KR101294499B1

KR101294499B1 - 광학 활성 키랄 아민의 제조 방법

Info

Publication number: KR101294499B1
Application number: KR1020087019720A
Authority: KR
Inventors: 카렌 로빈스; 우베 보른쇼이어; 마티아스 회네
Original assignee: 론자 아게
Priority date: 2006-02-13
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2013-08-07
Also published as: ES2767898T3; CN101384723B; ES2626645T3; JP2013188217A; IL219163A0; ATE469233T1; EP2202317B1; WO2007093372A1; JP5430945B2; PT1987152E; EA200870262A1; EP2202318A1; AU2007214717B2; IL192637A; IL192637A0; EA017070B1; DE602007006765D1; US20150284752A1; JP2009526531A; EP1987152B1

Abstract

본 발명은 예를 들어 제약 제품의 합성에서 중간체 생성물로 사용될 수 있는 광학적으로 순수한 2급 아민의 제조에 관한 것이다.

광학 활성 키랄 아민, 트랜스아미나제, 아미노 수용체, 아미노 공여체

Description

광학 활성 키랄 아민의 제조 방법 {PROCESS FOR THE PREPARATION OF OPTICALLY ACTIVE CHIRAL AMINES}

본 발명은 광학 활성 키랄 아민의 제조 방법에 관한 것이다.

키랄 아민은 제약, 농약 및 화학 산업에서 중요한 역할을 한다. 그것은 종종 다양한 생리학적, 예를 들어 제약학적 활성 물질, 예컨대 세팔로스포린 또는 피롤리딘 유도체의 제조를 위한 중간체 또는 신톤(synthon)으로 사용된다. 키랄 아민의 다수의 다양한 용도에서, 단지 한 특정 광학 활성 형태, (R) 또는 (S) 거울상이성질체만이 목적하는 생리학적 활성을 갖는다. 따라서, 광학 활성 형태의 키랄 아민의 제조 방법을 제공해야 할 명백한 필요성이 존재한다.

이러한 필요성은 키랄 카르복실산의 첨가를 통한 부분입체이성질체 염의 결정화에 의해 키랄 아민을 제조함으로써 부분적으로 충족되었다 (문헌 [Breuer et al., Angewandte Chemie (2004) 116, 806-843]). 다른 화학적 방법은 C=N-이중 결합을 갖는 프로-키랄 전구체를 환원시킴으로써 거울상이성질선택적 합성을 사용한다.

또한, 다양한 효소, 예컨대 프로테아제, 아미다제 또는 리파제를 사용하는 입체선택적 분해 라세미체에 대해 공지되어 있다 (문헌 [Born-scheuer and Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim]). 또한, 특정 트랜스아미나제, 즉 α-아미노산 아미노트랜스페라제를 비롯한 α-트랜스아미나제는 광학적으로 순수한 아미노산의 제조에 적합한 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Bartsch et al., Appl. Environm. Microbiol. (1996) 62, 3794-3799], 문헌 [Cho et al., Biotechnol. Bioeng. (2003) 83, 226-234], JP 011 53084 A2 (1998), JP 633 04986 A2 (1988), EP 0 248 357 A2 및 문헌 [Ziehr et al., Biotechnol. Bioeng. (1987) 29, 482-487]).

그러나, 이들 선행 기술의 공정은 다양한 결점을 갖는다. 효소 공정은 고전적 방법에 비해서 유리한 온화한 조건을 통상 사용하여 적당한 입체선택성을 달성하지만, 기질 특이성, 거울상이성질선택성 및/또는 전환율이 산업상 적용가능한 공정에서는 충분히 높지 않은 효소를 정규적으로 사용한다. 또한, 광학 활성 아민의 제조를 위해 트랜스아미나제를 사용하는 것의 가장 두드러진 결점 중 하나는 자주 관찰되는 기질 및 생성물 억제 현상으로 대표된다. 그러므로, 본 발명의 목적 중 하나는 광학 활성 키랄 아민의 개선된 제조 방법, 특히 개선된 기질 특이성 및 개선된 거울상이성질선택성을 가지며 100％ 이하의 추출물 전환율을 가능케 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 a) 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 제공하는 단계, b) 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 트랜스아미나제, 특히 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제와 반응시키는 단계, 및 c) 목적하는 광학 활성 키랄 아민 및 α-케톤 부산물을 수득하는 단계를 포함하는 광학 활성 키랄 아민의 제조 방법을 제공함으로써 본 발명의 저변에 있는 기술적 문제를 해결한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 후속의 임의적 추가 공정 단계에서, 단계 c)에서 수득된 광학 활성 키랄 아민을 단계 c)에서 수득된 반응 혼합물로부터 단리 및 정제한다.

본 발명의 반응은 원칙적으로 하기 반응식을 따른다.

따라서, 본 발명은 1종 이상의 트랜스아미나제를 사용하여 아미노 공여체로부터 아미노 수용체로 아미노기를 트랜스아민화시킴으로써 목적하는 생성물을 형성하는 키랄 아민의 비대칭 합성 방법을 제공한다. 사용된 특이적 트랜스아미나제의 거울상이성질선호도(enantiopreference)에 따라, 목적하는 광학 배열의 광학 활성 키랄 아민, 즉 (R) 또는 (S) 거울상이성질체가 수득된다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서는 비대칭 합성을 위해 (S)-선택적-트랜스아미나제를 사용하여 키랄 아민의 목적하는 (S)-거울상이성질체를 생성하며, 본 발명의 다른 실시양태에서는 (R)-선택적-트랜스아미나제를 사용하여 목적하는 (R)-거울상이성질체를 생성한다. 목적하는 광학 활성 아민 이외에, 반응은 사용된 아미노 공여체 및 아마도 비전환된 아미노 수용체 및 아미노 공여체로부터 케톤 부산물, 특히 α-케톤 부산물을 생성한다.

본 발명의 문맥에서, 트랜스아미나제는 아미노기의 전달을 촉매작용하는 피리독살포스페이트-의존성 효소이다. 트랜스아미나제는 E.C. 2.6.1.X로 분류된다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 트랜스아미나제는 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제, 특히 바람직한 실시양태에서 ω-트랜스아미나제이다.

