NL8500022A - Werkwijze voor het bereiden van l-fenylalanine. - Google Patents

Description

V '.....—

Werkwijze voor het hereiden van L-f enylalanine.

De uitvinding heeft in het algemeen betrekking op het bereiden van L-fenylalanine (hierna aangeduid als fenylalanine) door een biologische transaminering met dode cellen. In het bijzonder verbetert de hierin beschreven werk-5 wijze in sterke mate de gebruikelijke trans-aminering voor de bereiding van f enylalanine door de reaktie op zodanige wijze te laten aflopen, dat de fenylalaninevoorloper geheel wordt verbruikt en fenylalanineopbrengsten van meer dan 90 % kunnen worden verkregen.

10 Het is bekend dat fenylalaninevoorlopers enzyma tisch in hun overeenkomstige L-aminozuren kunnen worden omgezet. Zo is bijvoorbeeld in het Amerikaanse octrooischrift 3-133.868 (Takesue en med.) de fermentatie van Pseudomonas denitrificans of Serratia marcesens met DL-fenylmelkzuur ter bereiding van 15 L-fenylalanine beschreven. In het Amerikaanse octrooischrift 3·957·588 (Yamada en med.) is een enzymatische methode voor het omzetten van trans-kaneelzuur in f enylalanine onder toepassing van L-fenylalanineammonialyase beschreven. Het Amerikaanse octrooischrift 3.183.170 (Kitai en med.) heeft betrekking op 20 de transaminering van fenylpyrodruivezuur in aanwezigheid van een multi-enzymsysteem verkregen uit verschillende bronnen, waaronder bacterie-cellen, gedroogde cellen, celmaceraten of enzymoplossingen. „Oishi beschrijft in Ch. 16 van The Microbial Production of Amino Acids, (Yamada en med. Ed.), "Production 25 from Precursor Keto Acids," biz. UU0-U6 (1972), het gebruik van chemisch gesynthetiseerd fenylpyrodruivezuur als substraat voor de transaminerende of reductieve aminerende werking van microben, teneinde f enylalanine te verkrijgen.

Transaminering wordt normaliter gedefinieerd als 30 de reaktie tussen een aminozuur en een ketozuur die leidt tot de overdracht van de amino- en keto-groepen tussen de twee uitgangsmaterialen. Algemeen wordt erkend dat de enzymatische 3500022

« V

0 ! ! - 2 -! * transaminering een evenwichtsreaktie is,. Zo is bijvoorbeeld in het artikel van Oishi te vinden dat het gebruik van amino-transferasen voor het bereiken van een hoge opbrengst van het produkt een hoge concentratie van de aminodonor nodig maakt.

5 In het Amerikaanse octrooischrift 3.183.170 (Kitai en med.) is vermeld dat bij een transamineringsreaktie onder toepassing van L-glutaminezuur als aminodonor het evenwicht op gunstige wijze.naar rechts wordt verschoven door het α-keto-glutaarzuur dat wordt gevormd door de in tegengestelde richting, verlopende 10 transaminering tot L-glutaminezuur even snel als het wordt gevormd door reductieve aminering om te zetten.

Bij gebruikelijke transamineringswerkvijzen is een aantal verbindingen als aminodonor toegepast. Oishi, vermeldt op biz. 1*35-52 van de Yamada en med. tekst dat de beste amino-15 donors L-asparaginezuur, L-leucine, L-isoleucine en L-glutamine- zuur zijn en dat betere resultaten worden verkregen indien deze aminozuren gecombineerd in plaats van afzonderlijk worden toegepast.

Oxaloazijnzuur (eveneens bekend 'als oxaalazijnzuur, 20 oxobamsteenzuur of ketobarnsteenzuur) is een bijprodukt van de transaminering. indien asparaginezuur de aminodonor is. Oxalo-azgizuur is eveneens in andere verbanden onderzocht en bleek door verschillende mechanismen te ontleden. Bessman, ''Preparation and Assay of Oxalacetic Acid", Arch. Biochem., Vol. 26, blz. 1*18-25 21 (1950) vermeldt de spontane,ontleding van oxaalazijnzuur, die door een aantal stoffen wordt gekatalyseerd. Krebs, "The Effect of Inorganic Salts on the Ketone Decomposition of Oxaloacetic Acid", Biochem., Vol. 36, blz. 303-05 (19**2) meldt dat vele anorganische zouten de ontledingssnelheid van oxalo-30 azijnzuur tot pyrodruivezuur en kooldioxyde verhogen.

De transaminering van een fenylalaninevoorloper tot fenylalanine kan men met hoge fenylalanineopbr engs ten laten aflopen door asparaginezuur als enige aminodonor te gebruiken en door een biologische katalysator toe te passen, bijvoorbeeld 35 gedroogde cellen die tot een microbiële stam behoren die in Λ 8500022 ·,1 ί .........—..

\ - 3 - staat is tot transaminering» die bij voorkeur gegroeid is in aanwezigheid van de fenylalaninevoorloper. Het is volgens deze methode mogelijk 100 % omzetting van de voorloper en 85 tot 100 % fenylalanine-opbrengsten te verkrijgen, onder toe-5 passing van een ongeveer equimolaire oplossing van voorloper en asparaginezuur.

De basiswerkwijze omvat het selecteren en prepareren van micro-organismen die in staat zijn een fenylalaninevoorloper te transaaineren tot L-fenylalanine in hoge op-10 brengsten, het bereiden van een oplossing die asparaginezuur als de enige of belangrijkste aminodonor bevat, het bereiden van een oplossing die fenylalaninevoorloper bevat, het in contact barengen van de geparepareerde micaroorganismen en de oplossingen in dusdanige hoeveelheden dat ongeveer equimolaire 15 hoeveelheden asparaginezuur en fenyhlanins-voorloper aanwezig zijn en het laten verlopen van de transamineringsreaktie. De reaktie zal onder omstandigheden worden uitgevoeard die gunstig zijn voor de transaminasewerking.

Eên van de belangrijkste doeleinden-ven deze uit-20 vinding is het verschaffen van een biologische transaminerings reaktie met een in aanzienlijke mate toegenomen celparoduktivi-teit, welke leidt tot groteare opbrengsten van fenylalanine op basis van zowel asparaginezuur als fenylalaninevoorloper.

Het is onder toepassing van dit reaktiesysteem mogelijk de 25 evenredige hoeveelheden voorloper die nodig zijn om de gewenste opbrengst van het parodukt te verkrijgen te verlagen.

Een daarmee verband houdend doel is het bereiden van fenylalanine op een dusdanige wijze, dat een eindprodukt wordt verkregen dat weinig veawntreinigingen bevat, in het 30 bijzonder wat betreft de niet-omgezette fenylalaninevoorloper en niet-ffenylalaninetransaanineringsparodukten, zodat tijd-rovende en kostbare scheidingsstappen vermeden kunnen worden.

