JP2015533501A - インドリン誘導体の調製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般には有機化学の分野に関し、特にインドリン誘導体の調製に関する。これらのインドリン誘導体は、シロドシンまたはそれらの誘導体など医薬として活性な作用剤の合成における中間体として使用できる。

Description

本発明は、一般には有機化学の分野に関し、特にインドリン誘導体の調製に関する。これらのインドリン誘導体は、シロドシンまたはそれらの誘導体など医薬として活性な作用剤の合成における中間体として使用できる。

インドリン部分を含む化合物は、有効な医薬として活性な作用剤を調製するための重要な中間体である。例えば、シロドシン（１−（３−ヒドロキシプロピル）−５−［（２Ｒ）−（｛２−［２−［２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）フェノキシ］エチル｝アミノ）プロピル］インドリン−７−カルボキサミド）は、高い尿路選択性を有するα_１−アドレナリン作用受容体アンタゴニストで、良性前立腺肥大症の治療に特に適している。

ＥＰ０６００６７５Ａ１およびＳｏｒｂｅｒａ Ｌ．Ａ．ら、「Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ」、２６巻、第６号、２００１年、５５２−５６０頁は、それぞれ、構造式

のラセミの１−アセチル−５−［２−［２−［２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−フェノキシ］エチルアミノ］プロピル］インドリン−７−カルボニトリルを（＋）−マンデル酸で処理することにより光学分割に付して対応する（Ｒ）−鏡像異性体を得る、シロドシンの調製方法を開示している。

ＪＰ２００１−１９９９５６は、式

の（Ｒ）−５−（２−アミノプロピル）−１−（３−ベンゾイルオキシプロピル）−インドリン−７−カルボニトリルが３段階反応により調製される、シロドシンの調製方法を開示している。第１段階では、１−（３−ベンゾイルオキシプロピル）−５−（２−オキソプロピル）−インドリン−７−カルボニトリルおよび（Ｒ）−２−フェニルエチルアミンを酸触媒下で反応させて対応するイミンを得る。第２段階では、そのイミンを酸化白金触媒の存在下、水素雰囲気中で還元し、第３段階では、得られた反応混合物を、チャコール上のＰｄの存在下で水素添加する。このようにして得られたラセミの１−（３−ベンゾイルオキシプロピル）−５−（２−アミノプロピル）−インドリン−７−カルボニトリルの粗生成物をＬ−酒石酸で処理することにより光学分割に付して、光学純度９７．６％ｅｅの（Ｒ）−鏡像異性体を得る。

欧州特許出願公開第０６００６７５号明細書 特開２００１−１９９９５６号公報

Ｓｏｒｂｅｒａ Ｌ．Ａ．ら、「Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ」、２６巻、第６号、２００１年、５５２−５６０頁

本発明の目的は、シロドシンまたはそれらの誘導体など医薬として活性な作用剤の調製に価値のある鍵中間体となる、インドリン誘導体を調製する改良された方法を提供することである。

（発明の要旨）
以下の項目にまとめられているように、本発明の様々な態様、利点を有する特性および好ましい実施形態が、それぞれ単独でまたは組合せで、本発明の課題を解決することに寄与している。

（１）式ＩＩ

（式中、ｍは１から８であり、
Ｒ_１は、ＣＮ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ハロゲンおよびカルバモイルに変換可能な基からなる群から選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｎ保護基、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_３および−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４からなる群から選択され、ここでｎ＝１から１０であり、
Ｒ_３は、ヒドロキシ保護基またはＨであり、Ｒ_４およびＲ_５は互いに独立して、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールから選択される。）
のキラルアミン化合物を調製する方法であって、
式Ｉ

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５およびｍは上で定義されているとおりである。）
の化合物をω−トランスアミナーゼの存在下でアミン供与体と反応させる方法。

本明細書で使用される用語「ヒドロキシ保護基」とは、水酸基を保護するために使用することができる、当分野で周知のいかなる基をも意味するが、ただし前記ヒドロキシ保護基を選択的に除去する開裂条件は、式ＩＩの化合物またはそれらの誘導体の構造に悪影響を与えない。

本明細書で使用される用語「アミノ保護基」とは、アミノ基を保護するために使用することができる、当分野で周知のいかなる基をも意味するが、ただし前記アミノ保護基を選択的に除去する開裂条件は、式ＩＩの化合物またはそれらの誘導体の構造に悪影響を与えない。

本明細書で使用される用語「アルキル」とは、直鎖、分枝鎖または環状炭化水素を意味する。

本明細書で使用される用語「アリール」とは、炭化水素アリール、好ましく単一または縮合６員環、より好ましくはフェニルまたはナフチル、特にフェニルを意味する。

本明細書で使用される用語「アルキルアリール」とは、前述のアリール部分が、アルキル鎖の近位端もしくは遠位端の一端で、または、前述のアルキル鎖とアルキル鎖との間に、いずれかで、前述の直鎖もしくは分枝鎖アルキル部分に組み込まれていることを意味する。例えば、近位端とは、式ＩまたはＩＩの化合物のインドリン環部分に隣接するＲ_１などを意味し、一方遠位とは、前記インドリン環部分から最も遠い、アルキル部分の末端炭素を意味する。

本明細書で使用される用語「置換」とは、ある構造部分の１個以上、好ましくは１−３個の水素原子が、置換基の対応する数だけそれぞれ互いに独立して置き換わっていることを意味する。具体的な置換基としては、それらだけに限定はされないが、例えばハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ’、−ＯＲ’、−Ｎ（Ｒ’）Ｒ”およびＲ’’’が挙げられ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’はそれぞれ、直鎖または分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択される。置換基は、置換基の導入が化学的に可能な位置にあること、すなわち、不適当に努力することなく、特定の置換が可能であるかどうか（実験的または理論的のいずれか）判断する、同業者に周知または明らかである位置にあることが理解される。例えば、不安定である置換基または本明細書に開示されている反応に影響を与えるおそれがある置換基は、省略することができる。Ｒ_４およびＲ_５は非置換であることが好ましい。

本明細書で使用される用語「ω−トランスアミナーゼ」とは、ケト化合物をアミノ化合物へ変換する、および逆も同様に変換する酵素を意味する。ω−トランスアミナーゼは、酵素委員会（ＥＣ）番号ＥＣ２．６．１を有する酵素クラスに属する。

本明細書で使用される用語「アミン供与体」とは、アミノ基転移反応においてそのアミノ基を基質に供与する化合物を意味し、このアミン供与体のアミノ基はケト基に変換される。

（２）ω−トランスアミナーゼが（Ｒ）−選択的であり、好ましくはこの（Ｒ）−選択的ω−トランスアミナーゼが、（Ｒ）−アルスロバクター属種（（Ｒ）−Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ヒポモナス・ネプツニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）およびアルスロバクター第１１ラウンド突然変異体（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｕｎｄ １１ ｍｕｔａｎｔ）からなる群から選択される生物、好ましくは、（Ｒ）−アルスロバクター属種およびアスペルギルス・テレウスからなる群から選択される生物、より好ましくは（Ｒ）−アルスロバクター属種からなる群から選択される生物に由来する、第（１）項に記載の方法。

本明細書で使用される用語「（Ｒ）−選択的」とは、式Ｉのプロキラルなカルボニル基質を、その（Ｒ）−鏡像異性体の形態で、選択的にまたは本質的に選択的に、式ＩＩの対応するアミン化合物に変換する、ω−トランスアミナーゼ酵素を意味する。

本明細書で使用される用語「鏡像異性体」とは、互いに鏡像であるが、重ならない２つの立体異性体を意味する。本明細書で使用される記号「（Ｒ）」および「（Ｓ）」は、当業界で周知のＣａｈｎ Ｉｎｇｏｌｄ Ｐｒｅｌｏｇ法（ＣＩＰ法）によって決定される、それぞれの化合物のキラル中心における絶対配置を示す（例えば、Ｍ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ、Ｊ．Ｍａｒｃｈ、「Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、６^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、 １５５−１５８頁を参照）。例えば、（Ｒ）−配置にある式ＩＩ’の化合物は以下の構造式を有する

