transamination est menée à l'aboutissement, il ne reste pas de précurseur n'ayant pas réagi dans la solution réactionnelle. Des méthodes typiques de récupération de la phénylalanine produite souhaitée peuvent comprendre un échange d'ions

et/ou des procédés de cristallisation fractionnée.

Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer l'invention sans en aucun cas en limiter le cadre. Les abréviations qui suivent ont été utilisées

dans toute la description de l'invention:

C = degré(s) Celsius g = gramme(s) HPLC = chromatographie liquide haute pression h = heure(s) 1 = litre (s) M = molaire mg = milligramme(s) ml = millilitre (s) t/mn = tours par minute % = pourcent Tris/HCl = tris(hydroxyméthyl)-amino- méthane-HCl Dans les tableaux qui illustrent les résultats obtenus dans les exemples, la sélectivité, la conversion et le rendement sont calculés comme suit Sélectivité = quantité produite quantité utilisée Conversion quantité utilisée quantité initiale Rendement = Sélectivité x conversion quantité produite quantité initiale

EXEMPLE I

Transamination en utilisant divers catalyseurs microbiens On a fait croître Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815, E. coli ATCC 13005, E. coli ATCC 13070 et Brevibacteria thiogenitalis ATCC 31723, et on les a préparés comme suit. On a fait croître des cultures de chaque souche sur des plans inclinés de soja de Trypticase pendant 24 heures à 35 C. Chaque plant a été lavé avec 5,0 ml d'une solution stérile aux tampons de phosphates et la suspension résultante a été transférée à 100 ml de bouillon de soja -de Trypticase dans des ballons vibreurs de 500 ml. Le bouillon de soja de Typticase a été obtenu de la division BBL de Becton, Dickinson & Co. Les lamelles inclinées de soja de Trypticase étaient formées de 20 g/l d'agar et de 30 g/l de bouillon de soja

de Trypticase.

On a fait croître les cultures dans les ballons à secousses pendant 56 heures à 35 C, 200 t/mn jusqu'à mi-chemin pendant la période de croissance, lorsque

l'ajustement en tours par minute a été accru par inadver-

tance à 250. Chaque souche a été recueillie séparément, centrifugée et lavée avec une solution saline, et séchée dans un four à vide à 32 C pendant 12 heures. Une solution de 7,6 g/l d'acide phénylpyruvique purifié (Aldrich Chemical Co., Inc.) et 18 g/l d'acide aspartique a été formée dans un tampon de phosphates de potassium et le pH a été ajusté à 7,5 avec de l'ammoniac. Il faut noter que l'onn'utilise pas,dans cette expérience, la solution à peu près équimolaire d'acide aspartique/précurseur de l'invention décrite ici. A quatre portions de 10, 0 ml de cette solution on a ajouté 2,0 mg de cellules séchées par ml de la solution de chacune des quatre souches respectivement dans des éprouvettes bouchées de 20 ml. Les éprouvettes ont été placées dans un bain agitateur à température constante à 35 C, 200 t/mn. Des échantillons ont été prélevés au bout de 5 8 et 24 heures et ont été analysés par une détermination colorimétrique au chlorure ferrique pour l'acide phénylpyruvique (décrite ci-après) et par HPLC pour la phénylalanine et l'acide aspartique. Les résultats sont montrés au tableau I, démontrant que les souches utilisées présentent l'activité de transaminase

souhaitée.

TABLEAU I

(Micro-organismes présentant une activité de transamination1) heures 8 heures 24 heures

12815 13005 13070 31723 12815 13005 13070 31723 12815 13005 13070 31723

ASP (g/l) 13,60 10,32 15,2 14,20 9,35 10,24 9,21 10,20 5,59 9,21 6,63 9, 48 PPA3 (g/l) 2,20 3,78 4,1 0,20 0,00 1,30 2,00 2,10 0,00 0,00 0,00 0,00 PHE (g/l) 4,85 1,81 2,0 0,75 5,27 3,67 3,03 2,88 5,56 5,87 4,03 5,36 Rendement

(PHE/PPA) 64% 17% 27% 3% 70% 53% 44% 40% 79% 77% 53% 73%

Rendement (PHE/ASP) 82% 13% 51% 14% 47% 36% 46% 56% 30% 51% 28% 54% u 1 Cette expérience n'a pas été entreprise par le procédé de l'invention, mais elle est simplement destinée à montrer des exemples de microorganismes ayant des capacités

de transamination qui seront utiles dans la présente invention.

