JPS62205781A - シユ−ドモナス属菌株の培養方法 - Google Patents

シユ−ドモナス属菌株の培養方法

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JPS62205781A
JPS62205781A JP61044122A JP4412286A JPS62205781A JP S62205781 A JPS62205781 A JP S62205781A JP 61044122 A JP61044122 A JP 61044122A JP 4412286 A JP4412286 A JP 4412286A JP S62205781 A JPS62205781 A JP S62205781A
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JP61044122A
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Mitsunobu Shimazu
光伸 島津
Fujio Endo
遠藤　富士男
Hideaki Yugawa
英明 湯川
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/874—Pseudomonas
    • Y10S435/877—Pseudomonas putida

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はアミノ酸ラセマーゼを含有する微生物の培養方
法に関する。
（従来の技術と課題） アミノ酸製造法において、有機合成法で得られるアミノ
酸は、通常ＤＬ体であり、Ｌ体もしくは０体のみを製造
する場合には光学分割などの方法を用いなければならな
い。その場合、目的の光学異性体ではないアミノ酸を再
びＤＬ体にもどす必要がある。又、Ｌ−システィン、■
、−チロシン。
Ｌ−トリプトファン等のし一アミノ酸を醗酵法で製造す
る場合、基質としてＤＬ−セリンを用いると、未反応Ｄ
−セリンが反応系にＮｌｌ１するため工業的製法として
は、残存するＤ−セリンをラセミ化して再び反応系に戻
す必要がある。このように、有機合成法で安価に製造し
うるＤＬ−アミノ酸の利用にはラセミ化工程が必要とな
る場合が多い。
一方ラセミ化方法としては、熱処理などが知られている
が、目的アミノ酸の熱分解が生じ、工業的製法において
は、収率、純度低下などの問題がある。
しかしながら酵素によるラセミ化は、常温常圧反応であ
り、目的アミノ酸の分解はみとめられず工業的に優れた
方法である。
このような、ラセミ化を触媒する酵素の例として、シュ
ードモナス・プチダ（ＩＦＯ１２９９６）が有する、ア
ミノ酸ラセマーゼがある。このアミノ酸ラセマーゼに対
して芳香族アミノ酸、β−メチル基が１換を受けた構造
を持つアミノ酸（例えばイソロイシン、バリン、スレオ
ニン）　は基質とならないが、その他多くのアミノ酸例
えぼリジン、アルギニン、メチオニン、アラニン、セリ
ンなどは、基質となり、ラセミ化を受ける。
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ　　ＣｏｍｕｎｉｃａＬｉ
ｏｎ　　Ｖｏｌ　　３５．Ｎｏ、３，３６３〜３６８　
（１９６９）　　生化学　第４６巻第５号２０３〜２２
３　（１９７４））この性質を利用して、ＤＬ−セリン
を基質の一つとして、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システ
ィン、Ｌ−チロシンを製造する場合のラセミ化反応にも
応用できる。しかしながら本酵素は、通宝菌体内には、
微量しか含まれておらず、本酵素を工業的規模で、使用
しうるには、酵素活性（ｆｆ１位時間、単位苗体当たり
のＤ−又はＬ−アミノ酸のラセミ化部）の高い菌体を、
高収量で得る培養方法が強く望まれている。
従来ラセマーゼ能を有する菌株の培養方法は、余り知ら
れておらず、僅かに特開昭５８−２０１８７号に開示さ
れた方法があるだけである。
この方法は、その酵素生成がグルコースを炭素源とする
場合に阻害を受けることに着目し、グルコース濃度を１
％以下に保ちながら培養をおこなうものである。しかし
ながら、グルコースを炭素源としている限りいくら低濃
度であってもこの問題を基本的に避けることはできない
、さらに、グルコース濃度を１％以下に制限することは
、工業的には非常に煩雑である。そこで本発明者らは、
グルコース以外の炭素源を広く探索したところ、グリセ
ロール、エタノール、乳酸、酢酸、クエン酸、フマール
酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸よりなる群より選ばれ
