JPH02124087A - シユードモナス属細菌の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は低基質特異性のアミノ酸ラセマーゼを含有する
微生物の培養方法に関する。

（従来の技術と課題） アミノ酸製造法において、有機合成法で得られるアミノ
酸は、通常ＤＬ体であり、Ｌ体もしくは０体のみを製造
する場合には光学分割などの方法を用いなければならな
い。その場合、目的の光学異性体ではないアミノ酸を再
びＤＬ体にもとす必要かある。また、Ｌ−／スティン、
Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等のＬ−アミノ酸を
醗酵法で製造する場合、基質としてＤＬ−セリンを用い
ると、未反応Ｄ−セリンか反応系に蓄積するため工業的
製法としては、残存するＤ−セリンをラセミ化して再び
反応系に戻す必要がある。このように、有機合成法で安
価に製造しうるＤＬ−アミノ酸の利用にはラセミ化工程
か必要となる場合が多い。

一方、ラセミ化方法としては、熱処理などが知られてい
るが、目的アミノ酸の熱分解か生じ、工業的製法におい
ては、収率、純度低下などの問題がある。

しかしなから、酵素によるラセミ化は、常温常圧反応で
あり、目的アミノ酸の分解は認められず工業的に優れた
方法である。

このような、ラセミ化を触媒する酵素の例として、ソニ
ートモナス・プチダ（ＩＦＯ１２９９６）か有する、低
基質特異性のアミノ酸ラセマーゼかある。このアミノ酸
ラセマーゼに対して芳香族アミノ酸、β−メチル基が置
換を受けた構造を持つアミノ酸（例えばインロインン、
バリン、スレオニン）は基質とならないが、その他多く
のアミノ酸、例えはリジン、アルギニン、メチオニン、
アラニン、セリンなどは基質となり、ラセミ化を受ける
［　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ　１ｏ
ｐｈｙｓｉｃａ　　Ｒｅｓｅａｃｈ　　Ｃｏｍｕｎｉｃ
ａｔｉｏｎ　　Ｖｏｌ、３５　、　Ｎｏ、３．３６３〜
３６８　（１９６９）；生化学　第４６巻第５号２０３
〜２２３　（１９７４）等参照］。この性質を利用すれ
はＤ　Ｌ−セリンを基質の一つとして、Ｌ−トリプトフ
ァン、Ｌ−システィン、Ｌ−チロ／ンを製造する場合の
ラセミ化反応にも応用できる。しかしながら、本酵素は
通常菌体内には微量しか含まれておらず、本酵素を工業
的規模で使用しうるＩこは、酵素活性（単位時間、単位
菌体当りのＤ−又はＬ−アミノ酸のラセミ化能）の高い
菌体を、高収量で得る培養方法が強く望まれている。

従来、ラセマーセ能を有する菌株の培養方法は余り知ら
れておらず、僅かに特開昭５８−２０１８７号公報に開
示された方法があるだけである。

この方法は、その酵素生成がグルコースを炭素源とする
場合に阻害を受けることに着目し、グルコース濃度を１
％以下に保ちながら培養を行うものである。しかしなが
ら、グルコースを炭素源としている限り、いくら低濃度
であってもこの問題を基本的に避けることはできない。

さらに、グルコース濃度を１％以下に制限することは工
業的には非常に煩雑である。

そこで、本発明者らは、グルコース以外の炭素源を広く
探索したところ、Ｌ−又はＤＬ−グルタミン酸及びその
塩、Ｌ−又はＤＬ−アスパラギン酸、及びその塩、Ｌ−
又はＤＬ−アラニン、Ｌ−又はＤＬ−セリン、Ｌ−又は
ＤＬ−リジン及びその塩酸塩、Ｌ−又はＤＬ−プロリン
、Ｌ−又はＤＬ−０インン及びＬ−又はＤＬ−アルギニ
ンヨリなる群から選はれる１種又は２種以上を主たる炭
素源とした場合には、高活性の菌体を煩雑な制限をする
ことなしに高収量で得られることを見出し本発明を完成
するに至った。なお、本発明に用いる低基質特異性のア
ミ７ノ酸ラセマーゼとは、２種以上のアミノ酸をラセミ
化する能力を有するアミノ酸ラセマーゼをいう。

（発明の構成と効果） 本発明は、／ニードモナス属に属する低基質特異性のア
ミノ酸ラセマーゼを含有する微生物を培養するに際し、
Ｌ−又はＤＬ−グルタミン酸及びその塩、Ｌ−又はＤＬ
−アスパラギン酸及びその塩、Ｌ−又はＤＬ−アラニン
Ｌ−又はＤＬ−セリン、Ｌ−又はＤＬ−リジン及びその
塩、Ｌ−又はＤＬ−プロリン、Ｌ−又はＤ　Ｌ−σイシ
ン及びＬ又はＤＬ−アルギニンよりなる詳から選ば杭る
１種又は２種以上を主たる炭素源として使用することを
特徴とするシュードモナス属に属する低基質特異性のア
ミノ酸ラセマーゼを含有する微生物の培養方法であ乙。