2 ASP = acide aspartique PPA = acide phénylpyruvique L 4 PHE = phénylalanine > PHE = phénylalanine Co

EXEMPLE II

Croissance des micro-organismes avec le précurseur On a fait croître des cellules de Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 sur des lamelles inclinées de Trypticase du soja pendant 24 heures à 35 C. Pour un groupe de lamelles (échantillon I), chaque lamelle a été lavée avec 5,0 ml d'une solution saline et la suspension résultante a été transférée à 100 ml d'un milieu de croissance de Trypticase du soja-PPA dans des ballons à secousses de I litre. Le milieu de croissance Trypticase du soja-PPA est formé avec le bouillon de Trypticase du soja (BBL division de BectoQn, Dickinson & Co.) o l'on ajoute 0,5 g/l d'acide phénylpyruvique (PPA) (Aldrich Chemical Co., Inc.). Les ballons ont été incubés pendant 12 heures à 35 C et utilisés pour inoculer 500 ml du bouillon de Trypticase du soja dans des ballons à secousses de I litre. Pour un second groupe de lamelles inclinées (échantillon II), le même processus a été suivi sans l'addition de PPA. On a fait croître les ballons pour les échantillons I et II à 35 C, 200 t/mn pendant 48 heures avant de récolter. Les cellules ont été centrifugées et la boulette de cellules a été séchée immédiatement par mise en place dans un four sous vide à 37 C pendant

12 heures.

Une solution de 18,8 g/l d'acide aspartique et de 23,2 g/l d'acide phénylpyruvique purifié (Aldrich Co.) dans un tampon de phosphatesa été formée. Le pH a été ajusté à 7,5 avec de l'ammoniac. A des portions de 100 ml de cette solution, on a ajouté 2,0 g/l de cellules séchées

de l'échantillon I ou de l'échantillon II, respectivement.

Les mélanges ont été incubés à 37 C, 200 t/mn pendant 24 heures. A 5, 17 et 24 heures, des portions de 2,0 ml ont été retirées de chaque échantillon et analysées comme à l'exemple 1. Comme on peut le voir par les résultats montrés au tableau II-, l'addition de PPA aux milieux de fermentation augmente remarquablement l'activité de

transamination spécifique de ces micro-organismes.

TABLEAU II

(Induction par croissance avec précurseur) heures 17 heures 25 heures Sans PPA PPA Sans PPA PPA Sans PPA PPA PPA (g/l) 16,2 12,1 8,20 3,26 0,00 0,00 ASP2 (g/l) 12,8 11,3 8,98 3,46 5,26 2,13 PHE3 (g/l) 4,5 8,6 11,30 17, 10 14,10 21,00 Sélectivité (PHE/PPA) 64,0% 80,0% 75,00 85,00 61,00 90,50 Conversion (PPA) 30,0% 48,0% 65,00 86,00 100,00 100,00 Rendement (PHE/PPA) 19,2% 38,4% 48,70 73,10 61,00 90,50 Sélectivité (PHE/ASP) 60,0% 93,0% 91, 00 90,00 84,00 101,00 Conversion (ASP) 37,0% 40,0% 54,00 83,00 72,00 89, 00 Rendement (PHE/ASP) 22,2% 37,2% 49,10 74,70 60,50 89,90 Taux (M PHE/hg cellules) 2,7x10-3 5,2x10-3 1,3x10-3 2,3x10-3 1,7x10-3 2,5x10-3 Taux (M PHE/h-g cellules) 5,4x10-3 1,0x10-2 2,5x10-3 4,6x10-3 3,4x10-3 5,0x10-3 2 PPA = acide phénylpyruvique L 2 ASP = acide aspartique 3 PHE = phénylalanine o Co4