（式中、太字のＣ−Ｎ結合は、ＣＩＰ法に従って、この結合は紙面の上方に位置することを示す。）。

本明細書で使用される用語「アルスロバクター第１１ラウンド突然変異体」とは、Ｃ．Ｋ．Ｓａｖｉｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０年、３２９、３０５−３０９頁に開示された、アルスロバクター突然変異体の調製方法において第１１回目の突然変異の後に得られ、同定された突然変異体を意味する。

（３）ω−トランスアミナーゼが、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、ヒポモナス・ネプツニウム、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、（Ｒ）−アルスロバクター属種、アスペルギルス・テレウス、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）およびアルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）から選択される生物、好ましくはシュードモナス・フルオレッセンスおよび（Ｒ）−アルスロバクター属種から選択される生物に由来する、第（１）項または第（２）項に記載の方法。

上の第（２）項および第（３）項において定義されているω−トランスアミナーゼ酵素は、原形で天然形にある、または改変された、いわゆる突然変異体形にある、上に示した細菌類および菌類に由来することができる。

本明細書で使用される用語「突然変異体」とは、アミノ酸配列またはそれらの部分配列において、１個以上、好ましくは１個もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加もしくは挿入を含む突然変異体をいい、または、そのアミノ酸配列またはそれらの部分配列と、約８０％以上の同一性、約８５％以上の同一性、好ましくは約９０％以上の同一性、より好ましくは約９５％以上の同一性、約９７％以上の同一性、約９８％以上の同一性もしくは約９９％以上の同一性を示す突然変異体をいう。かかる突然変異体の例には、同一種の細菌類または菌類の内（例えば品種）で、多型変異に基づく突然変異体など、天然の細菌類または菌類およびそれらの天然突然変異体とは異なる、細菌種または菌類種のホモログが含まれる。本明細書で使用される用語「複数」は、１０、９、８、７、６、５、４、３または２の整数をいう。

例えば、アルスロバクターω−トランスアミナーゼの場合、突然変異体は、Ｃ．Ｋ．Ｓａｖｉｌｅら、「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｉｒａｌ Ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｋｅｔｏｎｅｓ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０年、３２９、３０５−３０９頁に開示されている突然変異体から選択されることが好ましい。

（４）アミン供与体が、アラニン、１−エチルアミン、１−プロピルアミン、２−プロピルアミン、１−インドールアミン、フェネチルアミンなどからなる群、好ましくはアラニンおよび２−プロピルアミンからなる群、より好ましくは２−プロピルアミンからなる群から選択される、第（１）項から第（３）項のいずれか一項に記載の方法。

（５）式ＩＩのキラルアミン化合物が光学的に活性である、第（１）項から第（４）項のいずれか一項に記載の方法。

本明細書で使用される用語「光学的に活性」とは、エナンチオピュアな鏡像異性体または同一化合物の鏡像異性体の混合物を意味し、本混合物において、一方の鏡像異性体の量的含量がまさっている。「光学的に活性」は、式ＩＩの化合物が、以下の第（６）項に定義される鏡像異性体過剰率を有することを意味することが好ましい。

用語「鏡像異性体」の意味に関しては、上の第（２）項での説明を参照する。

（６）式ＩＩの光学的に活性なアミン化合物が、少なくとも６０−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、好ましくは７５−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、より好ましくは８５−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、さらにより好ましくは９０−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、またさらにより好ましくは９５−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、特に９９−１００％の鏡像異性体過剰率を有する、第（５）項に記載の方法。

本明細書で使用される用語「鏡像異性体過剰率」とは、ある光学的に活性な化合物の一方の鏡像異性体の百分率と、光学的に活性な同一化合物の他方の鏡像異性体の百分率との間の差を意味する。例えば、７５％のＲ−鏡像異性体および２５％のＳ−鏡像異性体を含有する光学的に活性な化合物は、Ｒ−鏡像異性体の５０％の鏡像異性体過剰率を有する。

（７）前記方法が、１６−４０℃の反応温度で実施され、好ましくは２０−３６℃の反応温度で実施され、より好ましくは２４−３４℃の反応温度で実施され、さらにより好ましくは２６−３２℃の反応温度で実施され、および／または
ω−トランスアミナーゼがアルスロバクター第１１ラウンド突然変異体である場合、前記方法が３５−５０℃の反応温度で実施され、好ましくは４０−４５℃の反応温度で実施される、第（１）項から第（６）項のいずれか一項に記載の方法。

用語「アルスロバクター第１１ラウンド突然変異体」の意味に関しては、上の第（２）項での説明を参照する。

（８）式Ｉの化合物が、反応混合物において１から２００ｍＭの濃度で供給され、好ましくは５から１５０ｍＭの濃度で供給され、より好ましくは１０から１００ｍＭの濃度で供給され、特に１５から５０ｍＭの濃度で供給される、第（１）項から第（７）項のいずれか一項に記載の方法。

（９）式Ｉの化合物とアミン供与体のモル比が、１：５から１：４０、好ましくは１：８から１：３０、より好ましくは１：１０から１：２６、最も好ましくは１：２０から１：２５である、第（１）項から第（８）項のいずれか一項に記載の方法。

（１０）ω−トランスアミナーゼが、ω−トランスアミナーゼを過剰発現している、易透過処理されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形態で供給され、または粗酵素抽出物もしくはそれらの凍結乾燥残渣として供給され、または（部分）精製酵素調製物もしくはそれらの凍結乾燥残渣として供給され、または固定化調製物として供給され、好ましくはω−トランスアミナーゼが、ω−トランスアミナーゼを過剰発現している、易透過処理されたＥ．コリ細胞の形態で供給され、より好ましくは任意の酵素溶液の凍結乾燥残渣の形態で供給される、第（１）項から第（９）項のいずれか一項に記載の方法。

（１１）第（１０）項に記載されているあらゆる形態での、ω−トランスアミナーゼを過剰発現しているＥ．コリ細胞の質量と式Ｉの化合物のモル量との比が、１０ｇ／１ｍｏｌから２０００ｇ／１ｍｏｌである、第（１０）項に記載の方法。

（１２）アミン供与体がアラニンである場合、反応混合物が、アラニン脱水素酵素（Ａｌａ−ＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ピリドキサール−５’−フォファット（ＰＬＰ）およびギ酸アンモニウムをさらに含む、第（１）項から第（１１）項のいずれか一項に記載の方法。

（１３）アミン供与体がアラニンである場合、反応混合物が、アラニン脱水素酵素（Ａｌａ−ＤＨ）、ブドウ糖脱水素酵素（ＧＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ピリドキサール−５’−フォファット（ＰＬＰ）およびブドウ糖およびアンモニウム塩をさらに含み、または代替的に、反応混合物が、アラニン脱水素酵素（Ａｌａ−ＤＨ）、亜リン酸脱水素酵素（ＰＴＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ピリドキサール−５’−フォファット（ＰＬＰ）および亜リン酸アンモニウムをさらに含む、第（１）項から第（１１）項のいずれか一項に記載の方法。

（１４）式ＩＩ

（式中、Ｒ_１は、ＣＮ、ＮＨ_２、ＮＯ_２およびカルバモイルに変換可能な基からなる群から選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｎ保護基、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_３または−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４からなる群から選択され、ここでｎ＝１から１０またはＨであり、
Ｒ_３は、ヒドロキシ保護基またはＨであり、Ｒ_４およびＲ_５は互いに独立して、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールから選択される。）
の光学的に活性なキラルアミン化合物を調製する方法であって、
ｉ）式ＩＩ

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５およびｍは上で定義されているとおりである。）
の化合物の第１型および第２型の鏡像異性体の混合物をω−トランスアミナーゼの存在下でアミン受容体と反応させて、式ＩＩの化合物の第１型の鏡像異性体を式Ｉ

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５およびｍは上で定義されているとおりである。）
の化合物に変換する工程、および
ｉｉ）反応混合物から、式ＩＩの化合物の残りの未反応の第２型の鏡像異性体を分離する工程
を含む方法。