Bovendien wordt beoogd dat deze uitvinding de noodzaak voor een gelijktijdige fermentatie en reaktie door 35 scheiding van de celgroei van de van belang zijnde reaktie 8500022 * « t.

- k - opheft.

Een algemeen doel van de uitvinding is het aanzienlijk verminderen van de kosten die gepaard gaan met het bereiden van fenylalanine.

Dè hierin beschreven uitvinding geeft een unieke 5 methode voor het transamineren van een fenylalaninevoorloper tot fenylalanine in hoge opbrengsten op basis van zovel aspara-ginezuur als voorloper, terwijl tegelijkertijd de voorloper geheel wordt verbruikt. Bij deze werkwijze wordt een oplossing toegepast die ongeveer equimolaire hoeveelheden asparaginezuur 10 en fenylalaninevoorloper bevat. Be enzymatische werking van de katalysator kan in sterke mate worden verhoogd indien men microorganismen in aanwezigheid van de voorloper laat groeien.

Microorganismen waarvan men reeds heeft gevonden dat ze bruikbaar bij deze werkwijze zgn zijn: Pseudomonas 15 pseudoalcaligenes. Escherichia coli en Brevibacterium thiogeni- talis. De groep microorganismen die bij deze uitvinding bruikbaar zal zijn zal natuurlijk veel ruimer zijn. Het is te verwachten dat andere stammen van Pseudomonas. Brevibacterium en E. coli eveneens geschikt zullen zijn, hoewel de reaktie-20 snelheden en rendementen waarschijnlijk wat van stam tot stam zullen verschillen. Bovendien kan van elk microorganisme waarvan bekend is dat ze in staat is alle eigen aminozuren te produceren verwacht worden dat ze de bij deze methode vereiste transaminaseverking zulleivertonen. Zo vallen bijvoorbeeld 25 onder bruikbare microorganismen fungi die behoren tot de

Penicilium genus. Bovendien kunnen gemengde culturen van geschikte stammen worden toegepast.

Men heeft gevonden dat microorganismen die in aanwezigheid van niet-remmende gehaien van de fenylalanine-30 voorloper groeien de transaminering van voorloper tot fenyl alanine met een grotere snelheid katalyseren dan indien ze in afwezigheid van een voorloper groeien. Een toename van de omzettingssnelheid (of transaminering) is erg belangrijk, aangezien de voorloper, fenylpyrodruivezuur, in oplossing _ 8500022 - 5 - instabiel is en geleidelijk zal ontleden. Toename van de trans** amineringssnelheid doet de totale produktopbrengst toenemen .worden doordat meer van de voorloper kan/ get rans amineerd^ alvorens ze wordt ontleed. Zo heeft bijvoorbeeld de groei van 5 Pseudomonas nseudoalcaligenes in aanwezigheid van 0,5 g/1 fenylpyrodruivezuur in een systeem geleid tot een opbrengst van fenylalanine van 75 %> in tegenstelling met 59 % voor cellen die opgegroeid zijn zonder voorloper. Men kan de cellen laten groeien met tot ongeveer 10,0 g/liter voorloper, waarbij 10 boven deze concentratie de celgroei schijnt te worden geremd.

Het meest aanbevolen trajekt voor het optimaliseren van de katalysatorverking van de microorganismen ligt tussen ongeveer 0,05 en ongeveer 5,0 g/1 voorloper.

De fenylalaninevoorloper is een o-ketocarbonzuur 15 of een zout daarvan. Het is niet nodig een erg gezuiverde vorm van de fenylalaninevoorloper bij deze werkwijze te gebruiken. Daarentegen is het bij werkwijzen volgens demand der techniek nodig of aanbevolen dat de voorloper wordt gezuiverd, aangezien verontreinigingen de neiging hebben de celgroei en 20 celwerking te beëindigen. Omdat deze uitvinding de celgroei van de van belang zijnde reaktie heeft gescheiden, treedt dit verontreinigingsprobleein hier niet op.

De voorloper kan worden gezuiverd, of kan in een ongezuiverde vorm zijn, zoals een natrium-, kalium- of ammonium-25 hydroxyde hydrolysaat of een zwavelzuurneerslag»

De groeiomstandigheden zullen worden gekozen op basis van de speciale, toegepaste .microorganismen en zullen binnen de ervaring en kennis van een deskundige op dit gebied vallen. Het verdient aanbeveling dat deanstandigheden de 30 snelle groei van gezonde cellen bevorderen, Wordt bijvoorbeeld

Pseudomonas oseudoalcaligenes gebruikt, dan wordt de temperatuur bij voorkeur op ongeveer 35°C tot ongeveer 39°C. en de pH op ongeveer 7»5 gehouden, terwijl roeren en/of aereren voor een aëroob milieu worden toegepast.

35 Volgens een uitvoeringsvorm van deze uitvinding _ - j 8500022 - 6 - 4 wordt het aanbevolen dat de gekozen microorganismen groeien in een milieu dat een complexe of een natuurlijke koolstofbron of bronnen, zoals protexne-extracten, maisweekvloeistof enz. bevat. Met de koolstofbron verschaft in de vorm van peptiden, 5 worden de microorganismen gedwongen de koolstofbron af te breken tot de aminozuurbestanddelen ervan, hetgeen tot de gewenste transaminasewerking leidt. Indien men aan de andere kant microorganismen op een koolstofbron, zoals ethanol, laat groeien, blijkt de transaminasewerking tamelijk laag te zijn.

10 Men laat de microorganismen groeien tot de gewenste celdichtheid. De nauwkeurige groeiperiode en de celdichtheid zijn niet kritisch, omdat de celdichtheid na de groei desgewenst volgens gebruikelijke methoden, zoals door centrifugeren of filtreren, kan worden verhoogd. Een groeiperiode van bijvoor-15 beeld ongeveer i+8 uren zal gewoonlijk tot een bruikbaar aantal cellen leiden.

Daarna kunnen de cellen worden geoogst. Volgens een aanbevolen uitvoeringsvorm van deze uitvinding worden de cellen gecentrifugeerd, gewassen en gedroogd. Voor het op deze 20 wijze verkrijgen van de cellen worden gebruikelijke methoden toegepast. Ze kunnen worden gewassen met elk bioverenigbaar materiaal, zoals een fosfaat of Tris-buffer. De cellen kunnen volgens een gebruikelijke droogmethode, bijvoorbeeld gedurende een nacht in een vacuumoven met een temperatuur van 32°C, 25 worden gedroogd.