EXEMPLE III

Charge accrue du catalyseur

Des cellules séchées de Pseudomonas pseudoalcali-

genes ATCC 12815 ont été préparées selon les processus pour l'échantillon I à l'exemple II. On a préparé la solution A, contenant 25 g/l d'acide phénylpyruvique (Aldrich Co.) et 20 g/l d'acide aspartique dans un tampon de phosphates à une concentration de 0,15 M. Le pH a été ajusté à 7,5 avec de l'ammoniac. La solution B a été préparée, contenant 20 g/l d'acide phénylpyruvique et 16 g/l d'acide aspartique dans un tampon de phosphates à une concentration de 0,12 M; le pH a été ajusté à 7,5

avec de l'ammoniac.

Les cellules séchées ont été ajoutées à ces solutions à une concentration de 5,0 g/l et 2,0 g/l respectivement et incubées pendant 24 heures aux conditions de réaction spécifiées à l'exemple II. Des échantillons ont été analysés à 5 et 24 heures comme à l'exemple I. Comme le montrent les résultats du tableau III, une

charge accrue du catalyseur a pour résultat une augmenta-

tion des rendements.

TABLEAU!II

(Charge accrue du catalyseur) heures 24 heures 2 g cellules/l 5 g cellules/l2 2 g cellules/1 5 g cellules/1 PPA3 (g/l) 16,20 16,20 0,00 0,00 ASP4 (g/l) 13,50 15,20 0,23 2,48 PHE5 (g/l) 3,32 4,72 14,50 20,50 Alanine (g/l) 0,28 0,00 0,42 0,20 Sélectivité (PHE/PPA) 87,0% 54,00% 75, 00 85,00 Conversion (PPA) 19,0% 35,00% 100,00 100,00 Rendement (PHE/PPA) 16,5% 18,90% 75,00 85,00 Sélectivité (PHE/ASP) 107,0% 79,00% 76,00 96,00 Conversion (ASP) 15,0% 24,00% 98,50 88,00 Rendement (PHE/ASP) 16,0% 18, 90% 74,90 84,50 Taux (M PHE/h-g cellules) 2,2x10-3 2,0x10-3 1,8x10-3 1, 0x10-3 Taux (M PHE/h-g cellules) 4,4x10-3 1,0x10-2 3,6x10-3 5,0x103 I 2 gcellules/l: solution à 0,12M (20 g/l PPA; 16 g/l acide aspartique)

2 5 g-cellules/l: solution à 0,15M 23,2 g/l PPA; 18,8 g/l acide aspartique) -

2 PPA = acide phénylpyruvique 4 ASP = acide aspartique PHE = phénylalanine

EXEMPLE IV

Donneurs amino

Des cellules séchées de Pseudomonas pseudo-

alcaligenes ATCC 12815 ont été préparées selon les processus pour l'échantillon I à l'exemple II. Trois solutions le réactifs ont été préparées, chacune contenant 16,4 g/l d'acide phénylpyruvique (Aldrich Chemical Co, Inc) dans un tampon de phosphates. La solution I contenait 13,92 g/l d'acide aspartique. La solution II contenait 15,83 g/l d'acide glutamique. La solution III contenait

6,68 g/l d'acide aspartique et 8,78 g/l d'acide glutamique.

A chaque solution, on a ajouté 2,0 g/l de cellules séchées et on a incubé le mélange pendant 26 heures aux conditions de réaction spécifiées à l'exemple I. Des échantillons

ont été analysés comme à l'exemple I à 5 et 26 heures.

Les résultats montrés au tableau IV démontrent de manière remarquable les rendements supérieurs lorsque l'acide

aspartique est le seul donneur amino.