본 발명의 문맥에서, ω-트랜스아미나제는 바람직하게는 분류 코드가 E.C. 2.6.1.18인 효소이다. 이들 아미노 트랜스아미나제는 기질로서 아민을 주로 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, 이들 효소는 1 초과의 ω-트랜스아미나제 촉매화 반응 평형 상수를 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 ω-트랜스아미나제는 예를 들어 문헌 [Iwasaki et al., Biotechnol. Lett. (2003) 25, 1843-1846], [Shin et al., Biotechnol. Bioeng. (1997) 55, 348-358], [Shin and Kim, Book of Abstracts, 217^th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., March 21-25, (1999) 180], [Shin and Kim, Biosc. Biotechnol. Biochem. (2001) 65, 1782-1788] 및 [Shin and Kim, Biotechnol. Bioeng. (1998) 60, 534-540]에 기재되어 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 트랜스아미나제, 특히 ω-트랜스아미나제는 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 특히 균주 JS17로부터 수득되는 트랜스아미나제, 특히 ω-트랜스아미나제이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 트랜스아미나제는 알칼리게네스 데니트리피칸스(Alcaligenes denitrificans), 특히 균주 Y2k-2로부터 수득된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 트랜스아미나제는 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 특히 균주 YS2F로부터 수득된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 트랜스아미나제는 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 특히 균주 JS64로부터 수득된다. 균주 표기에 대해서는 상기 문헌 [Shin and Kim, 1998]을 참조한다. 물론 본 발명에서 용어 트랜스아미나제, 특히 ω-트랜스아미나제는 트랜스아미나제, 특히 ω-트랜스아미나제를 함유하는 미생물 또는 세포와 같은 유기체의 추출물, 또는 그 자체로 트랜스아미나제, 특히 ω-트랜스아미나제를 포함하는 살아있거나 죽은 세포 또는 미생물을 포괄한다. 이러한 미생물 또는 세포 또는 추출물 또는 트랜스아미나제 효소는 고정 또는 비-고정 형태로 사용될 수 있다. 트랜스아미나제, 특히 ω-트랜스아미나제는 또한 상기 열거된 유기체 중 하나 또는 그 등가물내에 함유된 핵산 서열 또는 이의 유도체에 의해 부분적 또는 완전 코딩되는, 재조합으로 생성된 천연 발생 또는 유전공학적 개질 트랜스아미나제, 특히 ω-트랜스아미나제일 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 용어 광학 활성 키랄 아민은 용어 거울상이성질체적 활성 키랄 아민과 동일한 맥락이다. 이들 용어는 특히 목적하지 않은 거울상이성질체가 실질적으로 없는, 더 바람직한 실시양태에서는 없는 제제를 나타낸다. 따라서, 광학 활성 키랄 아민은 본질적으로 하나의 거울상이성질체를 과잉으로 포함하거나 심지어 단지 하나의 거울상이성질체만으로 구성된다.

특히, 본 발명의 문맥에서 광학 활성 키랄 아민은 70％ 이상, 특히 90％ 초과, 최선으로 99％ 초과의 광학 순도를 갖는다.

본 발명에서 광학 순도는 다른 거울상이성질체에 비해 한 거울상이성질체의 과잉 ％로 제시된다. 따라서, 광학 순도(％)는 (R) 거울상이성질체 농도와 (S) 거울상이성질체 농도의 차를 두 거울상이성질체 농도의 합으로 나눈 것(A의 광학 순도(％)= ([A]-[B]):([A]+[B])×100, 여기서 A 및 B는 (R) 및 (S) 거울상이성질체 또는 그 역의 농도를 나타냄)이다.

본 발명에서 아미노 수용체는 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95％ 이상, 특히 100％의 전환율로 목적하는 키랄 아민으로 전환되는 것이 바람직하다. 광학 순도 및 전환율을 분석하기 위한 농도는 예를 들어 가스 크로마토그래피(GC) 또는 광 또는 형광 측정법을 사용하여 결정할 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 아미노 수용체는 트랜스아미나제, 특히 ω-트랜스아미나제에 의해 아미노 공여체로부터 전달된 아미노기를 수용할 수 있는 분자이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 아미노 수용체는 케톤 관능기를 함유한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 아미노 수용체는 페닐피루브산, 이의 염, 피루브산, 이의 염, 아세토페논, 2-케토글루타레이트, 3-옥소부티레이트, 2-부타논, 3-옥소피롤리딘(3-OP), 3-피리딜메틸케톤(3-PMK), 3-옥소부티르산 에틸 에스테르(3-OBEE), 3-옥소펜탄산 메틸 에스테르(3-OPME), N-1-boc-3-옥소피페리디논, N-1-boc-3-옥소피롤리딘(B3OP), 3-옥소-피페리딘, 알킬-3-옥소-부토노에이트, 메톡시아세톤 및 1-옥소테트랄론으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 아미노 수용체는 B3OP이다.

본 발명의 문맥에서, 아미노 공여체는 트랜스아미나제, 특히 ω-트랜스아미나제를 사용하여 아미노 수용체에 아미노기를 제공할 수 있는 분자이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 아미노 공여체는 아민 또는 아미노산이다.

특히 바람직한 실시양태에서 아미노 공여체는 β-알라닌, 알라닌, 특히 D,L-알라닌, L-알라닌 또는 D-알라닌, α-메틸벤질아민(α-MBA), 글루타메이트, 페닐알라닌, 글리신, 3-아미노부티레이트, 이소프로필아민, 2-아미노부탄, γ-아미노부티레이트 및 이들 중 임의의 것의 염, 예를 들어 염화물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서 수득된 케톤 생성물은 페닐피루브산, 이의 염, 피루브산, 이의 염, 글리옥실산, 이의 염, 아세토페논, 2-케토글루타레이트, 아세톤, 3-옥소부티레이트, 2-부타논, 3-옥소피롤리딘(3-OP), 3-피리딜메틸케톤(3-PMK), 3-옥소부티르산 에틸 에스테르(3-OBEE), 3-옥소펜탄산 메틸 에스테르(3-OPME), N-1-boc-3-옥소피페리디논 및 N-1-boc-3-옥소피롤리딘(B3OP) 또는 이들 중 임의의 것의 염, 예를 들어 염화물일 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서 아미노 공여체는 알라닌, 특히 L-알라닌이다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 광학 활성 아미노기를 갖는 아민, 특히 알킬기, 분지형 알킬기 또는 아릴알킬기를 갖는 아민의 군으로부터 선택된 광학 활성 키랄 아민의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 이들 아민, 특히 모노- 또는 비시클릭 아민은 특히 5원 내지 6원 시클릭 또는 S-, O-, 또는 N-치환 헤테로시클릭 탄화수소의 아민 또는 방향족 아민, 특히 알킬- 또는 알콕시-치환 방향족 아민이다. 바람직한 실시양태에서, 수득된 키랄 아민은 페닐알라닌, 알라닌, 3-아미노피페리딘, 알킬-3-아미노-부타노에이트, 3-아미노피롤리딘(3-AP), 3-피리딜-1-에틸아민(3-PEA), N-1-boc-3-아미노피롤리딘(B3AP), 3-아미노부티르산 에틸 에스테르(3-ABEE), 3-아미노펜탄산 메틸 에스테르(3-APME), α-메틸벤질아민(α-MBA), 1-아미노테트랄린, α-메틸-4-(3-피리딜)-부탄아민, 글루타메이트, β-아미노부티레이트, sec-부틸아민, 메톡시이소프로필아민, 3-아미노피롤리딘의 유도체, 1-N-Boc-3-아미노피페리딘, 세팔로스포린 및 세팔로스포린의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 3OP를 (S)- 또는 (R)-선택적 트랜스아미나제 및 아미노 공여체와 반응시켜 광학 활성 (S) 또는 (R)-3AP를 수득한다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 3-PMK를 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제 및 아미노 공여체와 반응시켜 광학 활성 (R) 또는 (S) 3-PEA를 수득한다.