本発明による微生物の培養は、主たる炭素源として上記
特定のアミノ酸を用いることを除けば、通常の培養と同
様にして行なうことかできる。

しかして、上記炭素源の使用量は、特に制限されるもの
ではないが通常、０．１−１０重量％、好ましくは０．
５〜５重１％がある。該炭素源の添加は培養初期に一括
して添加してもよいし、培養途中に選択添加してもよい
。

また、上記培養においてかかる炭素源と共に使用し得る
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩、及びアンモニア、さらに硝酸カリ、硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、グルタミン酸、グル
タミン、アスパラギン酸、アスパラギン等の有機窒素な
どが適当であり、無機物としては、リン酸カリウム、硫
酸マグ不ノウム、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、カル
ンウムの硫酸塩または、塩酸塩などが用いられ、成長促
進物質としては、サイアミン、ビオチン等のビタミン類
、メチオニン、システィン等のアミノ酸、あるいはこれ
ら全部もしくは部分的に含有する酵母エキス、ボリペブ
ｌ−ン、肉エキス、コーンステイープリカー、カザミノ
酸等が用いられる。

培養温度は通常１０〜４５°Ｃ１好ましくは２５〜４０
’Ｃ！の範囲内であり、また、培地ｐＨは３〜ＩＯ好ま
しくは、５〜９の範囲内にすることができる。培養中の
ｐ）（変化がある場合にはアンモニア、苛性ソーダ、苛
性カリなどを添加して上記の範囲で一定に保持すること
が望ましい。

更に培養は好気的条件下で行い、培養中の溶存酸素が律
速因子とならないように通気撹拌をすることか望ましい
。

本発明によｉｔは、菌体内のラセマーゼ生成か阻害され
ることなくラセマーゼを高収量で保有する菌体か得られ
、該菌体を使用すればアミノ酸を高効ぶにラセミ化出来
る。

以下、実施例を揚げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例　１ ポリペプトンｌＯｇ、肉エキスｌｏｇ、ＮａＣ１５ｇ、
蒸留水１００１００Ｏ、ｐＨ７，２の培地１００ｍρを
５００ｍρ容三角フラスコに分注し、１２０　’Ｃ１５
分間滅菌処理した。この培地にラセマーゼ生産菌である
シュードモナス・プチダ（ＩＦｏ　　１２９９６）を１
白金耳量植菌し、３０°Ｃで１５時間振盪培養を行った
後、この培養物１ｍＱを下記表１に示す各培地１００ｍ
ｆ２に植菌し、３０°Ｃで２０時間振盪培養を行った。

該各培養物４０ｍＱから遠心分離（６，０００ｒｐｍ、
１５分間、４°Ｃ）により集菌し、該集菌菌体を０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）４０ｍＱにて１度洗浄後
、同級衝液の４ｍＱに懸濁する。菌体懸濁液を超音波破
砕機（プランラン２００型）により破砕した後、遠心分
離（１２０００ｒｐｍ、４０分間、４°Ｃ）により上清
を分離し、これを粗酵素液とし、ざらに該粗酵素液中の
セリン分解活性を抑制させるため、−２０℃にて２４時
間凍結保存した。

表 ■ に、ＨＰＯ。

Ｋ　ｌｌ２Ｐ　Ｏ。

（ＮＨ，）　　２Ｓｏ。

Ｍｇ５０，７ｔ−（２０ ト　リ　プ　ト　ン□（Ｄｉｒｃｏ） 酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ） 主炭素源＊ 蒸留水 ｐｒイア、０ ｇ ｇ ｇ ｏ・Ｉｇ ｇ ｇ ５ｇ １０００ｍ＋２ ＊主炭素源はＬ−グルタミン酸ソーダ、Ｌ−アスパラギ
ン酸ソーダ、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−リジン塩
酸塩、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイ７ン又はＬ−アルギニン
。

表 １００ｍＭ　　　トリス（ヒドロキノメチルアミノメタ
ン） ｌｏｏｍ〜Ｉ　　　Ｄ　−セ’Ｊ　＞ ０．０４　ｍ　Ｍ　　　ピリドキサール５リン酸ｐＨ８
，０の水溶液 表２に示す反応液４．５　ｍＬ：ｌに各々の主炭酸源を
用いた培養で得られた前述の粗酵素液の０．５ｍＱを加
え、３７°Ｃ３０分間反応させた後、反応液中のセリン
の旋光度変化を旋光計（日本分光ＤＩＰ３６０型）を用
い、酸性条件下で測定し、更に全セリン濃度をＨＰＬＣ
にて測定し、Ｄ−セリンからのＬ−セリンの生成量を求
め、その結果よりＬ−ロイシンを主炭素源とした場合の
活性をｌＯＯとして下記表３を作成した。また、酵素液
中のタンパク質濃度はＬ　ｏｗｒｙ等の方法（Ｊ　、　
Ｂ　ｉｏｌ。