用語「アルキル」、「アリール」、「アルキルアリール」、「置換」、「ω−トランスアミナーゼ」および「Ｎ保護基」の意味に関しては、上の第（１）項を参照する。用語「鏡像異性体」の意味に関しては、上の第（２）項を参照する。用語「光学的に活性」の意味に関しては、上の第（５）項を参照する。

本明細書で使用される用語「アミン受容体」とは、アミノ基転移反応において基質のアミノ基が転移するケト化合物を意味し、そのアミン受容体のケト基がアミン基に変換する。

用語「鏡像異性体の第１型および第２型」は、式ＩＩの化合物の（Ｒ）−および（Ｓ）−鏡像異性体混合物において、一方の鏡像異性体、例えば（Ｒ）−鏡像異性体は鏡像異性体の第１型を表し、（Ｓ）−鏡像異性体は鏡像異性体の第２型を表し、またはその逆も表すことを意味する。鏡像異性体の第１型は式ＩＩの化合物の（Ｓ）−鏡像異性体であること、鏡像異性体の第２型は式ＩＩの化合物の（Ｒ）−鏡像異性体であることが好ましい。

（１５）ω−トランスアミナーゼが（Ｓ）−選択的であり、好ましくはこの（Ｓ）−選択的ω−トランスアミナーゼが、クロモバクテリウム・ビオラセウム、シュードモナス・プチダＩまたはＩＩ、バチルス・メガテリウムからなる群から選択される生物、好ましくはシュードモナス・プチダＩおよびバチルス・メガテリウムからなる群から選択される生物に由来する、第（１４）項に記載の方法。

本明細書で使用される用語「（Ｓ）−選択的」とは、ω−トランスアミナーゼ酵素が、（Ｓ）−鏡像異性体の形態にあるアミン基質を対応するカルボニル化合物へ選択的に変換し、（Ｒ）−鏡像異性体の形態にあるアミン基質では、変換はまったくないまたは実質上ないことを意味する。

用語「シュードモナス・プチダＩ」とは、ＷＯ２０１０／０８９１７１Ａ２に開示されている配列番号２０である配列を有するシュードモナス・プチダトランスアミナーゼを意味し、用語「シュードモナス・プチダＩＩ」とは、ＷＯ２０１０／０８９１７１Ａ２に開示されている配列番号２２である配列を有するシュードモナス・プチダトランスアミナーゼを意味する。

（１６）ω−トランスアミナーゼが、ヒポモナス・ネプツニウム、クロモバテリウム・ビオラセウム、シュードモナス・プチダＩまたはＩＩ、アスペルギルス・テレウス、バチルス・メガテリウムおよびアルスロバクター属種からなる群から選択し、好ましくはシュードモナス・プチダＩまたはＩＩ、アスペルギルス・テレウス、バチルス・メガテリウムおよびアルスロバクター属種からなる群から選択した、第（１４）項に記載の方法。

上の第（１５）項および第（１６）項で定義されているω−トランスアミナーゼ酵素は、原形で天然形にある、または改変された、いわゆる突然変異体形にある、上に示した細菌類および菌類に由来することができる。

用語「突然変異体」の意味に関しては、上の第（３）項での説明を参照する。

（１７）アミン受容体が、Ｃ３−Ｃ８ケトン、Ｃ２−Ｃ８−α−ケト酸またはＣ２−Ｃ８−α−ケト酸の塩、好ましくはアセトンまたはピルベート、より好ましくはピルベートである、第（１４）項または第（１５）項のいずれか一項に記載の方法。

（１８）工程ｉ）において用意された鏡像異性体の混合物が光学的に活性である、第（１４）項から第（１７）項のいずれか一項に記載の方法。

工程ｉ）において用意された光学的に活性な混合物は、第（１）項から第（１３）項のいずれか一項に記載の方法に従って調製されていることが好ましい。

（１９）工程ｉ）において用意された鏡像異性体の混合物が、式ＩＩの化合物のラセミ混合物である、第（１４）項から第（１７）項のいずれか一項に記載の方法。

本明細書で使用される用語「ラセミ混合物」とは、Ｒ−およびＳ−鏡像異性体が等量で存在する混合物を意味する。

この実施形態において、ラセミ混合物はアキラルな化学合成によって適宜得られる。

（２０）工程ｉｉ）において得られた式ＩＩの化合物の光学活性キラルアミンが、７０−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、好ましくは８０−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、より好ましくは９０−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、さらにより好ましくは９５−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、またさらにより好ましくは９９−１００％の鏡像異性体過剰率を有する、第（１４）項から第（１９）項のいずれか一項に記載の方法。

（２１）式ＩＩの化合物とアミン受容体とのモル比が１：１から１：１０、好ましくは１：１．２から１：８、より好ましくは１：１．２から１：４、最も好ましくは１：１．５から１：２．５である、第（１４）項から第（２０）項に記載の方法。

（２２）ω−トランスアミナーゼが、ω−トランスアミナーゼを過剰発現している、易透過処理されたＥ．コリ細胞の形態で供給される、または粗酵素抽出物もしくはそれらの凍結乾燥残渣として供給される、または（部分）精製酵素調製物もしくはそれらの凍結乾燥残渣として供給される、または固定化調製物として供給される、第（１４）項から第（２１）項のいずれか一項に記載の方法。

本明細書で使用される用語「固定化調製物」とは、ω−トランスアミナーゼ酵素が、化学的に、物理的にもしくは遺伝子工学手法によって、化学的に有機支持材もしくは無機支持材に封じ込められ、または化学的に有機支持材もしくは無機支持材に／支持材中に分置され、その酵素の触媒活性が保持され、その調製物を繰り返しおよび継続的に、好適に使用できることを意味する。

（２３）第（２２）項に記載されているあらゆる形態での、ω−トランスアミナーゼを過剰発現している、Ｅ．コリ細胞の質量と式ＩＩの化合物のモル量との比が、１０ｇ／１ｍｏｌから２０００ｇ／１ｍｏｌである、第（２２）項に記載の方法。

（２４）前記方法が、１６−４０℃の反応温度で実施される、好ましくは２０−３６℃の反応温度で実施される、より好ましくは２４−３４℃の反応温度で実施される、さらにより好ましくは２６−３２℃の反応温度で実施される、第（１４）項から第（２４）項のいずれか一項に記載の方法。

（２５）前記方法が、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）およびＣ１−Ｃ６アルコールからなる群から選択される、好ましくはＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、ＤＭＥおよびＣ１−Ｃ３アルコールからなる群から選択される、より好ましくはＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、ＤＭＥからなる群から選択される、特にＤＭＦおよびＤＭＳＯからなる群から選択される有機溶媒の存在下で実施される、第（１）項から第（２４）項のいずれか一項に記載の方法。

（２６）反応混合物が、場合によってリン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤、ＰＩＰＥＳ緩衝剤およびＨＥＰＥＳ緩衝剤からなる群から選択される水性緩衝剤系をさらに含み、緩衝剤系はリン酸塩緩衝剤が好ましく、リン酸カリウム緩衝剤がより好ましく、最も好ましくは緩衝剤は省略することができる、第（１）項から第（２５）項のいずれか一項に記載の方法。

本明細書で使用される用語「水性緩衝剤系」とは、弱酸およびその共役塩基または弱塩基およびその共役酸の混和物を意味し、この混和物は水に溶解し、ある水溶液のｐＨ値を安定化することができる。具体的には、本明細書で使用される「ＴＲＩＳ緩衝剤」は、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）および塩酸など無機の強酸の混和物を意味し、本明細書で使用される「リン酸塩緩衝剤」は、例えば、Ｋ_２ＨＰＯ_４およびＫＨ_２ＰＯ_４の混和物を意味し、ＰＩＰＥＳ緩衝剤は、例えば、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸）およびＮａＯＨまたはＫＯＨなど水酸化アルカリの混和物を意味し、ＨＥＰＥＳ緩衝剤は、例えば４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）およびＮａＯＨまたはＫＯＨなど水酸化アルカリの混和物を意味する。

（２７）Ｒ_２が、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）からなる群から選択される、アミン保護基を表す、第（１）項から第（２６）項のいずれか一項に記載の方法。

（２８）ヒドロキシ保護基Ｒ_３が、ベンゾイル、トシル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、アセチル、ピバロイルからなる群から選択される、第（１）項から第（２６）項のいずれか一項に記載の方法。