TABLEAU IV

(Acide aspartique par rapport à l'acide glutamique par rapport au mélange acides aspartique/glutamique) 0 heure 5 heures 26 heures

ASP GLU ASP/GLU ASP GLU ASP/GLU ASP GLU ASPGLU

PPA2 (g/i 16,40 16,40 16,40 8,40 14,60 13,50 1,30 12,79 9,87 ASP g 1) 13, 92 0,00 6,68 12,38 0,00 6,06 3,08 0,00 2,78 GLU3 (g/l) 0,00 15,83 8,78 0, 00 15,60 8,96 0,00 14,97 8,21 PHE (g/l) 0,00 0,00 0,00 2,74 0,22 1,30 14, 01 0,69 5,40 Sélectivité

(PHE/PPA) 34% 12,0% 45% 93% 19,0% 83,0%

Conversion

(?PA) 49% 11,0% 18% 92% 22,0% 40,0%

Rendement

(PHE/PPA) 17% 1,3% 8% 86% 4,2% 33,0%9

Sélectivité

(PHE/ASP) 177% 0,0% 210% 130% 0,0% 138,0%

Conversion

(ASP) 11% 0,0% 9% 78% 0,0% 58,0%

Rendement

(PHE/ASP) 20% 0,0% 19% 101% 0,0% 81,0%

Sélectivité

(PHE/GLU) 0% 96,0% 141% 0% 80,0% 947,9%

Conversion

(GLU) 0% 1,5% 10% 0% 5,4% 6,5% L

Rendement

(PHE/GLU) 0% 1,4% 15% 0% 4,3% 61,0%

Taux 5 1,7x10-3 0,2x10-3 0,85x10-3 I,6x103 0,12x10-3 q61x10-3 I PPA = acide phénylpyruvique 3 GLU = acide glutamique 5 (M PHE/h-g cellules) 2 ASP = acide aspartique 4 PHE = phénylalanine

EXEMPLE V

Préparations de cellules séchées par rapport aux cellules humides On a fait croître Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 selon les processus pour l'échantillon I à l'exemple II. Les cellules ont été récoltées et une partie a été concentrée par centrifugation puis séchée dans un four à vide à 35 C pendant 12 heures. Une solution équimolaire à 0,12 de l'acide phénylpyruvique (19,8 g/l) et de l'acide aspartique (16,0 g/l) dans un tampon de phosphates (pH 7,5) a été préparée et des portions de ml ont été placées dans deux récipients à température

contrôlée (37 C) et sous agitation (150 t/mn) de 0,2 litre.

Dans un récipient on a ajouté 2,0 g/l de cellules séchées.

Dans l'autre récipient on a ajouté des cellules humides sur une base de 2, 0 g/l de poids de cellules sèches (85% d'humidité). Les mélanges réactionnels ont été incubés pendant 18 heures. Le liquide a été échantillonné à 5,5 et 18 heures, et l'on a déterminé la phénylalanine, 1 'acide aspartique et 1 'acide phénylpyruvique comme à l'exemple I. Les résultats, montrés au tableau V;indiquent que des cellules séchées donnent de plus forts rendements

et une plus forte sélectivité.

TABLEAU V

Préparation de cellules séchées par rapport aux cellules humides) ,5 heures 18 heures Cellules Cellules Cellules Cellules séchées humides séchées humides PPA (g/l) 8,52 8,29 0,00 1,01 ASP2 (g/l) 11,30 10,30 2,94 2,27 PHE3 (g/l) 5,82 4,62 16,68 14,32 Sélectivité (PHE/PPA) 51% 40% 85% 76% Conversion (PPA) 57% 58% 100% 96% Rendement (PHE/PPA) 29% 23% 85% 73% Sélectivité (PHE/ASP) 98% 65% 98% 84% Conversion (ASP) 29% 31% 85% 85% Rendement (PHE/ASP) 28% 20% 84% 72% Taux (M PHE/h-g cellules 3,3x10-3 2, 6x10-3 2,7x10-3 2,4x103 séchées)

1 C

^ coe PPA = acide phénylpyruvique 2 ASP = acide aspartique 3 PHE = phénylalanine Détermination colorimétrique au chlorure ferrique du sel de sodium de l'acide phénylpyruvique Principe: L'acide phénylpyruvique (PPA) forme un complexe vert avec des ions ferriques. L'intensité de la couleur

verte est proportionnelle à la quantité de PPA présent.