본 발명의 바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 3-OBEE를 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제 및 아미노 공여체와 반응시켜 광학 활성 (R) 또는 (S) 3-ABEE를 수득한다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 3-OPME를 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제 및 아미노 공여체와 반응시켜 광학 활성 (R) 또는 (S) 3-APME를 수득한다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 B3OP를 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제 및 아미노 공여체, 특히 알라닌과 반응시켜 광학 활성 (R) 또는 (S) B3AP를 수득한다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 트랜스아미나제의 존재하에 B3OP와 아미노 공여체, 특히 알라닌간의 반응에 의해 광학 활성 B3AP 및 피루베이트를 수득하는 것에 관한 것이며, 여기서 반응은 5.0 내지 9.5, 바람직하게는 6.0 내지 7.0, 특히 6.0 내지 6.9의 pH에서 30 내지 70분, 특히 40 내지 65분, 특히 50 내지 60분 동안 수행된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 상기 트랜스아미나제는 (R)-선택적 트랜스아미나제이다. 바람직한 추가 실시양태에서, 상기 트랜스아미나제는 (S)-선택적 트랜스아미나제이다.

바람직한 실시양태에서, B3OP와 아미노 공여체, 특히 알라닌간의 반응은 적어도 하나의 피루베이트 데카르복실라제(PDC)의 존재하에 수행된다. 바람직한 추가 실시양태에서, 적어도 하나의 피루베이트 데카르복실라제(PDC)의 존재하 B3OP와 아미노 공여체, 특히 알라닌간의 반응은 형성된 피루베이트로부터 수득된 아세트알데히드를 PDC의 작용으로 제거하기 위해 반응 혼합물에 기체 질소를 동시 도입하면서 수행된다.

바람직한 추가 실시양태에서, 적어도 하나의 피루베이트 데카르복실라제의 존재하 B3OP와 아미노 공여체, 특히 알라닌간의 반응은 형성된 피루베이트로부터 수득된 아세트알데히드를 PDC의 작용으로 제거하기 위해 적어도 하나의 알코올 데히드로게나제(ADH)의 존재하에 수행된다.

바람직한 추가 실시양태에서, 적어도 하나의 피루베이트 데카르복실라제(PDC)의 존재하 B3OP와 아미노 공여체, 특히 알라닌간의 반응은 반응 혼합물에 기체 질소를 동시 도입하면서 수행되며, 형성된 피루베이트로부터 수득된 아세트알데히드를 PDC의 작용으로 제거하기 위해 적어도 하나의 알코올 데히드로게나제가 반응 매질에 존재한다.

본 발명의 바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 아세토페논을 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제 및 아미노 공여체와 반응시켜 광학 활성 (R) 또는 (S) α-MBA를 수득한다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 아미노 수용체로서 특히 모노- 또는 비시클릭, 옥소기-함유 5원 내지 6원 시클릭 또는 S-, O-, 또는 N-치환 헤테로시클릭 탄화수소 또는 방향족 화합물, 특히 알킬- 또는 알콕시-치환 방향족 화합물을 아미노 공여체 및 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제와 반응시켜 광학 활성 아민, 특히 모노- 또는 비시클릭 아민, 특히 5원 내지 6원 시클릭 또는 S-, O-, 또는 N-치환 헤테로시클릭 탄화수소의 아민 또는 방향족 아민, 특히 알킬- 또는 알콕시-치환 방향족 아민을 특히 (S) 또는 (R) 형태로 수득한다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 아미노 수용체와 아미노 공여체는 수성 매질, 예를 들어 생리학적 완충액에서 트랜스아미나제와 반응한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 트랜스아민화 반응은 5.0 내지 9.5 또는 5.0 내지 9.0, 특히 7 내지 8.5의 pH에서 수행된다. 본 발명은 특히 바람직한 실시양태에서 아미노 수용체와 아미노 공여체를 6.0 내지 7.0, 특히 6.0 내지 6.9의 pH에서 반응시킨다.

특히 바람직한 실시양태에서, 반응은 10 내지 65℃, 바람직하게는 20 내지 50℃, 특히 18 내지 25℃, 바람직하게는 실온 또는 34℃ 내지 39℃의 온도 범위, 특히 37℃에서 수행된다. 본 발명의 바람직한 추가 실시양태에서, 아미노 수용체와 아미노 공여체는 1:50 내지 1:200, 특히 1:50 내지 1:100, 특히 1:100, 특히 1:1 내지 1:5, 특히 1:1 내지 1:2의 몰비로 제공된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서 효소 활성은 1 내지 20,000 μmol/분일 수 있다.

바람직한 추가 실시양태에서, 반응은 30 내지 70분, 바람직하게는 40 내지 65분, 특히 50 내지 60분의 반응시간 동안 수행된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 상기에 따라, 즉 제1 공정 단계 a)에서 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 제공하고, 제2 공정 단계 b)에서 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 적어도 하나의 ω-트랜스아미나제와 반응시키고, 제3 공정 단계 c)에서 광학 활성 키랄 아민 및 α-케톤 부산물을 수득하는, 광학 활성 키랄 아민의 제조 방법에 관한 것이며, 추가 공정 단계 d)에서, 단계 c)에서 수득된 케톤 부산물, 특히 α-케톤 부산물을 수득된 반응 혼합물로부터 제거하며, 특히 효소와 반응시켜, 즉 데카르복실라제, 신타제 또는 데히드로게나제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 사용하여 효소 분해하여 제거한다.