（２９）式ＩおよびＩＩの化合物において、ｍは１から５であり、Ｒ_１はＣＮであり、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４（式中、ｎ＝１から５である。）であり、Ｒ_４は直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはフェニルであり、Ｒ_５は直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
好ましくはｍ＝１から３であり、Ｒ_１はＣＮであり、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４（式中、ｎ＝１から３である。）であり、Ｒ_５はメチルまたはエチルであり、
より好ましくはｍ＝１であり、Ｒ_１はＣＮであり、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＯ−Ｐｈであり、Ｒ_５はメチルである、第（１）項から第（２６）項のいずれか一項に記載の方法。

（３０）式

を有するシロドシンを調製する方法であって、
ａ）第（１）項から第（２７）項のいずれか一項に記載の方法により調製される、式ＩＩ”

（式中、Ｒ_２’は、−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−Ｒ_３’または−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４’であり、ここで、Ｒ_３’およびＲ_４’は、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールを表す。）
の化合物を用意する工程、および
ｂ）工程ａ）の式ＩＩ”の化合物をシロドシンに変換する工程
を含む方法。

本発明を、さらに好ましいおよびさらに利点を有する実施形態および実施例を参照して、より詳しくこれから説明するが、これら実施形態および実施例は、単に例示の目的で提示するのであって、本発明の範囲を制限するものと理解してはならない。

従来、キラルインドリン誘導体は、ラセミ（ｒａｃｅｍａｔ）形態で所望のインドリン誘導体が得られる化学合成法によって合成する。したがって、鏡像異性体的に富化されているまたは純粋のインドリン誘導体を得るために、従来の方法では、ラセミのインドリン誘導体を光学分割に付する必要がある。光学分割は、満足度の高いエナンチオマー富化を得るために、具体的には複数の後続分割ステップを必要とするので、労力を要する手順である。これら複数の分割ステップでは、鏡像異性体的に富化されているまたはエナンチオピュアな生成物については比較的不十分な歩留りとなる。

ケト化合物のアミン化合物への変換（還元的アミノ化）にまたはアミンの速度論的分割にω−トランスアミナーゼ酵素を一般的に使用することは周知である。例えば、ＥＰ０９８７３３２Ａ１には、構造式

（式中、ｐは０または１であり、ｑは０から８の整数であり、ｒは０から４の整数であり、Ｒは、６から１４個の炭素原子を有する置換もしくは非置換アリ−ル基、４から１２個の炭素原子を有するヘテロアリ−ル基、カルボキシル基、１から６個の炭素原子を有するアルコキシカルボニル基、メチル基または水素原子のいずれか一つであり、Ｘは、ヒドロキシ基、カルボキシル基、１から６個の炭素原子を有するアルコキシカルボニル基または水素原子のいずれか一つである。）
を有する基質のアミノ基転移反応に、アルスロバクター属種に由来するω−トランスアミナーゼを使用することが記載されている。

Ｒ．Ｌ．Ｈａｎｓｏｎら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ （Ｒ）−Ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｒａｃｅｍｉｃ Ａｍｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ （Ｓ）−Ａｍｉｎｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ」、Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００８年、３５０、１３６７−１３７５頁には、それぞれ１−シクロプロピルエチルアミンおよびｓｅｃ−ブチルアミンの形態にある基質の速度論的分割に、バチルス・メガテリウムに由来するω−トランスアミナーゼを使用することが記載されている。

ＷＯ２０１１／０２６５５６Ａ１においては、アスペルギルス・テレウスに由来するω−トランスアミナーゼの同定および調製が記載されている。前記トランスアミナーゼの基質特異性が、モデル基質としてα−メチルベンジルアミンを使用して試験された。

Ｍ．Ｈｏｈｎｅら、「Ｒａｔｉｏｎａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｋｅｙ ｍｏｔｉｆｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｕｉｄｅｓ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｅｎｚｙｍｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０年、６、８０７−８１３頁では、対応するケトンから２−アミノヘキサン、２−アミノ−４−フェニルブタン、１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジンおよび１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アモピペリジンを不斉合成するための、いくつかの推定（Ｒ）−選択的アミントランスアミナーゼのスクリーニングが記載されている。

Ｕ．Ｋａｕｌｍａｎｎら、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ」、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００７年、４１、６２８−６３７頁では、様々なアミン基質の速度論的分割の変換率ならびに様々なケト酸およびアルデヒド基質のアミノ基転移反応を評価するのに、クロモバクテリウム・ビオラセウムに由来するω−トランスアミナーゼを使用することが記載されているが、得られた生成物の鏡像異性体過剰率については注目が払われていない。

しかし、上で特定された従来技術の文献においては、
式ＩまたはＩＩ

（式中、ｍは１から８であり、
Ｒ_１は、ＣＮ、ＮＨ_２、ＮＯ_２およびカルバモイルに変換可能な基からなる群から選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｎ保護基、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_３および−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４からなる群から選択され、ここでｎ＝１から１０であり、
Ｒ_３は、ヒドロキシ保護基またはＨであり、Ｒ_４およびＲ_５は互いに独立して、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールから選択される。）
のインドリン化合物の化学構造とは強く異なる化学構造である、比較的単純な基質が使用されている。

上に示した式ＩまたはＩＩのインドリン化合物は、製剤分野で価値のある（中間体）化合物となるものであり、それらの構造は複雑であるが、驚くべきことに、ω−トランスアミナーゼ酵素に感受性の高い基質であり、さらにもっと驚くべきことに、純度および／または歩留りなど有益な特性を兼ね備えた鏡像異性体過剰率を達成することが見いだされた。例えば、式中、Ｒ_１＝ＣＮであり、Ｒ_２＝−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＯ−Ｐｈであり、Ｒ_５はメチルである、式ＩＩの化合物、すなわち構造式

を有する化合物は、式

を有するシロドシン合成における、非常に価値のある前駆化合物となる。

式ＩおよびＩＩを有する上のインドリン誘導体は、ω−トランスアミナーゼ酵素の特に適切な基質となることが、驚くべきことに本発明者らにより見いだされた。さらに、酵素の特定の型を適切に選択することで、式（ＩＩ）の化合物の（Ｓ）−および（Ｒ）−鏡像異性体の双方が、利用価値のある高鏡像異性体過剰率で、または鏡像異性体的に純粋な状態でも得られる。

本発明の一態様によれば、式ＩＩ

（式中、ｍは１から８であり、
Ｒ_１は、ＣＮ、ＮＨ_２、ＮＯ_２およびカルバモイルに変換可能な基からなる群から選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｎ保護基、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_３または−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４からなる群から選択され、ここでｎ＝１から１０であり、
Ｒ_３は、ヒドロキシ保護基であり、Ｒ_４およびＲ_５は互いに独立して、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールから選択される。）
の化合物は、式Ｉ

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５およびｍは上で定義されているとおりである。）
の化合物をω−トランスアミナーゼの存在下でアミン供与体と反応させる方法によって調製される。

本発明のこの態様による手順コンセプトは、シロドシンまたはそれらの誘導体など医薬として活性な作用剤を調製するための非常に価値のある中間体となる式ＩＩの化合物を提供する。驚くべきことに、本発明者らによって、式Ｉの化合物が、酵素的触媒による還元的アミノ基転移反応を介して、式ＩＩの化合物に変換され、驚くべきことに、この変換は、酵素型の選択などさらに適切な条件に応じて有効化され、還元的アミノ化の手順コンセプトまたは速度論的分割の手順コンセプトは、それぞれに、高歩留りおよび高化学的純度を良く兼ね備えた鏡像異性体過剰率を提供することが見いだされた。

好ましい実施形態によれば、ω−トランスアミナーゼが（Ｒ）−選択的であり、（Ｒ）−選択的ω−トランスアミナーゼが、アルスロバクター属種、アスペルギルス・テレウス、シュードモナス・プチダおよびアルスロバクター第１１ラウンド突然変異体からなる群から選択される生物に由来することが好ましく、特に（Ｒ）−選択的ω−トランスアミナーゼは（Ｒ）−アルスロバクター属種およびアスペルギルス・テレウスであり、より好ましくは（Ｒ）−アルスロバクター属種およびアスペルギルス・テレウスであり、特に（Ｒ）−アルスロバクター属種である。