Men heeft gevonden dat het gebruik van de bio-katalysator in de vorm van gedroogde celen de stabiliteit van de enzymen verhoogt, vergeleken met natte cellen, met geluidsgolven behandelde cellen enz. Aangezien echter het drogen van de 30 cellen een werkwijzestap aan de totale reaktie toevoegt, is het de bedoeling dat andere celpreparaten kunnen worden toegepast. Volgens een andere uitvoeringsvorm kunnen de micro-organdsnen· voor toepassing bij dese werkwijze worden geïmmobiliseerd in of op een geschikt substraat. De bereide cellen kunnen 35 daarna bij kamertemperatuur of onder koeling worden opgeslagen 8500022 4 * - 7 - totdat ze tij de hierin beschreven transamineringsverkvij ze vordert toegepast.

Het wordt in het algemeen aanbevolen tenminste ongeveer 2,0 tot ongeveer 10,0 g gedroogde cellen per liter 5 substraatoplossing toe te passen. Lagere gehalten aan katalysator maken het mogelijk dat aanzienlijke hoeveelheden van de fenylalaninevoorloper ontleden alvorens ze trans -aminering ondergaan. Het kan daarom venselijk zijn de katalysa-torbelading.van het systeem te verhogen, teneinde zo veel 10 mogelijk voorloper als mogelijk bij de transamineringsreaktie toe te passen.

De aminodonor voor de transaminering van deze uitvinding moet asparaginezuur zijn of zal voornamelijk aspara-ginezuur bevatten. Het is gebleken dat de hoogste fenylalanine-15 opbrengst wordt verkregen indien asparaginezuur de enige amino donor is die in het reaktiesysteem aanwezig is. Bovendien wordt bij gebruik van asparaginezuur als aminodonor oxalo-azijnzuur als een bij.produkt van de transaminering gevormd. Het oxalo-azijnzuur wordt gemakkelijk ontleed tot kooldioxyde en pyro-20 druivezuur. In de hiervoor vermelde stand der techniek,

Bessman, is een spontane ontledingssnelheid van ongeveer -3 1,7 x 10 mol per liter per uur vermeldt. De ontledingssnelheid van het oxaloazijnzuur gevormd door transaminering binnen het kader van deze uitvinding is ongeveer dieWrmeld 25 voor de spontane ontleding. Verwijdering van oxaloazijnzuur uit het reaktiesysteem door ontleding zal de omzetting van voorloper in fenylalanine geheel naar rechts doen verschuiven.

i

Volgens de aanbevol .en uitvoeringsvorm van deze 30 uitvinding wordt een substraatoplossing die ongeveer equimolaire hoeveelheden asparaginezuur en fenylalaninevoorloper in een bio-verenigbare buffer bevat bereid. Binnen het kader van deze uitvinding betekent "ongeveer equimolair" hetzij equimolair, hetzij tot een afwijking van ongeveer 20 % van equimolair.

35 Het verdient echter aanbeveling dat hoeveelheden dicht bij de 8500022 ; v - 8 - werkelijke equimolaire hoeveelheden worden toegepast, teneinde de noodzaak van het scheiden van niet-omgezet asparaginezuur of fenylalaninevoorloper te verkleinen of weg te nemen. Elk bio-verenigbaar oplosmiddel of buffer dat niet het reaktie-5 verloop beïnvloedt ka» worden toegepast en zal het reaktie- systeem in het gewenste pH-trajekt van ongeveer 7»0 tot ongeveer 8,5 houden. Zo bleek bijvoorbeeld ongeveer 0,1 tot 0,5 M fosfaat buff er geschikt te zijn. Het is ook mogelijk de pH te regelen door toevoeging van een pH-regelingsmiddel aan het 10 systeem door &e "benodigde hoeveelheid base aan het systeem toe te voegen teneinde te verhinderen dat de pH zal dalen wanneer kooldioxyde wordt vrijgemaakt als een ontledingsprodukt van het oxaloazijnzuur.

In een geschikt reaktievat worden geprepareerde 15 cellen in contact gebracht met de oplossing van equimolaire hoeveelheden asparaginezuur en voorloper. Het verdient aan-beding dode of.niefc-Je/esvdhaie; cellen, bij voorkeur gedroogde, cellen te gebruiken. Cellen in deze vorm schijnen het voordeel • te hebben van een toegenomen enzymstabiliteit, ten opzichte van 20 natte of met geluidsgolven behandelde cellen of ruwe enzym- extracten. Bovendien gebruiken dode of niet-levensvatbare cellen geen fenylalaninevoorloper. Met geluidsgolven behandelde cellen kunnen eveneens worden toegepast, /men1 zal zich ervan vergewissen dat de membranen van tenminste het grootste gedeelte van de 25 cellen gebroken zijn. BovendieiPèellen in deze vorm gemakkelijker te hanteren, iets stijver en taaier dan andere celpreparaten.

Het kan eveneens wenselijk zijn de cellen onbewegelijk te maken op een geschikt substraat.

De reaktieomstandigheden voor de werkwijze volgens 30 deze uitvinding zullen zodanig worden gekozen dat ze de enzym stabiliteit verhogen. De temperatuur kan variëren van ongeveer 20 tot ongeveer 50°C, bij voorkeur van ongeveer 30 tot ongeveer 1*0°C. De pH kan ongeveer 6,5 tot ongeveer 9»0, bij voorkeur tussen ongeveer 7*5 en ongeveer 8,0, zijn. Het instellen van de 35 _ pH geschiedt bij voorkeur met ammonia of kaliumhydroxyde, 8500022 β » - 9.- welke "beide heb oplossen van de voorloper en. asparaginezuur zullen "bevorderen. De reakbie vereist geen aerering, doch er .zal wat worden geroerd of "beweging van de cellen ten opzichte van het substraat zijn, teneinde de wisselwerking van cellen en 5 substraat maximaal te doen zijn.

Verwacht kan worden dat de transamineringsreakbie in minder dan ongeveer 40 uren., bij voorkeur minder dan 2U uren, voltooid zal zijn indien hoge biokatalysatorconcentraties worden aangewend. Een betere indicator zal echter de specifieke 10 reaktiesnelheid zijn, dat wil zeggen het aantal grammen fenyl- alaninevoorloper dat per gram droge cellen per uur omgezet zal worden. Bij de werkwijze volgens deze uitvinding kan deze indicatorvariëren van ongeveer 0,01 tot ongeveer 10,0 gram geproduceerd fenylalanine per gram droge cellen per uur. Zo kan 15 de specifieke snelheid bijvoorbeeld ongeveer 0,1 tot ongeveer 2,0 g fenylalanine per gram droge cellen per uur zijn.