Réactifs:

1. Solution de développement (1.000 ml) -

Mélanger les ingrédients qui suivent et refroidir à la température ambiante dans un bain de glace. Ajouter le contenu à un ballon volumétrique de I litre et ramener au volume avec de l'eau désionisée. Ingrédients: 0,5 g FeC13 6H20; 20 ml d'acide acétique glacial; 600 ml

de diméthylsulfoxyde; 200 ml d'eau désionisée.

2. Solution standard de Na-PPA (10 g/l) -

Ajouter 500 mg de Na-PPA-H20 (Aldrich Chemical Co., Inc, 98% - 100% pur) à 40 ml de tampon 0,1 M Tris/HC1 (pH 8,0) à 34 C. Agiter jusqu'à dissolution. Placer la solution dans un ballon volumétrique de 50 ml et amener au volume

avec un tampon Tris/HCl. Stocker à l'état réfrigéré.

Pour le tampon Ol M Tris/HC1: ajouter 900 ml d'eau désionisée à 12,11 g de tampon Tris; ajuster le pH à 8,0 avec HC1; verser dans le ballon volumétrique; ajouter de

l'eau désionisée jusqu'à 1.000 ml.

Courbe de calibrage: Ajouter la solution standard Na-PPA et 4,95 ml

de la solution de développement à des tubes de spectro-

photomètre en verre. Mélanger au tourbillon. Laisser au repos pendant exactement 10 minutes (en commençant à compter le temps avec l'addition de la solution de développement au premier tube). Lire la densité optique (OD) à 640 nm. Préparer la courbe de calibrage standard de Na-PPA'H20 (l'axe vertical est l'absorbance; l'axe

horizontal est mg de Na-PPA-H20/ml DS).

mg Na-PPA H20 NA-PPA standard par ml DS /l 0,01

1 0,02

1 0,03

p 1 0,04 pl 0,05 l 0,06 Calcul Na-PPA-H20 = OD x 100 x dilution pente par rapport à courbe standard ou PPA (g/l) OD x 100 x dilution x 164,16 pente par rapport à courbe 204,16 standard

Claims (10)

R E V E N D I C A T I 0 N S

1.- Procédé de préparation de L-phénylalanine caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) choisir et préparer des micro-organismes qui sont capables de transaminer un précurseur de phényl- alanine en L- phénylalanine à de hauts rendements, (b) préparer une solution comprenant de l'acide aspartique comme seul donneur amino ou donneur anino prédominant,

(c) préparer une solution comprenant un pré-

curseur de phénylalanine, (d) mettre en contact les micro-organismes préparés et les solutions résultant des étapes (b) et (c) de façon que des proportions à peu près équimolaires de l'acide aspartique et du précurseur de phénylalanine soient présentes, à des conditions favorables à l'activité de la transaminase, et (e) laisser la réaction de transamination se passer.

2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les micro-organismes sont choisis dans le groupe consistant en Pseudomonas, E. coli, Brevibacteria

et Penicillum.

3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les microorganismes ont grandi en

présence de niveaux non inhibitoires de phénylalanine.

4.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les microorganismes sont préparés

par séchage.

5.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le précurseur de phénylalanine est

l'acide phénylpyruvique.

6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide oxaloacétique produit par la réaction de transamination de l'étape (e) est décomposé

sur place.

7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la décomposition de l'acide

oxaloacétique se produit spontanément.

8.- Procédé pour mener à l'aboutissement la transamination d'un précurseur de phénylalanine en L-phénylalanine caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) utiliser un catalyseur biologique pour effectuer la réaction de transamination, (b) utiliser l'acide aspartique comme donneur amino primaire, et (c) retirer le sous-produit de transamination

d'acide oxaloacétique, du système réactionnel.

9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'activité de transaminase du catalyseur a été accrue par croissance des cellules dans un milieu comprenant des niveaux non inhibitoires de

l'acide phénylpyruvique.

10.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'un catalyseur biologique en excès

est utilisé pour mener la réaction à l'aboutissement.