このようにして、式ＩＩの化合物の（Ｒ）−鏡像異性体を得るために、ω−トランスアミナーゼが適切に選択される。驚くべきことに、本発明者らによって、（Ｒ）−選択的ω−トランスアミナーゼが、鏡像異性体選択的に、式Ｉのプロキラル基質化合物を式ＩＩの化合物の（Ｒ）−鏡像異性体に変換することが見いだされた。例えば、シロドシンの場合、（Ｒ）−鏡像異性体が、医薬的活性作用剤として例えば米国連邦医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されているので、式ＩＩの化合物が例えばシロドシンの中間体となるさらに好ましい場合において、この（Ｒ）−鏡像異性体が特に好まれる。

また、鏡像異性体の種類について具体的な優先度がない場合、すなわち（Ｒ）または（Ｓ）−鏡像異性体のいずれか一方で良い場合、ω−トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム、ヒポポモナス・ネプツニウム、バチルス・メガテリウム、アルスロバクター属種、アスペルギルス・テレウス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス、アルスロバクター・シトレウスおよびアルスロバクター第１１ラウンド突然変異体から選択される生物、好ましくはシュードモナス・フルオレッセンスおよび（Ｒ）−アルスロバクター属種から選択される生物、好ましくは（Ｒ）−アルスロバクター属種から選択される生物に由来する。

式ＩＩの化合物の光学活性形において、（Ｒ）−鏡像異性体がまさっているかそれとも（Ｓ）−鏡像異性体がまさっているかにかかわらず、この光学活性形が、少なくとも６０−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、より好ましくは７５−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、さらにより好ましくは８５−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、またさらにより好ましくは９０−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、なおまたさらにより好ましくは９５−１００％の鏡像異性体過剰率を有し、特に９９−１００％の鏡像異性体過剰率を有することが好ましい。本発明のこの実施形態によれば、式ＩＩの化合物が、例外的に高い鏡像異性体過剰率に有利な状態で、好ましくは高鏡像異性体過剰率で得られる。

別の好ましい実施形態によれば、アミン供与体は、アラニン、１−エチルアミン、１−プロピルアミン、２−プロピルアミン、１−インドールアミン、フェネチルアミンなどからなる群から、好ましくはアラニンおよび２−プロピルアミンからなる群から、より好ましくは２−プロピルアミンからなる群から選択される。前述の化合物は、特に適切なアミン供与体化合物となる。

式Ｉの化合物は、反応混合物において１から２００ｍＭの濃度で供給され、好ましくは５から１５０ｍＭの濃度で供給され、より好ましくは１０から１００ｍＭの濃度で供給され、特に１５から５０ｍＭの濃度で供給されるのが好ましい。このようにして、変換率が有意に改善される。

驚くべきことに、ω−トランスアミナーゼが、クロモバクテリウム・ビオラセウム、バチルス・メガテリウム、アルスロバクター属種、アスペルギルス・テレウス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンスおよびアルスロバクター・シトレウスからなる群から選択される生物に由来する場合、本方法の実施に関し１６−４０℃の比較的低い反応温度、好ましくは２０−３６℃の比較的低い反応温度、より好ましくは２４−３４℃の比較的低い反応温度、さらにより好ましくは２６−３２℃の比較的低い反応温度が、特に適切であることが見いだされた。他方、ω−トランスアミナーゼがアルスロバクター第１１ラウンド突然変異体である場合、本方法は、３５−５０℃の反応温度で、好ましくは４０−４５℃の反応温度で実施されるのが好ましく、このことにより、特に利点を有する変換率が得られる。

アラニンがアミン供与体として選択される場合、反応混合物が、アラニン脱水素酵素（Ａｌａ−ＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ピリドキサール−５’−フォファット（ＰＬＰ）およびギ酸アンモニウムをさらに含むことが好ましい。または反応混合物が、アラニン脱水素酵素（Ａｌａ−ＤＨ）、ブドウ糖脱水素酵素（ＧＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ピリドキサール−５’−フォファット（ＰＬＰ）、ブドウ糖およびアンモニウム塩をさらに含み、または別の代替法によれば反応混合物が、アラニン脱水素酵素（Ａｌａ−ＤＨ）、亜リン酸脱水素酵素（ＰＴＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ピリドキサール−５’−フォファット（ＰＬＰ）および亜リン酸アンモニウムをさらに含む。このように、特に適切なアラニン−脱水素酵素補因子リサイクルシステムが供給される。

本発明の別の態様によると、式ＩＩ

（式中、Ｒ_１は、ＣＮ、ＮＨ_２、ＮＯ_２およびカルバモイルに変換可能な基からなる群から選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｎ保護基、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_３または−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４からなる群から選択され、ここでｎ＝１から１０であり、
Ｒ_３は、ヒドロキシ保護基であり、Ｒ_４およびＲ_５は互いに独立して、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールから選択される。）
の光学的に活性なキラルアミン化合物は、
ｉ）式ＩＩ

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５およびｍは上で定義されているとおりである。）
の化合物の第１型および第２型の鏡像異性体の混合物をω−トランスアミナーゼの存在下でアミン受容体と反応させて、式ＩＩの化合物の第１型の鏡像異性体を式Ｉ

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５およびｍは上で定義されているとおりである。）
の化合物に変換する工程、および
ｉｉ）反応混合物から、式ＩＩの化合物の残りの未反応の第２型の鏡像異性体を分離する工程
を含む方法によって得られる。

本発明のこの好ましい態様によると、鏡像異性体過剰率および良好な化学純度を有する、好ましくは高い鏡像異性体過剰率を有する式ＩＩの化合物を調製するさらなる代替法が供給される。驚くべきことに、本発明者らによって、式ＩＩの化合物の鏡像異性体混合物が、例えば、それらのラセミ混合物が、ω−トランスアミナーゼ酵素を使用する速度論的分割によって、式ＩＩの化合物を効率的に鏡像異性体的に富化するための、特に適切な基質として働くことが見いだされた。具体的には、この速度論的分割では、一方は、例えば式ＩＩの化合物の所望されない方の鏡像異性体は、式ＩＩの化合物から物理的および／または化学的方法により容易に分離することのできる、式Ｉの化合物に変換され、他方は、例えば式ＩＩの化合物の所望される方の鏡像異性体は、式Ｉの化合物に少しだけ変換されるか、好ましくはまったくまたは少なくとも実質的に、式Ｉの化合物に変換されない。

好ましい実施形態によると、速度論的分割ステップｉ）において、ω−トランスアミナーゼは、ヒポモナス・ネプツニウム、クロモバテリウム・ビオラセウム、シュードモナス・プチダＩまたはＩＩ、アスペルギルス・テレウス、バチルス・メガテリウムおよびアルスロバクター属種からなる群から選択される生物、好ましくはシュードモナス・プチダ、アスペルギルス・テレウス、バチルス・メガテリウムおよびアルスロバクター属種からなる群から選択される生物に由来する。ω−トランスアミナーゼは（Ｓ）−選択的であることが好ましく、この（Ｓ）−選択的ω−トランスアミナーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウム、シュードモナス・プチダＩまたはＩＩ、バチルス・メガテリウムからなる群から選択される生物に由来することがより好ましく、シュードモナス・プチダＩおよびバチルス・メガテリウムからなる群から選択される生物に由来することがさらにより好ましい。

さらに好ましい実施形態によると、ステップｉｉ）において得られた、式ＩＩの化合物の光学的活性キラルアミンは、７０−１００％の鏡像異性体過剰率を、好ましくは８０−１００％の鏡像異性体過剰率を、より好ましくは９０−１００％の鏡像異性体過剰率を、さらにより好ましくは９５−１００％の鏡像異性体過剰率を、またさらにより好ましくは９９−１００％の鏡像異性体過剰率を有する。本発明のこの実施形態によると、式ＩＩの化合物が、例外的に高い鏡像異性体過剰率に有利な状態で、好ましくは高鏡像異性体過剰率で得られる。