특히 바람직한 실시양태에서, 단계 c)에서 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트는 예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 또는 지모박터 팔마에(Zymobacter palmae)로부터의 피루베이트 데카르복실라제(PDC)와 반응하여 바람직하게는 아세트알데히드 및 CO₂를 생성함으로써 제거된다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트를 PDC의 작용에 의해 제거하고 이에 따라 형성된 아세트알데히드를 예를 들어 화학적, 효소적 또는 물리적 처리에 의해 제거하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트를 PDC의 작용에 의해 제거하고 이에 따라 형성된 아세트알데히드를 예를 들어 반응 매질에 기체 질소를 공급하고, 바람직하게는 상기 기체 질소를 반응 혼합물에 연속 공급하여 반응 혼합물로부터 제거하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트를 PDC의 작용에 의해 제거하고 이에 따라 형성된 아세트알데히드를 적어도 하나의 알코올 데히드록시게나제(ADH)와 반응시켜 반응 혼합물로부터 제거하고 이를 에탄올로 전환하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트를 PDC의 작용에 의해 제거하고 이에 따라 형성된 아세트알데히드를 반응 혼합물에 감압을 적용하여 제거하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트를 PDC의 작용에 의해 제거하고 이에 따라 형성된 아세트알데히드를 화학 반응에 의해 제거하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 추가 실시양태에서, 본 발명은 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트를 PDC의 작용에 의해 제거하고, 이에 따라 형성된 아세트알데히드를 반응 혼합물에 기체 질소를 공급하고, 바람직하게는 상기 기체 질소를 반응 혼합물에 연속 공급하여 제거하며, 추가로 아세트알데히드를 적어도 하나의 알코올 데히드록시게나제(ADH)와 반응시켜 반응 혼합물로부터 아세트알데히드를 제거하고 이를 에탄올로 전환하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 추가 실시양태에서, 단계 c)에서 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트를 예를 들어 대장균(Escherichia coli)으로부터의 락테이트 데히드로게나제(LDH)와 반응시켜 바람직하게는 L-락테이트를 생성함으로써 제거한다.

본 발명의 바람직한 추가 실시양태에서, 단계 c)에서 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트를 아세토락테이트 신타제와 반응시켜 바람직하게는 아세토락테이트를 생성함으로써 제거한다.

바람직한 추가 실시양태에서, 단계 c)에서 수득된 케톤 생성물, 특히 피루베이트를 반응 혼합물로부터 연속으로 제거한다.

이들 특히 바람직한 실시양태는 본 공정의 부산물로서 케톤 생성물이 평형 반응으로부터 제거되므로 매우 높은 전환 속도를 달성하는 장점을 제공한다. 생성물 방향으로 반응이 추진되므로 높은 입체선택성 및 목적하는 생성물로의 매우 높은 전환율을 제공한다.

본 발명은 또한 생리학적 활성 화합물 또는 그의 전구체 및/또는 그의 제조에서의 중간체 (특히 3-아미노피롤리딘 유도체, 세팔로스포린, 세팔로스포린의 유도체, 헤테로시클릭 보론산, L-디히드록시페닐알라닌(L-Dopa), α-메틸dopa, D-페닐글리신, β-히드록시페닐글리신, 포스피노트리신, 피리미도 유도체 및 피롤리돈 유도체로부터 선택됨)의 제조 방법에 관한 것이며, 본 발명의 상기 열거된 방법 중 어느 한 방법이 사용된다. 본 발명의 문맥에서, 생리학적 활성 화합물은 식물, 동물, 인간, 효모 또는 미생물, 예를 들어 원생동물, 박테리아 또는 바이러스에서 생리학적 활성인, 즉 유기체의 대사작용과 상호작용하는 화합물이다.

본 발명의 바람직한 추가 실시양태는 종속항의 주제이다.

본 발명은 하기 실시예 및 첨부 도면에서 보다 상세하게 예시된다.

첨부 도면은 본 발명을 예시한다.

도 1은 박층 크로마토그램을 보여준다.

도 2는 pH값에 따라 비브리오 플루비알리스 ω-TA의 상대적 활성을 보여준다.

도 3은 다양한 물질을 사용한 인큐베이션 동안 B3AP 농도의 상대적 감소를 보여준다.

도 4는 피루베이트 및 아세트알데히드의 존재하 B3AP 전환율의 상대적 감소를 보여준다.

도 5는 다양한 압력에서 시간에 따른 B3AP로의 B3OP의 전환율을 보여준다.

도 6은 다양한 PDC의 존재하 B3AP로의 B3OP의 상대 전환율을 보여준다.

도 7은 비대칭 B3AP 합성에 대한 증가된 알라닌 농도 및 증가된 PDC-농도의 영향을 보여준다.

도 8은 증가된 알라닌 농도에서 B3AP로의 B3OP의 전환율을 보여준다.

도 9는 B3AP로의 B3OP의 상대적 PLP-의존성 전환율을 보여준다.

도 10은 N₂-존재에 따른 B3AP로의 B3OP의 상대 전환율을 보여준다.

도 11은 ADH의 존재하 B3AP로의 B3OP의 상대 전환율을 보여준다.

실시예 1: B3AP의 비대칭 합성

1.5 ml 반응관에서 B3AP의 비대칭 합성을 수행하였다. 아미노 수용체로서 B3OP를 5 mM (7.5 μmol)의 농도로 사용하였다. 사용된 아미노 공여체 L-알라닌의 농도는 5 mM이었다. 사용된 시약 및 반응 조건은 하기 표 1로부터 명백하다.

<표 1>

알라닌으로부터 B3OP로 아미노기를 트랜스아민화시키기 위한 (S)-ω 트랜스아미나제를 사용한 비대칭 (S)-B3AP 합성에 대한 반응 조건

사용된 완충액은 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7이었다. TA7은 비브리오 플루비알리스 (독일 소재 윌리히 피네 케미칼즈(Juelich Fine Chemicals))로부터의 ω-트랜스아미나제를 나타내었다. TA8은 알칼리게네스 데니트리피칸스(Alcaligenes denitrificans) (독일 소재 윌리히 피네 케미칼즈)로부터의 ω 트랜스아미나제를 나타내었다. 락테이트 데히드로게나제로서 대장균(Escherichia coli)의 추출물이 사용되었다. 또한, NADH를 10 mM의 최종 농도에 첨가하였다. 피루베이트 데카르복실라제의 농도는 다양하였다. 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)의 피루베이트 데카르복실라제 (PDC1) 1.5 단위 (20 μl) 및 15 단위 (200 μl)를 사용하였다. 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)의 피루베이트 데카르복실라제 (PDC2) 2 단위 (3.4 μl) 및 20 단위 (34 μl)를 사용하였다.

<표 2>

B3AP의 비대칭 합성을 위해 TA8을 사용하여 수득된 전환율 및 광학 순도. 계산은 GC-분석 (+/- 5％)을 기초로 하였다.

이제, 상기 표 2를 참고하면, ω-트랜스아미나제 TA8을 사용한 6개의 수행 각각에서, 수득된 (S)-B3AP에 대해 매우 높은 정도의 광학 순도가 얻어질 수 있었다는 것이 명백하다. 또한, TA7 또는 TA8을 사용한 것과는 상관없이, 반응의 평형이 영향을 받지 않을 경우 (수행 1), 전환의 정도는 단지 중등도라는 것이 관찰되었다. 10 내지 50배 과량으로 알라닌을 사용하면 전환율이 단지 약간 개선되었다. 수행 3, 4, 5 및 6에서, 반응의 케톤 생성물 (피루베이트를 의미함)은 트랜스아민화 반응 동안 평형 반응으로부터 제거되었다. TA8을 대장균으로부터의 락테이트 데히드로게나제와 함께 사용하여 (수행 6) 거울상이성질선택성을 유지 및 심지어 개선시키면서, 전환 정도를 매우 개선시켰다. 거울상이성질선택성에 대해 유효한 본질적으로 동일한 유지성이 지모모나스 모빌리스로부터의 피루베이트 데카르복실라제에 의해 제공되었다 (수행 3 내지 5). 그러나, 24시간 동안 반응시킬 경우, PDC1은 전환율을 단지 약간 증가시켰고, PDC2는 전환율을 중등도로 증가시킨 반면 (수행 4), 72시간 반응시킬 경우 (수행 5) 전환율은 매우 개선되었다. 모든 반응은 72시간 동안 수행된 수행 5를 제외하고는, 24시간 동안 수행되었다.