Het transamineringsbijprodukb oxaloazijnzuur wordt onder deze reakbieomstandigheden gemakkelijk ontleed tot kool-dioxyde en pyrodruivezuur. Het kooldioxyde zal ontwijken indien 20 de reakbie in een open vat wordt uitgevoerd of kan voor opslaan of voor toepassing bij andere werkwijzen worden opgevangen. Aangenomen wordt dat tenminste een gpring gedeelte van het pyrodruivezuur door transaminering of door decarboxylering met asparaginezuur wordt omgezet in alanine. Zo zullen dus zowel 25 pyrodruivezuur als geringe hoeveelheden alanine aanwezig zijn, doch beide kunnen gemakkelijk volgens gebruikelijke schei flings-methoden worden verwijderd.

De biologische transaminering volgens deze uit- j vinding kan tot uiterst hoge fenylalanineopbrengsten ten 30 opzichte van zowel asparaginezuur als de fenylalaninevoorloper leiden. Dit wil zeggen dat 85 % of meerman het asparaginezuur bij de reakbie kan worden getransamineerd en dat 85 % of meer van de fenylalaninevoorloper kan worden omgezet in fenylalanine.

35 Na het voltooien van de reaktie kan het fenylala- 41 _ _ 8500022 - 10 -

i V

nineprodukt volgens gebruikelijke methoden worden gewonnen»

Het winnen en afscheiden zullen onder toepassing van deze werkwijze minder ingewikkeld zijn dan wanneer een gebruikelijke fermentatiewerkwijze wordt toegepast. Het zal door de scheiding 5 van de fermentatie van de transamineringsreaktie niet nodig zijn fermentatiebijprodukten en metabolieten (bijvoorbeeld proteïnen buiten de eellen, lipiden) van de reaktieoplossing af te scheiden. Bovendien levert de werkwijze volgens deze uitvinding minder verontreinigende aminozuurbijprodukten op die moeten worden 10 verwijderd. Aangezien bovendien de transamineringsreaktie tot aan voltooiing wordt uitgevoerd, blijft er geen niet-gereageerde voorloper in de reaktieoplossing achter. Voorbeelden van methoden voor het winnen van het gewenste fenylalanineprodukt zijn ionenuitwisseling en/of gefraktioneerde kristallisatie.

15 In de volgende voorbeelden zijn de hierna volgende afkortingen voor het beschrijven van de uitvinding toegepast : °C graad(en) Celcius g - gramimen) 20 HPLC - onder hoge druk uitgevoerde vloeistof- chromatografie hr - uur (en) 1 - liter(s) M - molair 25 mg - milligram(men) ml - milliliter(s) RPM - omwentelingen per minuut % - percent tris/HCl - tris (hydroxymethyl )-aminomethaan-HCl 30 In de tabellen, die een toelichting geven van de resultaten die in de voorbeelden worden verkregen, worden de selectiviteit, omzetting en opbrengst als volgt berekend: 8500022 * » - 11 - „ , ...... gevormde hoeveelheid

Selectiviteit = a~r—rr—— - gebruikte hoeveelheid

Omzetting __ge^kte hoeveelheid_ 6 hoeveelheid waarvan werd uitgegaan 5 Opbrengst = selectiviteit x omzetting _ gevormde hoeveelheid_ hoeveelheid waarvan werd uitgegaan

Voorbeeld I:

Transaminering onder toepassing van verschillende 10 microbiële katalysatoren

Men liet Pseudomonas nseudoalcaligenes ATCC 12815» E. coli ATCC 13005, E. Coli ATCC 13070 en Brevibacteria thlogenitalis ATCC 31723 groeien en ging als volgt te werk.

Men liet culturen van elke stam 2b uren bij 35°C groeien op 15 schuin geplaatste Trypticase Soy voedingsbodems. Elke schuin geplaatste voedingsbodem werd gewassen met 5,0 ml van een met fosfaat gebufferde, steriele zoutoplossing en de verkregen suspensie werd overgebracht in 100 ml Trypticase sojabonen-cultuurvloeistof in schudflessen van 500 ml. De Trypticase 20 sojabonen cultuurvloeistof werd betrokken van de BEL Division of Becton, Dickinson & Co- De schuin geplaatste Trypticase soja werd verkregen uit 20 g per liter agar en 30 g per liter Trypticase sojabonen cultuurvloeistof.

Men liet de culturen 56 uren bij 35°C en 200 25 omwentelingen per minuut in de schudkolven groeien tot halverwege de groeiperiode^ toen de omwentelingssnelheid onopzettelijk werd verhoogd tot 250. Elke stam werd afzonderlijk geoogst, gecentrifugeerd en gewassen met een zoutoplossing en in een vacuumoven gedurende 12 uren gedroogd bij 32°C.

30 Menberddde een oplossing van 7,6 g per liter gezuiverde fenylpyrodruivezuur (Aldrich Chemical Co., Ine.) en 18 g per liter asparaginezuur in een kaliumfosfaatbuffer en stelde de pH met ammonia in op 7,5· Er wordt opgemerkt dat j bij deze proef geen gebruik gemaakt wordt van de hierin 35 beschreven, ongeveer equimolaire oplossing van asparaginezuur en voorloper. Aan vier 10,0 ml porties van deze oplossing ! i 8500022 « · - 12 - werden 2,0 mg gedroogde cellen per al oplossing van elk van de vier stammen in van een dop. voorziene proefbuizen van 20 ml,/Deeiuiztnd'werden geplaatst in een schudbad met een constante temperatuur van 35°C, bij 200 omwentelingen per 5 minuut. Na 5*8 en 2k uren werden monsters genomen en deze werden door een ferrichloride colorimetrische proef geanalyseerd op fenylpyrodruivezuur (hieronder beschreven) en met HPLC op fenylalanine en asparaginezuur. De resultaten zijn opgenomen in tabel A, waaruit blijkt dat de toegepaste stammen de 10 gewenste transaainaseverking vertonen.

8500022 • « - 13 - n co ο \ο vi ^ W ·ί Ο (Ο Λ Λ Λ CO » f ο\ ο in t— ia ra ·η co -£ ** ο fi omog ^ ^ oj« e ο « « · π ο *°δ ο cn \ο ο -3· ΙΑ cvj Β 3 ο > .sf ΙΑ «- Ο t- W Vi. Ο .