速度論的分割プロセスは、１６−４０℃の反応温度で、好ましくは２０−３６℃の反応温度で、より好ましくは２４−３４℃の反応温度で、さらにより好ましくは２６−３２℃の反応温度で実施されることが好ましい。

以下の（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の手順要素それぞれが、本発明の双方の手順態様に関する、すなわち還元的アミノ化および速度論的分割に関する特に適切なプロセス条件を示している。
（ｉ）式ＩＩの化合物とアミン受容体とのモル比が、１：１から１：１０、好ましくは１：１．２から１：８、より好ましくは１：１．２から１：４、最も好ましくは１：１．５から１：２．５である。
（ｉｉ）ω−トランスアミナーゼが、ω−トランスアミナーゼを過剰発現している、易透過処理されたＥ．コリ細胞の形態で供給され、または粗酵素抽出物もしくはそれらの凍結乾燥残渣として供給され、または（部分）精製酵素調製物もしくはそれらの凍結乾燥残渣として供給され、または固定化調製物として供給され、好ましくはω−トランスアミナーゼが、ω−トランスアミナーゼを過剰発現している、易透過処理されたＥ．コリ細胞の形態で供給され、より好ましくは任意の酵素溶液の凍結乾燥残渣の形態で供給される。
（ｉｉｉ）第（２２）項に記載されているあらゆる形態でのω−トランスアミナーゼを過剰発現している、凍結乾燥されたＥ．コリ細胞の質量と、式ＩＩの化合物のモル量との比が、１０ｇ／１ｍｏｌから２０００ｇ／１ｍｏｌである。
（ｉｖ）前記方法が、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）およびＣ１−Ｃ６アルコールからなる群から選択される、好ましくはＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、ＤＭＥおよびＣ１−Ｃ３アルコールからなる群から選択される、より好ましくはＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、ＤＭＥからなる群から選択される、特にＤＭＦおよびＤＭＳＯからなる群から選択される有機溶媒の存在下で実施される。
（ｖ）反応混合物が、場合によってリン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤、ＰＩＰＥＳ緩衝剤およびＨＥＰＥＳ緩衝剤からなる群から選択される水性緩衝剤系をさらに含み、その緩衝剤系はリン酸塩緩衝剤が好ましく、リン酸カリウム緩衝剤がより好ましく、最も好ましくは緩衝剤は省略することができる。
（ｖｉ）Ｒ_２が、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）からなる群から選択される、アミン保護基を表す。
（ｖｉｉ）ヒドロキシ保護基Ｒ_３が、ベンゾイル、トシル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、アセチル、ピバロイルからなる群から選択される。および、
（ｖｉｉｉ）式ＩおよびＩＩの化合物において、ｍ＝１から５であり、Ｒ_１はＣＮであり、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４（式中、ｎ＝１から５である。）であり、Ｒ_４は直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはフェニルであり、Ｒ_５は直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
好ましくはｍ＝１から３であり、Ｒ_１はＣＮであり、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４（式中、ｎ＝１から３である。）であり、Ｒ_５はメチルまたはエチルであり、
より好ましくはｍ＝１であり、Ｒ_１はＣＮであり、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＯ−Ｐｈであり、Ｒ_５はメチルである。

（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の特性のいずれの一つも、特に利点を有するプロセス条件を示す。具体的には、特性（ｉｖ）に関し、驚くべきことに、溶媒の適切な選択が変換率を有意に改良するということが見いだされた。

本発明の別の態様によると、式

を有するシロドシンは、
ａ）上記の第（１）項から第（２７）項のいずれか一項によるプロセスによって調製される式ＩＩ”

（式中、Ｒ_２’は、−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−Ｒ_３’または−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４’であり、ここで、Ｒ_３’およびＲ_４’は、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールを表す。）
の化合物を用意する工程、および
ｂ）工程ａ）の式ＩＩ”の化合物をシロドシンに変換する工程
を含む方法によって得られる。

上記の態様は、還元的アミノ化および／または速度論的分割の本手順態様の適用ならびにそれに伴う有益な効果による、特に利点を有するシロドシンの調製方法をもたらす。

本発明のまたさらなる態様によると、医薬として有効な成分および少なくとも１つの医薬として許容できる賦形剤として、式

のシロドシンを含む医薬的組成物が提供されるが、シロドシンは完全に金属不純物を含まない。

以下の実施例で本発明をさらに説明するが、それらは、単に例示の目的で提示するのであって、本発明をいかようにも限定することを意図したものではない。実施例および改変またはそれらの他の同等物は、本開示全体からみて、その道に明るい同業者に明白となる。

本明細書で使用される用語「金属不純物」とは、元素金属の形態にある触媒、共有結合性金属化合物またはシロドシンを調製する従来の化学合成において使用されている、塩の形態にある金属化合物に由来する不純物を意味する。より具体的には、「金属不純物」は、シロドシンの化学調製において従来から適用されている金属触媒に由来していることを想定し、一般には、例えばチャコール上のＰｄおよび／またはＢａＳＯ_４上のＰｔＯ_２が適用されている。

本明細書で使用される用語「医薬として許容できる賦形剤」とは、当業界において周知の、活性作用剤の物理的および化学的特徴と適合する、生理的に不活性で、薬理学的に作用のないあらゆる物質を意味する。

材料
概要
全ての出発材料は、市販品供給業者から入手し、ラセミの３−（７−シアノ−５−（２−（アミノ）プロピル）インドリン−１−イル）プロピルベンゾエート（式ＩＩ”の化合物）および３−（７−シアノ−５−（２−（オキソ）プロピル）インドリン−１−イル）プロピルベンゾエート（式Ｉ’の化合物）を除き、受け取ったまま使用した。反応は、標準Ｓｃｈｌｅｎｋ法で、乾燥Ｎ_２雰囲気下にてオーブンで乾燥させた（１２０℃）ガラス器具中で実施した。

構造式

を有する３−（７−シアノ−５−（２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）プロピル）インドリン−１−イル）プロピルベンゾエートを、下記に記載のキラル分析の基準化合物として使用した。この化合物は以下のように調製した。

３−（７−シアノ−５−（２−（アミノ）プロピル）インドリン−１−イル）プロピルベンゾエート（１００ｍｇ、２７５μｍｏｌ）の５ｍＬＤＭＥ中の撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸無水物（ＴＦＡＡ）（７２ｍｇ、４９μＬ、３４４μｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．７ｍｇ、１４μｍｏｌ）を加えた。１２時間後、飽和ＮａＨＣＯ_３を加えて反応を停止させ、次いで微量のＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。その残渣を、フィルターフラッシュクロマトグラフィーによって、シリカ上で精製し（溶離液：ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝８０／２０）、６１％の歩留り（７７ｍｇ、１６８μｍｏｌ）で、わずかに黄色のオイルとして生成物を得た。Ｒ_Ｆ［（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ）６０／４０］＝０．４１であった。^１H-NMR (３００ MHz, CDCl_３): δ_H
[ppm] = １.２０ (d, ^３J_３',２' = ６.６ Hz, ３ H, ３'-H), ２.１７ = (tt, ^３J_２'',１'' = ６.５ Hz, ^３J_２'',３'' = ７.１ Hz, ２ H, ２''-H), ２.６１ (dd, ^３J_１'Ha,２' = ７.４ Hz, ^２J_１'a,１'b = １３.８ Hz, １ H, １'-H_a), ２.７２ (dd, ^３J_１'b,２' = ５.９ Hz, ^２J_１'b,１'a = １３.８ Hz, １ H, １'-H_b), ２.９７ (t, ^３J_３,２ = ８.７ Hz, ２ H, ３-H_ind),
３.６１ (t, ^３J_２,３ = ８.７ Hz, ２ H, ２-H_ind), ３.７６ (t, ^３J_２'',３'' = ７.２ Hz, ２ H, １''-H), ４.１５ (m_c,
１ H, ２'-H), ４.４７ (t, ^３J_１'',２'' = ６.３ Hz, ２ H, １''-H), ６.１１ (d, ^３J_NH,２' = ７.９ Hz, ２ H, NH), ６.９３ (m_c,
２ H, arom-H_ind), ７.４４ (m_c, ２ H, 芳香族-H), ７.５５ (m_c,
１ H, 芳香族-H), ８.０６ (m_c, １ H, 芳香族-H). ^１３C-NMR (７５ MHz, CDCl_３): δ_C
[ppm] = １９.５ (C-３'), ２７.３ (C-２''), ２７.５ (C-３), ４０.９ (C-１'), ４５.３ (C-１''), ４７.５ (C-２'), ５３.５ (C-２), ６２.７ (C-３''), ８８.０ (C-７), １１９.４ (CF_３), １２５.５ (CN), １２８.８ (芳香族-CH), １２９.５ (芳香族-CH_ind),
１２９.９ (芳香族-CH), １３０.３ (芳香族-C_ipso), １３２.０ (芳香族-CH_ind), １３３.２ (芳香族-C_ipso),
１３３.３ (芳香族-C_ipso), １５２.２ (COCF_３), １６６.８ (COO). ^１９F-NMR (２８５ MHz, CDCl_３): δ_H
[ppm] = -７６.００ (s, ３ F, CF_３).