도면은 표 1에 따라 수행된 반응의 박층 크로마토그램을 나타낸다. "A"는 알칼리게니스 데니트리피칸스로부터의 ω-트랜스아미나제를 나타내는 한편, "V"는 비브리오 플루비알리스로부터의 ω-트랜스아미나제를 나타낸다. "K"는 TA7 또는 TA8을 단독으로 (수행 1) 사용한 수행 1을 나타낸다. PDC1은 사카로마이세스 세레비시아에 피루베이트 데카르복실라제를 사용한 수행 (수행 3)을 나타내고, LDH는 대장균으로부터 락테이트 데히드로게나제를 사용한 수행 (수행 6)을 나타내고, PDC2는 지모모나스 모빌리스 피루베이트 데카르복실라제를 사용한 수행 (24시간 및 72시간 후) (수행 4 및 5)을 나타낸다. 따라서, 결과는 프로키랄 케톤 B3OP로부터 (S)-B3AP의 제조가 매우 높은 입체이성질선택성으로 수행될 수 있다는 것을 명백하게 보여주었다. 그러나, 제조 공정에서 단일 효소로서 ω-트랜스아미나제를 사용하면 중등도 전환율이 생성되었다. 이러한 중증도 전환율은 평형 상태로부터 특히 락테이트 데히드로게나제 또는 피루베이트 데카르복실라제를 사용하여 피루베이트를 제거함으로써 크게 개선될 수 있었다. 특히, 피루베이트 데카르복실라제를 사용하면 보조 인자 재순환 (NADH)이 필요하지 않다는 이점이 있었다. 또한, 그것은 유리하게는 PDC를 이용한 피루베이트의 효소적 제거를 제공하여 생성물 억제 (생성물 케톤)의 제거 또는 방지 및 반응 평형을 바로 높은 전환율 (이상적인 경우 100％)로 이끄는 추가의 이점을 제공한다.

실시예 2: (S)-αMBA의 아세토페논으로의 전환 반응에서 ω-트랜스아미나제 활성의 pH-의존성

100 mM 피루베이트 50 μl, ω-TA 비브리오 플루비알리스 (이하 또한 Vfl) (12 μl) 4 단위/ml 및 나트륨 포스페이트 완충액 388 μl (0.2 단계로 pH 6.0 내지 pH 7.4의 pH 가변성을 갖는 50 mM)를 사용하여 쿼즈 큐벳(quarz cuvette)에서 합성을 수행하였다. 아미노 공여체로서 100 mM (S)-αMBA 50 μl를 사용하여 반응을 개시하고, 250 내지 260 nm에서 흡수 증가를 측정하였다. 흡수 증가는 아세토페논의 형성에 기인한 것이었다. 다른 기질은 흡수에 단지 무의미하게 기여하므로 반응 속도는 아세토페논의 흡수를 측정함으로써 결정될 수 있었다. pH 7.4에 이른 값은 100％로 설정하고, 다른 pH 값에 대한 상대 활성을 도 2로부터 명백한 바와 같이 계산하였다. 도 2는 주어진 pH 값에 의존하는 비브리오 플루비알리스 ω-TA의 상대 활성을 나타낸다.

도 2는 6.0, 6.2 또는 6.4와 같은 낮은 pH 값에서 여전히 상당한 활성이 존재 (예를 들어, pH 6.0에서 11％)한다는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 결과는 낮은 pH에서도 상당한 트랜스아미나제 활성을 얻어서, 낮은 pH에서 기질을 반응시키고, 높은 pH 값에 민감한 PDC의 사용에 의해 전환을 증가시킬 수 있다는 것을 증명한다.

실시예 3: 여러가지 pH 값에서 B3AP의 비대칭 합성

본 실시예에서는, 피루베이트 데카르복실라제 (PDC)의 존재 및 부재하에 알라닌 및 B3OP로부터 B3AP의 비대칭 합성을 나타내었다.

각각의 pH 값 6.0, 6.4 및 7.0에 대해 3개의 실험 수행을 수행하였다. 수행 1은 지모모나스 모빌리스 (야생형 세포 추출물)의 PDC를 사용하고, 수행 2는 지모박터 팔마에 (대장균에서 재조합)를 사용하고, 수행 3은 PDC 없이 단지 트랜스아미나제만을 사용한 대조군이었다. 동등한 결과를 얻기 위하여, 두 PDC의 활성을 알코올 데히드로게나제 분석을 사용하여 pH 6에서 측정하고, 동일한 양의 PDC의 활성을 상기 식별된 수행에 사용하였다.

표 3은 사용된 물질의 부피를 μl로 제공한다. 각각의 반응 수행은 pH 값 6.0, 6.4 및 7.0에서 3회 수행하였다. B3OP 기질 용액의 완충액에 의해 pH 값을 조정하였다. PDC의 활성은 pH 7에서 약 2.5 단위/ml였다. 기질 및 효소 농도 또한 하기 표 3으로부터 명백하다. 10분, 30분, 60분 및 120분 후에, 샘플 100 μl 를 취하고, 1 M NaOH 100 μl를 첨가하여 반응을 중단시켰다. B3AP-농도의 정량화를 CE (모세관 전기영동법)를 사용하여 수행하였다.

<표 3>

하기 표 4는 여러가지 PDC에 대한 여러가지 pH 값에서의 전환율을 나타낸다. PDC의 사용이 전환율을 증가시킨다는 것이 명백하였다. 또한, 지모박터 팔마에 (Zpa)로부터의 PDC가 지모모나스 모빌리스 (Zmo)로부터의 PDC보다 약간 더 높은 전환율을 야기시킨다는 것이 명백하였다. 또한, 6.0 또는 6.4와 같은 낮은 pH 값하에 PDC를 사용한 수행에서 현저한 전환율 증가가 관찰되었으며, PDC-무함유 대조군에서는 관찰되지 않았다는 것이 명백하였다. 모든 반응 수행에서, 120분 후에, 전 환율이 감소된 것으로 관찰되었다.

<표 4>

실시예 4: 비대칭 합성 반응의 다양한 반응물의 존재하에 B3AP의 안정성

다양한 반응물의 존재하에 B3AP의 안정성을 나타내기 위하여, 하기 표 5에 열거된 다양한 물질의 존재하에 반응관에서 1 mM B3AP의 인큐베이션을 3시간 동안 수행하였다.