CVJ Ο CVJ Ο CO ^ ^ Ο «Rot— |0 ξ CO Ον Ο ΙΑ t— ΙΑ 1- Λ Μ ο ο ο β ιποχονο W. "W. 10 *0 τ- ιτν ο in GO λ λ λ Q\ Ο 00 Ο τ- cvj ia σ ia t— cn β ®

s II

s β Η « *Γ» -Ρ .η <η ο ο co »% vi > „ β CM CVJ «- CO if gf

3 t— * ~ o m3 *dS

So «- O CVJ CVJ «3- ΙΑ β « & " - 5 *

ό O S

& ¢-1-001¾¾¾¾ 5- « a ci ο o _ S g .,-r cn ·* « ~ .3- Ό £,2 e i- λ w <n -3- 5 § ** i-J ra e ο «η S e 1Λ o ¢- ^ ^ r** β >►- S o cvi cn vo _ ^ ® «ί Cj o R R R on vo Tt U3 < ^ ^ cn o - cn «a cn § § ώ P ° ΙΑ ΙΑ O t- Vi Vi efti'Jj IS β — cn ο cvj _ _ £,¾¾ P-ι flj CO λ λ λ O Μ ϋ fi >* cvi ο\ σ ia C— -=f Ü'Ö*Cf -r- R > .

S s g S | ö o o ia vi +»3β β S η οι ci t- « „ £ « t- -3· o o cn β β 'β B > m w f3 Ti .5 cn <ö > ·<> β β ra ö u ra ·η μ δ β 5 ¢1 u p «J *3 »rf n o cu o >A vi !* β P 5 § (-.««. _ « β -η B 3

o ia j· w t- 'ö -P öp >> H

Ij. cn i— CV] IA r—J 'rl fli Pf ra

B *- a; β s l; Η H

^ ö cj cj ra B* >»

¢)¾ CVJ co 1- Vi Vi >? 3 B £* SS

o ij ia cn c— co β r-t ra ra <u cj u β α „„η f». cn o cj ra ra m o oen»- «— »— oCJ»o m 8 ° t> ja m * i * τ- Μ ·Η * -p 0 β CU <4

o o va vi vi ‘H & m S

IA V0 CVJ CO _ -β ï»· p < ft S

co m cvj -d· vo co cvj cn j^· cvi J—* J—» R—t J<~l »—1 H ι-t H +» < £ £j v. v. \ os jt* ar cn W U O 60P« W<? WWW g-jNj. β ^ cvj cn -ra· f* w t* w fc < Η p dt 5 tU CQ O* S3 CU— Ά'-'

frr O O

8500022

Voorbeeld II

V

\ - 1U -

De groei van microorganismen met voorloper Men liet Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 cellen 2b uren bij 35°C groeien op schuin geplaatste . 5 Trypticase soja·. Voor éên reeks groeimedia ( monster I), waste men elk medium met 5»0 ml van een zoutoplossing en bracht de verkregen suspensie over in 100 ml Trypticase soja-PPA groeimilieu in schudflessen van 1 liter. Trypticase soja - PPA groeimilieu werd bereid met Tripticase soja mais-10 weekvloeistof (BBL Div. of Beet on, Dickinson & Co.) waaraan 0. 5 g/l fenylpyrodruivezuur ( PPA) (Aldrich Chemical Co., Ine.) was toegevoegd. De kolven werden 12 uren geincubeerd bij 35°C en toegepast voor het enten van 500 ml Trypticase soja cultuurvloeistof in schudflessen van 1 1. Voor een tweede reeks 15 schuin geplaatste voedingsbodems (monster II), werd dezelfde werkwijze, zonder toevoeging van PPA,. gevolgd. Men liet de kolven voor zowel monster I als monster II voor het oogsten U8 uren groeien bij 35°C en 200 omwentelingen per minuut. De cellen werden gecentrifugeerd en het celpersstukje werd 20 onmiddellijk gedroogd door het 12 uren in een vacuum-oven bij 37°C te plaatsen.

Men bereidde een oplossing van 18,8 g per liter asparaginezuur en 23,2 g per 1 gezuiverde fenylpyrodruivezuur (Aldrich Co.) in een fosfaatbuffer. De pH werd met ammonia 25 ingesteld op 7,5· Daarna voegde men aan 100 ml porties van deze oplossing 2,0 g per 1 gedroogde cellen van resp, hetzij monster I of monster II toe. De mengsels werden 2b uren geincubeerd bij 37°C en 200 omwentelingen per minuut. Na 5,17 en 2b uren werden porties van 2,0 ml van elk monster 30 genomen en geanalyseerd op de wijze és beschreven in voorbeeld 1. Zoals blijkt uit de resultaten weergegeven in tabel B verhoogt het toevoegen van PPA aan de fermentatiemilieu1 s in aanzienlijke mate de specifieke transamineringswerking van deze microorganismen.

8500022 φ Μ - 15 - m σι <· o on o ooo ooo o o pjo*-o mom o ο σ\ *r r; o cu ooo *- o\ C\ m o c <MO\oo\Ocoeo. · * S *- cu in § § ¢5 on in

C. E O VO O OOO OOO I I

q. y\ o c\l ^ OOO OO IA O O

_i r\j H «*«*** «* ** Λ ^ ^ TT

£ £ ii £ * ^ - <n" ., on on -S I i S' «i VO VO O OQO OOO o o 5 Ew^^oo^o^ot^ ^ t; ίο ._i a, » » » ft ft Λ ft ft 25 ,o 0C <nont-jnvO£noon.£_ on vo H O§ T- co co t- o\ o t- oTj- ft a ft § _ w 3 •g 60 “ < on on 3

PtlUt-CUOCOOOOOOOO i I « ^o^ wovcnoot-o or- ο o oj Λ g Μ * * Λ Λ IV * Λ Λ *“* Η ίβ Scoco^ ιλιλοο r-j*o\ 23 /5 *d 5

Sww_t_vo-irovinj3· on in 3 3 J> ., K * Λ ft x p 2 * f CM x> CJ ·Η

'£ P ö S

I ««« ««« ΐ ^ & 'Ö 5 i§ i«ö*-mvo α o -a· o o ci ο o ft «J «» 5 nj ^ » "· «* « ** » * Λ Y* Γ" d μ n μ E w ^ to ooooo onot- X X >> g £» C. w 1; r 04« c 4 on cm o £ft ö IV |v QJ 5J Q) in ί-c eJ V-r C p!j ^%¾%¾¾¾%¾¾¾¾ <p <n κ*^ M^CMCOmOOCM Ο Ο CM Ο Ο <ί Ot

He* »· iv λ ü iv » λ iv λ t- ill CO W

3 § ID W J ,4-σσν Ot-CM X X Pt < S3 in $ - - vo m ft- vo on Cl ** cm in < ft £ „ t „ H < ¢4 &t £ & £ ^ h /·% v* sy N*. V v < » At W O o H §; R .¾ ^ S 60 60

«Wft-ft 4J —' — ^ I

'jij?» *5^ βΙβ'ϋΙΐΌίί 3 3 3 SS £ *45 £ ö «w «Η r-CMCnSiSS'SSSp+Sot g ê i 3 I & S * 3 s E < K co o o ca ö o ui'-' cQ—ft " · *♦ "*· »*· -* mt" 4 ' , .