酵素および微生物
カンジダ・ボイディニー（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）由来のギ酸脱水素酵素（グリセロールを含む水性緩衝剤溶液、２１５Ｕ・ｍＬ^−１［１単位は、ｐＨ７．６において３７℃で毎分あたり、１．０μｍｏｌのギ酸をＣＯ_２に酸化する。］、カタログ番号ＦＤＨ００２）およびβ−ＮＡＤ遊離酸はＣｏｄｅｘｉｓ社から購入した。過剰発現しているω−トランスアミナーゼ（ω−ＴＡ）を含む凍結乾燥されたＥ・コリ細胞および精製された組み換えＬ−アラニン脱水素酵素は、Ｆ．Ｇ．Ｍｕｔｔｉら、Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２０１１年、３５３、３２２７−３２３３頁において報告されているように、それぞれ調製した。

以下に列記されているω−トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、示された文献に由来するが、本発明者らは、Ｅ・コリにおけるω−トランスアミナーゼの発現を改良するのに、コドン最適化遺伝子を用いた。

アルスロバクター属種に由来するω−トランスアミナーゼの配列はＥＰ０９８７３３２Ａ１から引用した。

アルスロバクターに由来するω−トランスアミナーゼの第１１ラウンド突然変異体の配列は、Ｃ．Ｋ．Ｓａｖｉｌｅら、「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｉｒａｌ Ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｋｅｔｏｎｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０年、３２９、３０５−３０９頁から引用した。

アスペルギルス・テレウスに由来するω−トランスアミナーゼは、Ｆ．Ｇ．Ｍｕｔｔｉ、Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２０１０年、３５３、３２２７−３２３３頁に記載されてあるように調製した。

バチルス・メガテリウムに由来するω−トランスアミナーゼは、Ｒ．Ｌ．Ｈａｎｓｏｎら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ （Ｒ）−Ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｒａｃｅｍｉｃ Ａｍｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ （Ｓ）−Ａｍｉｎｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ」、Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００８年、３５０、１３６７−１３７５頁に記載されてあるように調製した。

クロモバクテリウム・ビオラセウムに由来するω−トランスアミナーゼは、Ｕ．Ｋａｕｌｍａｎｎら、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ」、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００７年、４１、６２８−６３７頁に記載されてあるように調製した。

Ｐ．フルオレッセンスに由来するω−トランスアミナーゼの配列は、例えば、Ｎ．Ｉｔｏら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０１１年、７５、２０９３−２０９５頁から引用した。

Ｐ．プチダに由来するω−トランスアミナーゼの配列は、ＷＯ２０１０／０８９１７１Ａ２に記載されている。シュードモナス・プチダＩは配列番号２０に対応し、シュードモナス・プチダＩＩは配列番号２２に対応する。

アルスロバクター・シトレウスに由来するω−トランスアミナーゼの配列は、ＷＯ２００６／０６３３３６（またはｗｅ ｕｓ ＵＳ７２４７４６０Ｂ２）から引用した。アルスロバクター・シトレウスはこの特許における配列番号０２に対応する。

全てのω−トランスアミナーゼがエシェリヒア・コリ中で発現した。具体的には、以下の実施例において、ω−トランスアミナーゼは、凍結乾燥されたＥ．コリ細胞調製物の形態で適用されている。

分析方法
３００ Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲユニットで２０℃にて記録した^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトル
化学シフトは、Ｍｅ_４Ｓｉ（^１Ｈ：Ｍｅ_４Ｓｉ＝０．０ｐｐｍ）に対するｐｐｍ単位でまたは溶媒（^１Ｈ：ＣＤＣｌ_３＝７．２６ｐｐｍ、^１３Ｃ：ＣＤＣｌ_３＝７７．０ｐｐｍ）の共鳴に対するｐｐｍ単位で与えられている。

酵素的速度論的分割および還元的アミノ化反応における変換の決定
示された反応時間後、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３溶液（１００μＬ）を加え、その混合物を激しく振とうした。水相を、ＳＰＥＥＤＶＡＣシステムにより減圧下で完全に除去し、残渣をＭｅＣＮ（５００μＬ）で再懸濁した。セライト５４５のプラグに通してろ過した後、追加のＭｅＣＮ（５００μＬ）を加え、このプロセスを繰り返した。ＨＰＬＣの条件は、カラム＝Ｌｕｎａ ＲＰ−Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ＝２５ｃｍ、内径＝４．６ｍｍ、溶離液としてＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ（６５：３５）（＋０．１ｖｏｌ％ＴＦＡ）用い、１．０ｍＬ／分でのイソクラティックフローとした。Ｒｔ（ＩＩ’）＝２．５１分Ｒｔ（Ｉ’）＝９．６８分であった。

鏡像異性体過剰率（ｅｅ）の決定
３−（７−シアノ−５−（２−（アミノ）プロピル）インドリン−１−イル）プロピルベンゾエートを対応するＴＦＡ−アセトアミドへ誘導体化した後、ＭｅＣＮ溶液の試料を採取（５００μＬ）し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。その残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（２００μＬ）に溶解し、ＴＦＡＡ（約３当量）を加えた。３０℃で１５分間振とうした後、試料を再び濃縮した。その試料を、有機溶媒中（ｎ−へプタン／２−ＰｒＯＨ、５０：５０）に再取り込みし、コットンのプラグに通してろ過した後、測定できる状態とした。ＨＰＬＣの条件は、カラム＝ＯＤ−Ｈ（Ｃｈｉｒａｃｅｌ）、長さ＝２５ｃｍ、内径＝４．６ｍｍ、溶離液としてｎ−へプタン／２−ＰｒＯＨ（９５：５）用い、１．５ｍＬ／分でのイソクラティックフローとした。Ｒｔ［（Ｒ）−ＩＩ’−ＴＦＡ−エステル］＝１９．３５分、Ｒｔ［（Ｓ）−ＩＩ’−ＴＦＡ−エステル］＝２２．８５分であった。

［実施例１］ 不斉還元的アミノ化
ａ）予備試験
マイクロスケールバッチの一般調製手順
過剰発現した対応するω−ＴＡを含有するＥ．コリの凍結乾燥された細胞（２０ｍｇ）を、ＰＬＰ（１ｍＭ）、ＮＡＤ^＋（１ｍＭ）、ギ酸アンモニウム（１５０ｍＭ）、ＦＤＨ（１１Ｕ）、Ａｌａ−ＤＨ（１２Ｕ）およびＤ−当該のＬ−アラニン（５００ｍＭ）を含有するリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７．０、１００ｍＭ）中で、室温で３０分間、再水和した。その後基質（３．６ｍｇ／１００μＬＤＭＳＯ）を加え、エッペンドルフオービタルシェーカー（７００ｒｐｍ）で３０℃で２４時間、反応を実施した。