본 실시예는 pH 6 및 7에서 (나트륨 포스페이트 완충액) 수행하였다. 반응 직후, 제1 샘플 T₀인 물질을 취하고, 3시간 후에 또다른 샘플 T₁을 취하였다. 추출후, 아민 농도를 CE에 의해 내부 표준물 (αMBA)로 측정하였다. 수득된 농도의 차이로부터, B3AP 농도의 감소율％을 계산하였다 (도 3 참조).

<표 5>

도 3으로부터, 여러가지 반응물이 B3AP-농도에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것이 명백하였다 (수행 1 내지 9). 반응 수행 11 내지 13은 아세트알데히드의 영향을 보여준다. 수행 11로부터 트랜스아미나제의 부재하에서는 B3AP 농도가 감소되지 않는 반면, 트랜스아미나제 및 아세트알데히드의 존재하에서는 B3AP 농도의 강한 감소가 관찰될 수 있다는 것이 명백하였다. 아세트알데히드는 트랜스아미나제 반응에서 피루베이트와 같은 아미노 수용체로서 기능하고, 명백하게 B3AP 농도를 감소시켰다.

실시예 5: B3AP와 아미노 수용체 피루베이트 및 아세트알데히드의 반응

본 실시예에서는, 기질 B3AP 및 피루베이트에 대한 및 B3AP 및 아세트알데히드에 대한 비브리오 플루비알리스 및 알칼리게네스 데니트리피칸스 ω-TA의 트랜스아미나제 활성을 나타내었다.

2 mM B3AP를 2 mM 피루베이트 또는 2 mM 아세트알데히드와 반응시켰다 (반응 부피 0.5 μl 당 알칼리게네스 데니트리피칸스 (Ade) 36 μl 또는 비브리오 플루비알리스 (Vfl)-트랜스아미나제 6 μl (트랜스아미나제 2 단위/μl에 상응함)를 30분 동안 반응시킴). 도 4는 결과를 보여준다. 따라서, B3AP는 피루베이트 및 아세트알데히드를 모두 갖는 두 효소에 의해 임의의 유의한 차이없이 B3OP로 전환되었다.

실시예 6: pH 6에서 감압하에 B3AP의 비대칭 합성

본 실시예에서는, B3AP를 형성하기 위한 비대칭 합성 반응을 위해 반응 혼합물에 감압을 적용하였다. 대조군으로서, 정상 압력하에 PDC 없이 동일한 반응을 수행하였다.

반응 조건:

최종 부피: 1.5 ml

50 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 6

300 μl 비브리오 플루비알리스-트랜스아미나제

60 μl Zpa-PDC (pH 7에서 8 단위/ml에 상응함)

5 mM B3OP

10 mM D,L-알라닌

0.1 mM TPP, PLP

5 mM MgCl₂

회전 증발기를 사용하여 감압을 적용하였다 (150 mBar). CE를 사용하여 측정을 수행하였다.

도 5는 다양한 압력에 대한 시간에 따른 B3OP의 B3AP로의 전환을 나타낸다. 전환이 인가된 압력으로부터 거의 독립적이라는 것이 명백하였다. 달성된 최대 전환과 관련하여, 150 mbar의 압력에서의 전환은 1000 mbar의 압력에서의 전환과 유사하였다.

실시예 7: 다양한 피루베이트 데카르복실라제의 비교

본 실시예에서는, B3AP의 비대칭 합성을 위하여 3개의 상이한 피루베이트 데카르복실라제를 사용하였다. 반응 조건은 pH 7을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 6의 조건에 상응하였다. 지모모나스 모빌리스, 지모박터 팔마에로부터의 PDC 및 바이오촉매로부터의 PDC (카달로그 번호 PDC-101)를 사용하였다. ADH-분석에서 PDC의 활성은 동일하였다 (1.6 단위/ml).

도 6은 3개의 모든 PDC가 유사한 전환율을 생성하였다는 것을 보여준다.

실시예 8: B3OP의 B3AP로의 전환에 대한 효소 및 보조기질 농도의 영향

본 실시예에서는 아미노 공여체로서 알라닌을 사용하여 B3OP의 B3AP로의 전환에 대한 PDC 농도의 영향을 나타내었다. 또한, B3OP의 B3AP로의 전환에 대한 알라닌 농도의 영향을 나타내었다.

반응 조건은 pH 7을 사용한 것을 제외하고, 달리 언급된 것을 제외하고는, 실시예 6에서 제공되었다. 지모박터 팔마에 TA를 사용하였다.

도 7로부터 명백한 바와 같이, PDC가 없는 반응에서, 5 mM에서 25 mM로 알라닌 농도의 5배 증가는 전환율의 2배를 초래하였다 (2시간 후에 5.3％ 전환과 대조적으로 12％). PDC의 존재하에, 전환율은 5배의 알라닌 과량에서 2배로 증가하였 다 (90분 후에 17％와 대조적으로 30％). 그러나, PDC의 양을 통상의 알라닌 농도에서 1.6 단위/ml에서 50 단위/ml로 증가시킬 경우, 전환율은 단지 2배 미만으로 증가하였다 (40분 후에 17％와 대조적으로 29％).

또다른 실험 수행에서, 조합된 알라닌 과량 및 PDC 과량의 영향을 pH 6 및 7 모두에서 나타내었다. 반응은 pH 6에서 더 빠른 반면, 49％의 전환율에 도달한 후에는 B3AP 농도 또한 빠르게 감소하였다. pH 7에서 전환율은 56％ 이하로 증가하였다.

실시예 9: B3AP의 비대칭 합성에 대한 알라닌 농도의 영향

4개의 반응에서, 5 mM, 25 mM, 110 mM, 300 mM 및 500 mM의 알라닌 농도가 사용되었다. 각각의 수행에 대해, PDC가 없는 대조군 및 PDC를 사용한 반응을 수행하였다. pH 값을 pH 7.0으로 조정하였다. 3시간의 반응 시간 동안 30분마다 샘플을 취하였다. 도 8에 제공된 전환율에 대한 반응 시간은 5 mM의 경우 40분, 25 mM의 경우 60분 및 110 내지 500 mM의 경우 90분이었다.

도 8은 증가된 알라닌 농도에서 비대칭 B3AP-합성의 전환율을 보여준다.

도 8은 전환율이 60 내지 70％에 도달할 수 있다는 것을 명백하게 보여주었다. 알라닌 농도를 25에서 110 mM로 증가시키면 B3OP의 B3AP로의 전환에 상당한 영향을 미치고, 500 mM 이하로 더 증가시키면 전환율에 단지 약간의 영향만을 미친다는 것이 명백하였다. 전환율에 대한 PDC의 영향은 알라닌 농도 증가에 따라 감소하였다.