8500022

V

* \ - 16 -

Voorbeeld III

Toegenomen kat alysat orbelading

Men verkreeg gedroogde Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 cellen volgens de methoden beschreven voor. monster 5 I in voorbeeld II. Men bereidde een oplossing A, die 25 g/1 fenylpyrodruivenzuur (Aldrich Co.) en 20 g/1 asparaginezuur in een fosfaatbuffer tot een concentratie van 0,15 M bevatte.

De pH werd met ammonia ingesteld op ?,5. Men bereidde eveneens een oplossing B die 20 g/l fenylpyrodruivenzuur en 16 g/1 10 asparaginezuur in een fosfaatbuffer tot een concentratie-van 0,12 M bevatte., waarbij de pH met ammonia was ingesteld op 7,5·

Men voegde gedroogde cellen aan deze oplossingen in een concentratie van resp. 5*0 g/1 en 2,0 g/1 toe en incu-beerde onder de in voorbeeld II vermelde reaktieoostandigheden 15 gedurende 2k uren. Men analyseerde monsters bij 5 en 2k uren zoals beschreven in voorbeeld I. Zoals blijkt uit de resultaten vermeld in tabel C, leidde de toegenomen katalysatorbelading tot toegenomen opbrengsten.

20 8500022 4R Ji* - IT - d ΐ c 3 S mm *—- n

hocooo o o o o o o II BS

« o j- ιλ w o o o ooin ° ° 3 .S

Ο CU Ο Ο ΙΛ Ο ΙΛ Ά 5 ^ ^ SSP

« cu co ο co m co ο oo Sr

Sm - uC .3 3 § SP & : & * WH g* d e * 60 S m m H co 3 o m o cu o o o o o o l I * « o cu m o o o o in cm o o u o f) A A A A Λ A A Λ A * ^ TT , _

O O -3* O ΙΛ O IA Ό CO J· X K 'O

^ CJ CJ J o t- [- (Λ ¢- CO^ VO^ *“< n. T- m ··* P< cu < p<

Pt

P« H

— H W

s cu, “ °i •g ij om ra ö Η K w "'%vlmcu Si Si 5 assss sss sss'o'o « « | ·Ϊ5^» ÜS5 f«ï Si ïï

o ·Η g «Λ ft Pt P

H 5 § ° ° g « rc s ï ·§ § .

I o* o* I 11

fi fl “ “I m. °L σ. °. “Ï °. °. 2 S S -S S

I S-opmogoi'ggS'SXjt ai U1 K flj 4J ö Pt Ö S, W H H « 2 .« “ Η Η ^ Λ Vf

S « «J

ö O O IT IT K

' *-< 60 S& «C ft w ö ö ft CQ w QJ o CU lA h <! (k Η H »· (\l (O 4 ΙΛ o <u ^ o o P< & S3 ? S“

Ct —. -vl ^ η b W < Η ft 3 3 g _ & f _ $ § ^ < H fc S S ·|Ρ — 4 f. « -S3? _ _ _ ^ 'ÖÜ ϊί£ί ss

SSi 3 3 · .£ -S 8> £ .s I I

1 ö+jjad-P-PcjeiW

•H o+sp o S t> ΛΛ

m^J-irv Ö « e jj- « e h H H

S^S^ alo koo ο» j 8500022

V

\

Voorbeeld IV: - 18 -

Amino-donors.

Men verkreeg gedroogde Pseudomonas nseudo-alcaligenes ATCC 12815 cellen volgens de methoden beschreven 5 voor monster I in voorbeeld II. Men bereidde drie reagens- oplossingen, waarvan elk 16,1»· g/l fenylpyrodruivenzuur (Aldrich Chemical Co., Ine.) in fosfaatbuffer bevatte.

Oplossing I bevatte 13,92 g/l asparaginezuur, terwijl oplossing II 15,83 g/l glutaminezuur bevatte. Oplossing III bevatte 10 6,68 g/l asparaginezuur en 8,78 g/l glutaminezuur. Men t ; voegde aan elke oplossing 2,0 g/l gedroogde cellen toe en incubeerde het mengsel onder de in voorbeeld I vermelde reaktie- l omstandigheden gedurende 26 uren. De monsters werden zoals beschreven in voorbeeld I op 5 en 26 uren geanalyseerd. Uit 15 de resultaten vermeld in tabel D blijkt dat uitstekende opbrengsten worden verkregen indien asparaginezuur de enige aminodonor is.

8500022 - 19 - o a ? 1 ° 3

§ V*. Vt Vi. Vk -%¾ -¾¾ X H

Ö ^ CO ?- cü S o o o o σ o o\iA o vo p 5 ou«“ «- - · * * « · * * “ * " | |o,«^ go n g £ 5 I» S ^ g § \%vkv.vs.vk«vk^vk2p a\ O σ\ <3\ O O CM OO O o -af ^ Jü ^ η) \0 j » » . » C\CM -af OO O ΟΙΛ -af "

U CM Ü OJ O -=f O -CM 00 ° tT

co 5 » | p«—>

v O CO O — Η Η H « W «O gH

6 m " °. ° cn CM VO O «3 - OO O X go

5 2* »- on o j- o\ c\ co ent- o 'o 'd B

0 ?5 L

.3 n ?3 •Pt I f4 §

60 ‘o M'C

f* *-i M

fe *3 x is

Pt ë O VO VO O ^ Vk 6% 6% Vk v*. « « ** ï£ ^

§ W “IS. °Ί IA 03 CO O σ\ C\ -o IA«^S

! lü»®' - - s ' « " « » « VkVkVk ^vivtio·

ι-t p o o o cm o o cn o o o ^ ^ * I

w IA * CM- - OO o vo - ^ W g S SrfOlAO-- <Λ o c eg*-*· -5 . S m ώ o co α _=s- ^ w >% h « w -6¾¾%¾¾ i g *§g ^ **. " °. -af O t- t-- o OO O - 8 V I <4 OO CM O CM cn J- — CM £e 1Γ" «i aj w ^ * >· J-J Pt u j o co co o 3

5 tf at VO t- O rtP

bi Of vo VO co o «.