ｃｈｅｍ、　　］　９３　２６５　１９５１　）に従い
求めｌこ　。

第 表 主炭素源 Ｌ−アスパラギン酸ソーダ Ｌ−グルタミン酸ソーダ Ｌ−アラニン Ｌ−セリン Ｌ−リジン塩酸塩 Ｌ−フロリン し−ロイシン し−アルギニン グルコース（対照） 相対活性木 ＊Ｌ−ロイ／ンを１００とした相対活性で示し　ｊこ　
。

実施例　２ 実施例１の表２におけるＤ−セリンをＬ−メチオニンに
変え他は実施例１と同様の操作で実施し、得られた結果
を実施例１の場合と同様Ｌ−０イ／ンの活性を１００と
して下記衣４に示す。

第　　　４ 表 主炭素源　　　　　　　　　　相対活性Ｌ−アスパラギ
ン酸ソーダ　　　　　７０Ｌ−グルタミン酸ソーダ　　
　　　　　６６Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　
５７Ｌ−セリン　　　　　　　　　　　６８Ｌ−リジン
塩酸塩　　　　　　　　　６５Ｌ−プロリン　　　　　
　　　　　　　　６３Ｌ−ロイ７ン　　　　　　　　　
　　１００Ｌ−アルギニン　　　　　　　　　　８８グ
ルコース（対照）３６ 実施例　３ 実施例１の表２に於けるＤ−セリンをＬ−リジン塩酸塩
に変えた他は同実施例と同様の操作で実施し、その結果
を実施例１の場合と同様り一ロイシンの活性を１００と
した相対活性で下記衣５に示す。

第　　　５ 表 主炭素源　　　　　　　　　　用対活性し−アスパラギ
ン酸ンーダ　　　　　　６７Ｌ−グルタミン酸ソーダ　
　　　　　　６４Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　
　５８Ｌ−セリン　　　　　　　　　　　６５Ｌ−リジ
ン塩酸塩　　　　　　　　　６４Ｌ−プロリン　　　　
　　　　　　　　　６４Ｌ−ロイシン　　　　　　　　
　　１ＯＯＬ−アルギニン　　　　　　　　　　　８６
グルコース（対照）３６ 実施例　４ ポリペプトンｌｏｇ、肉エキスｌＱｇ、Ｎａｃ＋５ｇ、
蒸留水１０１００Ｏ，ｐＨ７，２の培地１００ｍＱを５
００ｍＱ容三角フラスコに分注し、１２０°Ｃで１５分
間滅菌処理した。この培地にラセマーゼ生産菌であるシ
ュードモナス・プチダ（ＩＦｏ　　１２９９６）を植菌
し、３０°Ｃで１５時間培養を行った後、この培養物２
ｍＱを上記培地１００ｍ０．に植菌し、３０°Ｃで１５
時間培養を行った。

さらにこの培養物を下記衣６に示す培地ｌリットル（い
わしや製２リットル　ジャーファーメンタ−）に植菌し
、６００ｒｐｍＳ　ｌｖｖｍ、３０”Ｃｊこて２・１時
間通気撹拌培養した。なおｐＨは必要に応して２５〜２
８％アンモニア添加にて７．２前後に調整した。

表　　　　　　　６ に２ＨＯＰ。

Ｈ２Ｐｏｔ （Ｎ　Ｈ４）　　ｚＳ　Ｏ＊ ＭｇＳＯ４・　７　Ｈ２０ トリプトン 酵母エキス ＤＬ−ロイシン ７ｇ ７ｇ ７ｇ Ｏ，１ｇ ７ｇ ７ｇ ０ｇ ｐＨ７，０ 該培養物の１０ｍ４から遠心分離（６，００Ｏｒｐｍ、
１５分間、４°Ｃ）により集菌し、該集菌菌体を０　、
１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）４０ｍＱにて１度洗
浄後、同紛衝液の２ｍＱに懸濁する。該菌体懸濁液を超
音波破砕機（プランノン２００型）により破砕した後、
遠心分離（１２゜０００ｒｐｍ、４０分間、４°Ｃ）に
より上清を分離し、これを粗酵素液とし、ざらに該粗酵
素液中のセリン分解活性を抑制させるため、−２０°Ｃ
にて２４時間凍結保存した。

セリフに対するラセマーゼ活性の測定は、実施例１と同
様の操作で実施した。また、表６における炭素源をグル
コースに変え他はこれと同様の操作を施したものを対照
とした。以上の結果を次の表７に示す。

相対活性 表　　　　　７

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナス属に属する低基質特異性のアミノ
   酸ラセマーゼを含有する微生物を培養するに際し、Ｌ−
   又はＤＬグルタミン酸及びその塩、Ｌ−又はＤＬアスパ
   ラギン酸及びその塩Ｌ−又はＤＬアラニン、Ｌ−又はＤ
   Ｌ−セリン、Ｌ−又はＤＬ−リジン及びその塩酸塩、Ｌ
   −又はＤＬ−プロリン、Ｌ−またはＤＬ−ロイシン及び
   Ｌ−又はＤＬ−アルギニンよりなる群から選ばれた１種
   又は２種以上を主たる炭素源として使用することを特徴
   とするシュードモナス属に属する低基質特異性のアミノ
   酸ラセマーゼを含有する微生物の培養方法。