대조군 반응의 데이터로부터, B3AP 합성의 평형 상수는 다음과 같이 계산하 였다:

[B3AP] = [Pyr]

[B3OP] = c_0,B3OP - [B3AP] 및

[Alα] = c_0,Alα - [B3AP]

따라서, 측정된 B3AP 농도를 사용하여, 평형 상수를 다음과 같이 계산하였다:

<표 6>

표 6은 계산된 값을 보여준다. 따라서, B3AP와의 반응에 대한 평형 상수는 3.1 x 10^-3이었다. 따라서, 기질 B3OP는 다른 케톤과는 달리, 비대칭 합성에 적합한 기질이다.

실시예 10: B3AP의 비대칭 합성에 대한 PLP의 영향

본 실시예에서는 B3OP의 B3AP로의 전환에 대한 PLP (피리독살-5'-포스페이트)의 영향을 나타내었다. 하기 3개의 반응 수행을 시험하였다.

a) 추가의 PLP 첨가 없이 0.1 mM PLP를 사용한 수행 1

b) 수행 2에서, 반응 동안 반응 매질 중 PLP의 존재로 인한 황색이 사라지자 마자 PLP를 첨가하였다. 이러한 목적을 위하여, 포화 PLP 용액 1 내지 2 μl를 첨가하여 짙은 황색을 다시 얻었다. 이러한 약간의 부피 증가를 통한 아민 농도에 대한 영향은 1％ 미만인 것으로 생각되므로, 무시할 수 있었다.

c) PLP가 존재하지 않고, PLP를 첨가하지 않았다.

반응 조건: 최종 부피 1 ml, Vfl-트랜스아미나제 37 μl, 5 mM B3OP, 포스페이트 완충액 pH 7.0. L-알라닌 농도는 110 mM이었다. CE에 의해 측정을 수행하고, α-MBA를 내부 표준물로서 사용하였다.

도 9는 시간에 따른 전환율을 나타낸다. 수행 a)와 비교하여 수행 b)에서는 PLP 첨가로 인한 최대 전환율에 대한 유의한 영향은 없는 것으로 나타났다. PLP가 없는 반응은 느린 것으로 보여졌지만, 다른 반응과 동일한 전환율에 도달하였다. 수행 b)에서 PLP의 첨가는 대조군 수행과 비교하여 아민 농도에서 약간 더 큰 감소를 야기시켰다.

실시예 11: 질소 첨가에 의한 아세트알데히드의 제거를 이용한 B3AP의 비대칭 합성

하기 실시예는 아세트알데히드의 제거에 의해 B3AP의 비대칭 합성의 전환율을 개선시키는 한 방법을 상술한다.

반응 조건:

기질:

5 mM B3OP

500 mM L-알라닌

32 U/ml Zpa-PDC

37 μl/ml Vfl-트랜스아미나제

나트륨 포스페이트 완충액 pH 7.0

0.1 mM PLP 및 TPP (티아민 디포스페이트)

5 mM MgCl₂

반응 용액이 상당량의 단백질을 함유하기 때문에, 발포체 형성 경향이 강하였다. 상기 발포 형성을 억제하기 위하여, 소포제 A 농축물 (시그마 제품, 실리콘-중합체) 0.6 μl를 반응 수행물에 첨가하였다. 농축물은 발포체 생성을 크게 억제시켰지만, 그것을 완전히 억제시키지는 못하였다. 상기 소포제 농축물이 효소를 억제하는 것을 배제시키기 위하여, 질소를 첨가하지 않은 대조군 수행에 소포제 A를 추가하였다.

건조 질소의 첨가는 반응 용액으로부터 물의 증발을 야기시키기 때문에, 질소를 습윤시켰다.

도 10은 계산된 상대 B3AP 전환율을 나타낸다. 질소를 첨가하지 않은 소포제 A를 갖는 대조군 (N₂-대조군: Vfl-TA, Zpa-PDC, 소포제, N₂ 질소 무함유)은 소포제 A를 갖지 않는 반응 수행물 (Vfl-TA, ZpaPDC)에 정확하게 상응하였다. 따라서, 효소는 소포제 농축물의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다. 질소로 처리된 수행 (수행 N₂: Vfl-TA, Zpa-PDC, 소포제, N₂)은 60, 90 및 180분후에 전환율 증가를 나타내었다.

실시예 12: 다양한 조건하에 비대칭 B3AP 합성

반응 조건:

최종 부피: 1 ml

37 μl Vfl-트랜스아미나제

32 단위/ml Zpa-PDC 또는 바이오촉매 PDC 또는 3.2 단위/ml Zmo PDC

5 mM B3OP

500 mM L-알라닌

보조 인자 0.1 mM PLP 및 TPP, 5 mM MgCl₂

pH 7, 나트륨 포스페이트

도 10은 Vfl-트랜스아미나제와 각각의 PDC를 조합한 상기 식별된 반응 수행에 대한 B3OP의 B3AP로의 전환을 나타낸다.

도 10에서 N2로 나타낸 수행은 질소 및 소포제 A로 처리된 Vfl-트랜스아미나제 및 Zpa-PDC를 함유하는 수행이었다. N2 대조군은 질소 처리하지 않은 Vfl-트랜스아미나제, Zpa-PDC 및 소포제 A를 함유하는 샘플이었다. 반응 용액으로 공급된 질소의 존재로 인하여, N2 대조군에서 N2 샘플로의 전환이 상당히 증가한다는 것이 명백하였다. 따라서, 기체 형태의 질소를 반응 매질로 공급하는 것은 B3OP에서 B3AP로의 전환을 상당히 증가시켰다.

실시예 13: 알코올 데히드로게나제 (ADH)의 존재하에 B3AP의 비대칭 합성

PDC 반응에 의해 생성된 아세트알데히드를 반응 혼합물로부터 제거하기 위하 여, ADH를 사용하여 아세트알데히드를 에탄올로 전환시킬 수 있었다.

반응 조건:

110 mM L-알라닌

5 mM B3OP

37 μl/ml Vfl-트랜스아미나제

32 단위/ml Zpa PDC

0.1 mM PLP 및 TPP

5 mM MgCl₂

나트륨 포스페이트 완충액, pH 7

다음의 반응 수행을 나타내었다:

반응 수행 1: PDC 및 트랜스아미나제를 이용한 반응

반응 수행 2: 5 mM 에탄올 (최종 농도) 및 NADH-첨가된 PDC 및 트랜스아미나제를 이용한 반응

반응 수행 3: PDC, ADH 및 NADH를 이용한 반응

사용된 ADH는 50 내지 100 단위/ml의 활성을 갖는 사카로마이세스 세레비사에로부터의 ADH이었다. PDC-활성은 32 단위/ml이었다.