I„s - i 1 « n -pp o o cn o g P o -af O 00 o £ —Γ O iJ Λ Hf iv Λ »7 tt) 3 VO Ο IA O "p ·>

OJ X

>- O CM o o P

P4 -af Oi O o b

g S3 w en o" o* I

g ‘ 'JT* c* g .5 -p S -p 2 -S ü SP ·£ £ ü d « 3 * 6 f-f p-l P-l r-l -* < ttf 4» < Sfc 60 -P P» *r+ P 60 -P P IA < O- >? -vZ -sZ >Qi e CT P-t £>► CQ P « CQ >r-t c g, t-3 T3 P* §* ^ ^ WJ UI <ïtS »3 60 Pt ‘r( < Ή 60<ξ -rf O ‘Pt 60 o ·Η Pt zi Jz Jz -___ ___ oa-ïT jj +>^ +ï S -P ^ -P g — v OW -p OW OW-P Öw o W -p J) g Λ

_ -I (n —. *t S 4) u- 3 t> κ t) it s 4t S o R W H

< WPt E> "w hKn^ïS rifc I igfc r-j p* N P Pt O

slis r Ir s 8~ s- & Sr & 8500022

Voorbeeld V

- 20 - \' - \

Gedroogde resu. natte celnrenaraten Men liet volgens de methoden beschreven voor ! monster I in voorbeeld II Pseudomonas Pseudoalcaligenes ATCC

5 12815 groeien. De cellen werden geoogst en een gedeelte werd door centrifugeren geconcentreerd en daarna gedurende 12 uren in een vacuumoven bij 35°C gedroogd. Men bereidde een 0,12 equimolaire oplossing van fenylpyrodruivenzuur (l9»8g./l) en asparaginezuur (16,0 g/l) in een fosfaat buff er (pH 7 >5) 10 en bracht porties van 100 ml in twee vaten van 0,2 1 waarvan de temperatuur werd geregeld (37°c)en waarin werd geroerd (150 omwentelingen per min O. Aan êên vat voegde men 2,0 g/l gedroogde cellen toe, terwijl men aan het andere vat natte cellen op basis van 2,0 g/l van het gewicht van droge cellen 15 (85 % vocht) toevoegde. De reaktiemengsels werden 18 uren geincubeerd. Van de vloeistof werd na 5»5 en 18 uren monsters genomen en deze werden geanalyseerd, zoals in voorbeeld I, op fenylalanine, asparaginezuur en fenylpyrodruivenzuur.

De in tabel E weergegeven resultaten laten zien dat gedroogde 20 cellen hogere opbrengsten en een grotere selectiviteit geven.

8500022 - 21 - β 4} β> on ο »- t- cu -¾¾.¾¾¾¾ ****** 1 ο cu on o m .»»\ονο<η^·ΐΛθΐ «τ

43 t— CV1 -3“ C\ N CO CO b- X

_r> -Sf *5 Λ a w § a ^ s

H

CO O *- o ο on

<ö o -=r co -¾¾¾¾¾¾ -¾¾¾¾¾¾ I

6C O C\ VO _ _ ° ο Λ Λ «< 1Λ Ο 1Λ <X)Lr\_S· *~

O O CU \D CO O co C\ co CO X

h * «w 5¾ a

V

rH

ri flj λ o σ\ o cu ___cp

e cuonvo »«« «η» I

So·»'*"· _ o j3 jS co O _3- ocoon ιλτ-ο 7»

g 5 ^ 5 m oi vo on cu X

Sao vo

I § a w’ I

-|53 ' !s 5 5’ s ‘o $ S -5

af tj o CU O CU „ C> ö S

^öS**1* m >» te h ΟΟΟτ-ΙΛ »»ί-ο\ coo\co " ft o o . o *“ 1Λ IA Μ (Λ « CU (O r-f i-j r-f £ £ - £ Λ £ ^ O β „o w o v tq o «Μ ar vt o h if » ir

Λ o < ft H

o ft co w O ft < ft

hO

o *— cu on h Λ —«tί < ft „„ e« 2? 5° ft < ^ i η" <1*1 ft 3 S<$ | ” +> ft ^ +3 ÖO P ft *r+ *—' ft «ri < ft —i *-+-**. «J ^ o ^ ' s ¢1 «id .·$*>+> 5 ~ 3 33 £ -5 ft £ .5 ft .¾

+3 -P β 4> +J β O

0+3 0 0+3 0 Λ

r- οι on oot» «or+H

< ft W Η μ £ H N ,α o ftma « s ft. o S Pf a ft 4 ft ca o o ca o o ca _ ___j 8500022 - 22 -

Colorimetrisch onderzoek met ferrichloride van | het natriumzout van fenylpyrodruivenzuur_

Principe: Fenylpyrodruivenzuur (PPA) vormt met ferri-ionen een groen complex. De intensiteit van de groene 5 kleur is evenredig met de aanwezige hoeveelheid PPA.

Reagentia: 1) Ontwikkeloplo s s ing - (1000ml) - Men mengde de volgende bestanddelen en koelde in een ij shad af tot kamertemperatuur. Men voegde de inhoud toe aan een volumetrische 10 kolf van 1 1 en vulde het volume aan met gedeioniseerd water.

Bestanddelen: 0,5 g FeCl^.éHgO, 20 ml ijsazijn, 600 ml dimethylsulfoxyde en 200 ml gedeioniseerd water.

2) Na-PPA standaardoplossing (10 g/l).

Men voegde 500 mg Na-PPA-HgO (Aldrich Chemical 15 Co., Ine., 98 % “ 100 % zuiver) hij 3^°C toe aan Ho ml van een 0,1 M Tris-HCl buffer (pH 8,0). Men roerde totdat alles was opgelost. Daarna bracht men de oplossing in een volumetrische kolf van 50 ml en vulde het volume aan met Tris/HCl buffer. Het mengsel werd in een koelkast bewaard.

20 Voor een 0,.1 M Tris/HCl buffer: Men voegde toe 900 ml gedeioniseerd water aan 12,11 g Tris, stelde de pH met HC1 in op 8,0, goot uit in een volumetrische kolf en voegde gedeioniseerd water toe tot 1000 ml.

Ij kingskromme: 25 Men voegde de Na-PPA standaardoplossing en I4.,95 ml van de ontvikkeloplossing toe aan glazen spectrofoto-aeterbuizen. Men mengde onder roeren, waarna men precies 10 min. liet staan (met de tijdwaarneming wordt begonnen bij het toevoegen van de ontvikkeloplossing aan de eerste buis).

30 Daarna werd de optische dichtheid (0D) bij 6^0 nm opgenomen.

Men maakte de Na-PPA.HgO de standaard ijkkromme (de vertikale as is de absorptie, terwijl de horizontale as het aantal mg Na-PPA.HgO/ml DS is).