た１種又は２種以上を主たる炭素源とした場合には、高
活性の菌体を煩雑な制限をすることなしに高収量で得ら
れることを見出し本発明を完成した。
（発明の構成と効果） 本発明の要旨は、シュードモナス属に屈しアミノ酸ラセ
マーゼを含有する微生物を培養する際に炭素源としてグ
リセロール、エタノール、乳酸。
酢酸、クエン酸、フマール酸、Ｌ−リンゴ酸、コハク酸
、酒石酸よりなる群より選ばれた１種又は２種以上を主
たる炭素源として使用することを特徴とするシュードモ
ナス属に属しアミノ酸ラセマーゼを含有する微生物の培
養方法である。
本発明に供する主たる炭素源としては、グリセロール、
エタノール、乳酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマー
ル酸、し一すンゴ酸、酒石酸がある。このうちグリセロ
ール、エタノール及び酒石酸が特に好ましい主たる炭素
源である。
又、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等のアンモ
ニウム塩、及びアンモニア、さらに硝酸カリ、硝酸ナト
リウム、Ｖ１酸アンモニウム等の硝酸塩、グルタミン酸
、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン等の有機
窒素などが適当であり、無機物としては、リン酸カリウ
ム、硫酸。
マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト。
カルシウムの硫酸塩または、塩酸塩などが用いられ、成
長促進物質としては、サイアミン、ビオチン等のビタミ
ン類、メチオニン、システィン等のアミノ酸、あるいは
これら全部若しくは部分的に含有する酵母エキス、ポリ
ペプトン、肉エキス。
コーンステイープリカー、・カザミノ酸等が用いられる
。培養温度は、１０〜４５℃好ましくは２５〜４０℃の
範囲であり培地ｐ）（は３〜　ＩＯ好ましくは、５〜９
の範囲である。培養中のｐｓ変化がある場合にはアンモ
ニア、苛性ソーダ、苛性加用などで上記の範囲で一定に
保持することが望ましい。
更に培養は好気的条件下で行い、培養中の溶存酸素が律
速因子とならないように、通気攪拌をすることが望まし
い。
実施１列　　　１ ポリペプトン１０ｇ、肉エキス１０ｇ、ＮａＣ１５ｇ　
、　蒸留水１０１００Ｏ，ｐＨ７，２の培地１００ｍ１
を５００ｍ１容三角フラスコに分注し、１２０℃１５分
間滅菌処理した。この培地にラセマーゼ生産菌である、
シュードモナス・プチダＩＦＯ１２９９６）を１白金耳
量植菌し、３０℃で１５時間振盪培養をｊテった後、こ
の培養物を１ｍｌを表１に示す各培地１００ｍ１に植菌
し３０℃で２０時間培養を行った。
該各培養物の４０ｍ１から遠心分離（６，００Ｏｒｐｍ
、　　　１５分間９４℃）により集菌し、該集菌菌体を
Ｏ，ＩＭリン酸Ｕ所液（ｐＨ８，０）４０ｍ１にて１度
洗浄後、同緩衝液の４ｍｌに懸濁する。菌体懸濁液を超
音波破砕機（プランラン２００型）により破砕した後、
遠心分！９！Ｉｔ（１２，０００ｒｐｍ、４０分間、４
℃）により上Ｉｎを分離し、これを粗酵素液とし、さら
に該粗酵素液中のセリン分解活性を抑制させるため、−
２０℃にて２４時間凍結保存させた。
表　　１ に２ＨＰＯ４７ｇ ＫＨ，ＰＯ４２ｇ （ＮＨ４）２　ｓｏｔ　　　　Ｉｇ Ｍｇ　ＳＯ＋　７　Ｈ２００−１８ トリプトン（Ｄｉｒｃｏ）Ｉｇ 主炭素源＊　　　　　　　　　　１５ｇ蒸留水　　　　
　　　　　１０００ｍ１００Ｏ，０ 水生炭素源はグリセロール、乳酸、エタノール。
酢酸、クエン酸、フマール酸、リンゴ酸、コハク酸、酒
石酸又はグルコース 表　　２ １００ｍＭ　　）リス（ヒドロキシメチルアミノメタン
） １００ｍＭ　　Ｄ−セリン ０．０４ｍＭ　　　　ピリドキサール５リン酸ｐＨ８，
０の水溶液 表２に示す反応液４．５ｍｌに各々の主炭素源を用いた
培養で得られた前述の粗酵素液の０．５ｍｌを加え３７
℃３０ｍ１ｎ反応させた後、反応液中のセリンの旋光度
変化を旋光針（日本分光ＤＩＰ３６０型）を用い、酸性
条件下で測定し、更に全セリン濃度をＨＰＬＣにて測定
し、Ｄ−セリンからのＬ−セリンの生成量を求めその結
果よりグリセロールを主炭素源とした場合の活性を１０
０として表３を作成した。又、酵素液中のタンパク質濃
度は、Ｌｏｗｒｙ等の方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ。
ｃｈｅｍ、１９３　２６５　１９５１）に従い求めた。
表　　３ 主炭素源　　　　　　　　　　　　　相対活性グリセロ
ール　　　　　　　　　　　　１００エタノール　　　
　　　　　　　　　　　　９７乳酸　　　　　　　　　