반응 개시시 무수 에탄올을 5 mM의 최종 농도로 반응 수행 2에 첨가하였다. 반응 개시시, 5 mM NADH의 최종 농도에 상응하도록 NADH 5 μmol을 반응 수행 2 및 3에 첨가하였다. 각각 10분후에, NADH 2.4 μmol (50 mM 포스페이트 완충액, pH 8.5 중 0.6 M NADH-용액 4 μl)을 추가로 첨가하였다. NADH 용액을 얼음 중에 저장하고, 사용 직전에 제조하였다.

결과는 도 11 및 표 5에 제공되어 있다. ADH의 효과는 명백하였다. 전환율은 약 90％ 이하로 증가하였다. ADH 및 5 mM 에탄올이 없는 대조군 수행 2는 대조군 수행 1로부터 단지 약간의 편차를 가졌다. 따라서, ADH의 첨가는 B3OP로부터 B3AP의 비대칭 합성에서 전환율을 크게 증가시켰다.

Claims

a) 아미노 수용체, 및 아미노 공여체로서 알라닌을 제공하는 단계,

b) 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제와 반응시키는 단계,

c) 목적하는 광학 활성 키랄 아민 및 알파-케톤 부산물로서의 피루베이트를 수득하는 단계, 및

d) 데카르복실라제, 신타제, 또는 둘 다를 이용하여 반응 혼합물로부터 피루베이트를 제거하는 단계

를 포함하는, 광학 활성 키랄 아민 및 알파-케톤 부산물로서의 피루베이트의 제조 방법.
제1항에 있어서, 아미노 수용체가 페닐피루브산, 그의 염, 피루브산, 그의 염, 아세토페논, 2-케토글루타레이트, 3-옥소부티레이트, 2-부타논, 3-옥소피롤리딘 (3-OP), 3-피리딜메틸케톤 (3-PMK), 3-옥소부티르산 에틸 에스테르 (3-OBEE), 3-옥소펜탄산 메틸 에스테르 (3-OPME), N-1-boc-3-옥소피페리디논, N-1-boc-3-옥소피롤리딘 (B3OP), 3-옥소-피페리딘, 알킬-3-옥소-부토노에이트, 메톡시아세톤 및 1-옥소테트랄론으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
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제1항에 있어서, 수득된 아민이 모노- 또는 비-시클릭 아민인 방법.
제1항에 있어서, 수득된 아민이 페닐알라닌, 알라닌, 3-아미노피페리딘, 알킬-3-아미노-부타노에이트, 3-아미노피롤리딘 (3-AP), 3-피리딜-1-에틸아민 (3-PEA), N-1-boc-3-아미노피롤리딘 (B3AP), 3-아미노부티르산 에틸 에스테르 (3-ABEE), 3-아미노펜탄산 메틸 에스테르 (3-APME), α-메틸벤질아민 (α-MBA), 1-아미노테트랄린, α-메틸-4-(3-피리딜)-부탄아민, 글루타메이트, β-아미노부티레이트, sec-부틸아민, 메톡시이소프로필아민, 3-아미노피롤리딘의 유도체, 1-N-boc-3-아미노피페리딘, 세팔로스포린 및 세팔로스포린의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 트랜스아미나제가 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 알칼리게네스 데니트리피칸스(Alcaligenes denitrificans), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 또는 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터의 것인 방법.
제4항에 있어서, 수득된 아민이 5 내지 6-원 시클릭 또는 S-, O- 또는 N-치환된 헤테로시클릭 탄화수소의 아민 또는 방향족 아민인 방법.
제7항에 있어서, 수득된 아민이 알킬- 또는 알콕시-치환된 방향족 아민인 방법.
제1항에 있어서, 10 내지 65℃ 범위의 온도하에서 수행하는 방법.
제1항에 있어서, pH가 5.0 내지 9.5의 반응 혼합물에서 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 40 내지 70분의 반응 시간 동안 수행하는 방법.
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제1항에 있어서, 단계 c) 또는 d)에서 수득된 광학 활성 키랄 아민을 단계 c) 또는 d)에서 수득된 반응 혼합물로부터 제거하는 방법.
제1항에 있어서, pH가 6.0 내지 7.0인 반응 혼합물에서 수행하는 방법.
제22항에 있어서, pH가 6.0 내지 6.9인 반응 혼합물에서 수행하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 데카르복실라제가 피루베이트 데카르복실라제 (PDC)이고, 기체 질소 (N₂)를 반응 혼합물에 공급함으로써 PDC의 반응에 의해 형성된 아세트알데히드를 제거하는 방법.
제1항에 있어서, 1종 이상의 피루베이트 데카르복실라제 및 1종 이상의 알코올 데히드로게나제의 존재하에 반응을 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 1종 이상의 피루베이트 데카르복실라제, 1종 이상의 알코올 데히드로게나제 및 추가로 기체 질소 (N₂)의 존재하에 반응을 수행하는 방법.
a) 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 제공하는 단계,

b) 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제와 반응시키는 단계, 및

c) 목적하는 광학 활성 키랄 아민 및 알파-케톤 부산물을 수득하는 단계

를 포함하며, 10 내지 65℃ 범위의 온도하에 pH 5.0 내지 9.5의 반응 혼합물에서 40 내지 70분의 반응 시간 동안 수행되는, 광학 활성 키랄 아민의 제조 방법을 사용하는, 3-아미노피롤리돈 유도체, 세팔로스포린, 세팔로스포린의 유도체, 헤테로시클릭 보론산, L-디히드록시페닐알라닌 (L-Dopa), α-메틸dopa, D-페닐글리신, β-히드록시페닐글리신, 포스피노트리신, 피리미도 유도체 및 피롤리돈 유도체의 군으로부터 선택된 생리학적 활성 화합물의 제조 방법.
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제1항에 있어서, 데카르복실라제가 피루베이트 데카르복실라제 (PDC)인 방법.
제1항에 있어서, 신타제가 아세토락테이트 신타제인 방법.
제30항에 있어서, PDC의 작용에 의해 형성된 아세트알데히드가 제거되는 방법.
제32항에 있어서, 하나 이상의 효소와의 반응에 의해 아세트알데히드를 제거하는 방법.
제33항에 있어서, 효소가 알코올 데히드로게나제인 방법.
제32항에 있어서, 기체 질소를 반응 혼합물에 공급함으로써 아세트알데히드를 제거하는 방법.
제32항에 있어서, 반응 혼합물에 감압을 적용함으로써 아세트알데히드를 제거하는 방법.
제32항에 있어서, 화학적 방법에 의해 아세트알데히드를 제거하는 방법.
a) 아미노 수용체로서 3-OP 또는 B3OP, 및 아미노 공여체를 제공하는 단계,

b) 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 (R)- 또는 (S)-선택적 트랜스아미나제와 반응시키는 단계, 및

c) 광학 활성 키랄 3-AP 또는 광학 활성 키랄 B3AP, 및 알파-케톤 부산물을 수득하는 단계

를 포함하는, 광학 활성 3-AP 또는 광학 활성 B3AP의 제조 방법.