8500022 - 23 -

ΙίΑ-ΡΡΑ standaard mg Na-PPA.ELO

_________________ per ml DS_ 5 pl 0,01 10 pl 0,02 15 pl 0,03

20 pl 0,0U

25 pl 0,05 30 pl 0,06

Berekening:

Ka-PPA.Ho0 - OD x 100 x Terdunninfi- (mg/ml) 2 helling van standaardkromme PPA (tz/l) * _OD x 100 x verdunning x 16k.16 helling van standaardkromme 20h,\è ] 8500022

Claims (31)

1. Werkwijze voor het bereiden van L-fenylalanine, met het kenmerk, dat men a) microorganismen die in staat zijn een fenyl- 5 alaninevoorloper in hoge opbrengsten te transamineren tot L-fenylalanine uitkiest en prepareert, b) een oplossing bereidt die asparaginezuur als enige of overwegende aminodonor.bevat, c) een oplossing bereidt die een fenylalanine- 10 voorloper bevat, d) Deze geprepareerde microorganismen'en de oplossingen verkregen van de stappen b) en c) op dusdanige wijze met elkaar in contact brengt dat ongeveer eqüimolaire hoeveelheden asparaginezuur en fenylalaninevoorloper. aanwezig zijn, 15 onder omstandigheden die gunstig zijn voor de transaminase- werking, en e) de transamineringsreaktie laat verlopen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de genoemde microorganismen kiest uit de groep die

20 Pseudomonas. E. coli, Brevibacteria en Penicilium omvat.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men als microorganisme Pseudomonas pseudoalcaligenes, ATCC 12815 toepast. U. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk. 25 dat men genoemde microorganismen laat groeien in aanwezigheid van niet-storende gehalten aan fenylalanine.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat genoemde microorganismen zijn gegroeid in aanwezigheid van ten hoogste ongeveer 10,0 g per 1 van genoemde voorloper.

6. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat genoemde microorganismen. zijn gegroeid in aanwezigheid van een complexe koolstofbron.

7· Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat genoemde microorganismen zijn verkregen door drogen. 8500022 -¾ — J* - 25 -

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als genoemde fenylalaninevoorloper fenylpyrodruiven-zuur gebruikt.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met bet kenmerk. 5 dat dit fenylpyrodruivenzuur wordt gezuiverd of een natrium-, kalium- of ammoniumhydroxyde hydrolysaat of een zwavelzuur neerslag is.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, met bet kenmerk, dat men stap d) uitvoert bij een temperatuur van ongeveer 20 10 tot ongeveer 50°C en een pH van ongeveer 6,5 tot ongeveer 9»0.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat men de temperatuur tussen ongeveer 30 en ongeveer 1*0°C en de pH tussen ongeveer 7,5 en ongeveer 8,0 houdt.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk. 15 dat het oxaloazijnzuur dat door de transamineringsreaktie van stap e) wordt verkregen in situ wordt ontleed.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met bet kenmerk, dat ontleding van dit oxaloazijnzuur spontaan plaats vindt. 1¾. Werkwijze volgens conclusie 1,met het kenmerk, 20 dat de fenylalaninevoorloper tijdens de reaktie geheel wordt verbruikt.

15. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de L-fenylalanineopbrengst tenminste 90 tot ongeveer 100 % bedraagt.

16. Werkwijze voor het doen aflopen van de trans- aminering van de fenylalaninevoorloper tot L-fenylalanine, met het kenmerk, dat men a) een biologische katalysator ter uitvoering van de transamineringsreaktie toepast. 30 b) asparaginezuur als de belangrijkste aminodonor gebruikt en c) het oxaloazijnzuur transamineringsbijprodukt uit het reaktiesysteem verwijdert.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, 35 met het kenmerk, dat de biologische katalysator cellen bevat 8500022 ./ V * - 26 - rr die worden gekozen uit de groep waaronder Pseudomonas, E. coli, Brevibacteria en Penicillum vallen.

18. Werkwijze volgens conclusie 17» met het kenmerkT dat de genoemde cellen van de Pseudomonas 5 nseudoalcaligenes ATCC 12815 stam zijn.

19· Werkwijze volgens conclusie 17» met het kenmerk, dat de genoemde cellen dood of niet-levens-vatbaar zijn.

20, Werkwijze volgens conclusie 19» 10 met bet kenmerk, dat de genoemde cellen zijn geoogst en gedroogd.

21, Werkwijze volgens conclusie 17» met het kenmerk., dat de transaminasewerking van de katalysator is verhoogd door deze cellen te laten groeien in een milieu dat niet-remmende gehalten fenylpyrodruivenzuur bevat.

22. Werkwijze volgens conclusie 21, met het kenmerk, dat maximaal ongeveer 10,0 g fenylpyrodruivenzuur per liter groeimilieu aanwezig zijn.

23. Werkwijze volgens conclusie 17» met het kenmerk, dat een overmaat biologische katalysator wordt 20 toegepast om de reaktie te doen aflopen. 2k. Werkwijze volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat de concentratie van biologische katalysator tussen ongeveer 2,0en ongeveer 10,0 g per liter ligt.

25. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, 25 dat men asparaginezuur als enige aminodonor toepast.

26. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat men de verhouding van asparaginezuur tot fenylalaninevoorloper in het transamineringsreaktiesysteem op ongeveer equimolair houdt.

27. Een verbeterde werkwijze voor het biologisch transamineren van asparaginezuur en een fenylalaninevoorloper die tot de vorming van L-fenylalanine leidt, met het kenmerk, dat men dode of niet-levensvatbare microorganismen die in staat zijn tot transaminering in contact brengt met een oplossing 35 of oplossingen die ongeveer equimolaire hoeveelheden asparagine- 8500022 _ ___, ———————a——— - 27 - zuur en een fenylalaninevoorloper "bevatten.

28. Werkwijze volgens conclusie 27» met het kenmerk» dat de genoemde fenylalaninevoorloper fenyl-pyrodruivenzuur is.

29. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat dit fenylpyrodruivenzuur wordt gezuiverd of een natrium-, kalium- of ammoniumhydroxyde hydrolysaat of een neerslag verkregen met zwavelzuur is.

30. Werkwijze volgens conclusie 27, 10 met het kenmerk. dat men de genoemde mioroorgaaismen kiest uit de groep die Pseudomonas, E. coli, Brevibacterium en Penicillum omvat.

31. Werkwijze volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat genoemde microorganismen zijn gegroeid 15 in aanwezigheid van niet-remmende gehalten van de fenylalanine voorloper.

32. Werkwijze volgens conclusie 31, met het kenmerk, dat de genoemde microorganismen zijn gegroeid in aanwezigheid van maximaal ongeveer 10,0 g per liter van genoemde voorloper. 20 33· Werkwijze volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat de genoemde microorganismen zijn gegroeid in aanwezigheid van een complexe koolstofbron. 3^. Werkwijze volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat genoemde microorganismen zijn verkregen 25 door drogen.

35· Werkwijzen als "beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden. / Z^8500022