　　　　　　　　　６０酢酸　　　　　　　　　　　　
　　　　　５８クエン酸　　　　　　　　　　　　　　
　　　６０コハク酸　　　　　　　　　　　　　　　　
７゜フマール酸　　　　　　　　　　　　　　　７ＩＬ
−リンゴ酸　　　　　　　　　　　　　　５０酒石酸　
　　　　　　　　　　　　　　　９０グルコース（対照
）３５ 実施例　２ 実施例１の表２におけるＤ−セリンをＬ−メチオニンに
変え他は実施例Ｉと同様の操作で実施し得られた結果を
実施例１の場合と同様グリセロールの活性を１００とし
て表４に示した。
表　　４ 主炭素源　　　　　　　　　　　　相対活性グリセロー
ル　　　　　　　　　　１００エタノール　　　　　　
　　　　　　　　９８乳酸　　　　　　　　　　　　　
　　　　６２酢酸　　　　　　　　　　　　　　　　５
９クエンｆｌｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　６
２コハク酸　　　　　　　　　　　　　　　７５フマー
ル酸　　　　　　　　　　　　　７３Ｌ−リンゴ酸　　
　　　　　　　　　　　５１酒石酸　　　　　　　　　
　　　　　　８９グルコース（対照）３６ 実施例　３ 実施例１の表２におけるＤ−セリンをＬ＋＋Ｊジン塩酸
塩に変えた他は同実施例と同様の操作で実施した結果を
実施例１の場合と同様グリセロールの活性を１００とし
た相対活性で表５に示した。
表　　５ 主炭素源　　　　　　　　　　　相対活性グリセロール
　　　　　　　　　１００エタノール　　　　　　　　
　　　　１００乳酸　　　　　　　　　　　　　　　　
６４酢酸　　　　　　　　　　　　　　　５９クエン酸
　　　　　　　　　　　　　　６３コハク酸　　　　　
　　　　　　　　　７９フマール酸　　　　　　　　　
　　　　７５Ｌ　−リンゴ酸　　　　　　　　　　　　
５５酒石ｒ！１　　　　　　　　　　　　　　　９８グ
ルコース（対照）３３ 実施例　４ ポリペプトン１０ｇ、肉エキスＬｏｇ、ＮａＣ１５ｇ、
ｇ留水１０１００Ｏ、ｐＨ ７，２の培地１００ｍ１　　を５００ｍ１容三角フラス
コに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理した。この培
地にラセマーゼ生産菌であるシュードモナス・プチダ（
■Ｆｏ　　１２９９６）を植菌し、３０℃で１５時間培
養を行った後、この培養物２ｍｌを上記培地１００ｍ１
に植菌し、３０℃で１５時間培養を行った。
さらにこの培養物を表６に示す培地１リツトル（いわし
や製２リットル　ジャーファーメンタ−）に植菌し６０
０ｒｐｍ、ｌｖｖｍ、３０ｔにて２４時間通気攪拌培養
した。なおｐＨは必要に応じて２５〜２８％アンモニア
添加にて７．２前後に調整した。
表　　６ に２ＨＰ０．７ｇ ＫＨ２ＰＯ４２ｇ （ＮＨ４）２　ＳＯａ　　　　　１ｇ Ｍｇ　ＳＯ４・７　Ｈ２００，１ｇ トリプトン　　　　　　　　　　　　１ｇ酵母エキス　
　　　　　　　　　　１ｇグリセロール　　　　　　　
　　２０ｇｐＨ７，０ 該培養物の１０ｍ１　　から遠心分離（６，０００ｒｐ
ｍ、１５分間、４℃）により集菌し、該集菌菌体を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）４０ｍｌにて１度洗浄
後、同緩衝液の２ｍｌに懸濁する。該菌体懸濁液を超音
波破砕ＩＪｌ（プランラン２００型）により破砕した後
、遠心分離（１２゜ｏｏｏｒｐｍ、４０分間、４℃）に
より上清を分離し、これを粗酵素液とし、さらに、該粗
酵素液中のセリン分解活性を抑制させるため、−２０℃
にて２４時間凍結保存させた。
セリンに対するラセマーゼ活性の測定は、実施例１と同
様の操作で実施した。又表６における炭素源をグルコー
スに変え他はこれと同様の操作を施したものを対照とし
た。以上の結果を次の表７に示す。
表　　７

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）シュードモナス属に属しアミノ酸ラセマーゼを含
    有する微生物を培養する際に炭素源としてグリセロール
    、エタノール、乳酸、酢酸、クエン酸、フマール酸、Ｌ
    −リンゴ酸、コハク酸、酒石酸よりなる群より選ばれた
    １種又は２種以上を主たる炭素源として使用することを
    特徴とするシュードモナス属に属しアミノ酸ラセマーゼ
    を含有する微生物の培養方法。
JP61044122A 1986-03-03 1986-03-03 シユ−ドモナス属菌株の培養方法 Pending JPS62205781A (ja)

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