実験結果は、下の表１にまとめてある。表中、列記された値は、重複の測定値から求められた平均値を表す（２回測定間の偏差＜１０％）。

上の表１に列記された実験データから明白となるように、本発明による還元的アミノ化プロセスは、鏡像異性体が富化されている形態で所望の生成物を得るのに特に適切である。ω−トランスアミナーゼは、鏡像異性体過剰率が高いことも変換率が高いことも提供する、シュードモナス・フルオレッセンスおよび（Ｒ）−アルスロバクター属種に由来するのが好ましい。ω−トランスアミナーゼは、鏡像異性体過剰率も高く歩留りも高い、シロドシンを調製するのに特に所望される中間生成物となる、式ＩＩ’の化合物の（Ｒ）−鏡像異性体を提供する、（Ｒ）−アルスロバクター属種に由来するのがより有益である。

ｂ）アルスロバクター第１１ラウンド突然変異体に由来するω−ＴＡの試験
マイクロスケールバッチの一般調製手順
アルスロバクター第１１ラウンド突然変異体に由来する、過剰発現しているω−ＴＡを含有するＥ．コリの凍結乾燥された細胞（それぞれ２０ｍｇおよび４０ｍｇ）を、ＰＬＰ（１ｍＭ）を含有するリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７．０、１００ｍＭ）中で、室温にて３０分間、再水和した。その後、１０ｖｏｌ％のＤＭＳＯおよびＮ供与体として、ｎ（基質）／ｎ（供与体）比により決定された量で２−プロピルアミン（２５０ｍＭ）とともに、基質（それぞれ１０および２５ｍＭ）を加え、次いでエッペンドルフオービタルシェーカー（７００ｒｐｍ）で４５℃にて２４時間、反応を実施した。

実験結果は下の表２にまとめられている。

上の表２に列記された実験データから明白となるように、変換率および／または鏡像異性体富化の特性が、本発明による還元的アミノ化プロセスにより達成されている。アルスロバクター第１１ラウンド突然変異体に由来するω−ＴＡによる最良の結果が、鏡像異性体過剰率の点でエントリー４による条件で、および変換の点でエントリー１による条件で得られている。エントリー２による条件において、好ましいことに鏡像異性体過剰率および変換の両方の釣り合いが良く取れている。

上の一般調製手順を、アルスロバクター第１１ラウンド突然変異体に由来する、過剰発現しているω−ＴＡを含有するＥ．コリの凍結乾燥された細胞（２０ｍｇ）を適用して実施したが、反応条件は、４０℃に低下させた反応温度が適用されたということ、および異なるＤＭＳＯ濃度が試験されたという点において異なった。実験結果は下の表３にまとめられている。

上の表３に列記された実験データから明白となるように、変換率および／または鏡像異性体富化の特性が、本発明による還元的アミノ化プロセスにより達成されている。反応温度を４０℃に低下すると、鏡像異性体過剰率は、表２のエントリー３に比べて概してわずかに上昇した。他方、有益なことに、表３のエントリー１から８の全条件が、好都合に高変換率を可能にしている。

ｃ）アルスロバクター属種に由来するω−ＴＡに対する溶媒および基質濃度の影響の試験
３−（７−シアノ−５−（２−（オキソ）プロピル）インドリン−１−イル）プロピルの基質濃度を、立体化学的成果に影響を及ぼすことなく、さらに高めることができるか評価するために、有機共溶媒の関数として変換を、アルスロバクター属種に由来するω−ＴＡで調査した。特に、式Ｉ’の化合物は水および非極性、非プロトン性有機溶媒（例えばトルエン、ＥｔＯＡｃ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＴＢＭＥおよびＥｔ_２Ｏ）にほとんど不溶なので、本発明者らは極性および水混和性溶媒ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦおよびＭｅＣＮに着目した。全ての反応は、異なる基質濃度（５−２５ｍＭの３−（７−シアノ−５−（２−（オキソ）プロピル）インドリン−１−イル）プロピル）で３０℃にて２４時間、実施した。

実験結果は下のスキーム１にまとめてある。

上のスキーム１に例示された実験データから明白となるように、変換率および／または鏡像異性体富化の特性が、本発明による還元的アミノ化プロセスにより達成されている。溶媒ＤＭＳＯおよびＤＭＦが、ＴＨＦおよびアセトニトリル（ＭｅＣＮ）と比較して、有意に改良された変換率を可能としている。さらに、低い基質濃度が、比較的高い基質濃度と比較して、有意に改良された変換率を可能としている。

ｄ）調製的スケールのバッチ
調製的スケールでのバッチに関する例示的調製手順
（Ｒ）−アルスロバクター属種に由来する、過剰発現しているω−ＴＡを含有するＥ．コリの凍結乾燥された細胞（２２５ｍｇ）を、ＰＬＰ（１．００ｍＭ）、ＮＡＤ^＋（１．００ｍＭ）、ギ酸アンモニウム（１５０ｍＭ）、ＦＤＨ（１１Ｕ）、Ａｌａ−ＤＨ（１２Ｕ）およびＤ−アラニン（５００ｍＭ）を含有するＫＰｉ緩衝剤中（９ｍＬ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ）で、２２℃にて３０分間、再水和した。その後、１．０ｍＬのＤＭＦに溶解させた式Ｉ’（３−（７−シアノ−５−（２−（オキソ）プロピル）インドリン−１−イル）プロピル）の化合物（５４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を加え、次いでその反応物を３０℃にて２６時間振とうして、９３％の変換に達した。その後、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３溶液（１．００ｍＬ）を加え、その水相を減圧下で濃縮した。その残渣をＭｅＣＮ（３ｘ５ｍＬ）で再懸濁し、セライトのプラグに通してろ過し、シリカフラッシュクロマトグラフィーの後、８８％の歩留りで光学的に純粋なアミン（Ｒ）−ＩＩ’を得た。^１H-NMR (３００ MHz; CD_３CN): δ_H [ppm]: ０.９７ (d, J = ６.３ Hz, ３ H), １.４３ (brs, ２ H, -NH_２), ２.１０ (tt, J_１ = ７.２ Hz, J_２ = ６.２ Hz, ２ H), ２.３１ (dd, J_１ = ７.６ Hz, J_２ = １３.３ Hz, １ H_a), ２.４３ (dd, J_１ = ５.７ Hz, J = １３.３ Hz, １ H_b), ２.８７-２.９９ (m, １ H), ２.９３ (t, ８.８ Hz, ２ H), ３.５７ (t, ８.７ Hz, ２ H), ３.７３ (t, ７.２ Hz, ２ H), ４.４１ (t, ６.２ Hz, ２ H), ６.９４ (s, １ H), ７.０１ (s, １ H), ７.４３-７.５１ (m, ２ H), ７.６０ (m_c, １ H), ８.００-８.０７ (m, ２ H).
^１３C-NMR (７５ MHz; CD_３CN): δ_H [ppm]: ２３.８, ３７.５, ２７.９, ４５.９, ４６.１, ４９.３, ５３.９, ６３.６, ８８.２, １２０.４, １２９.４, １３０.０, １３０.３, １３０.９, １３１.３, １３２.１, １３４.０, １３４.１, １５２.５, １６７.２.

［実施例２］ 速度論的分割
マイクロスケールバッチに関する一般調製手順
過剰発現している対応するω−トランスアミナーゼを含有するＥ．コリの凍結乾燥された細胞（２０ｍｇ）を、ＰＬＰ（１ｍＭ）およびピルビン酸ナトリウム（１当量）を含有するリン酸カリウム緩衝剤中（ｐＨ７．０、１００ｍＭ）で、室温にて３０分間再水和した。その後、基質（３．６ｍｇ／１００μＬＤＭＳＯ）を加え、エッペンドルフオービタルシェーカー中（７００ｒｐｍ）で３０℃にて２４時間反応を実施した。

実験結果は下の表４にまとめてある。表中、列記された値は、重複の測定値から求められた平均値を表す（２回測定間の偏差＜１０％）。

上の表４に列記された実験データから明白となるように、変換率および／または鏡像異性体富化の特性が、本発明による速度論的分割プロセスにより達成されている。ω−トランスアミナーゼ、シュードモナス・プチダＩおよびＩＩ、アスペルギルス・テレウス、バチルス・メガテリウムおよびアルスロバクター属種が適用されるのが好ましく、これらが、高い鏡像異性体過剰率および高い変換率の両方を可能としている。シュードモナス・プチダＩが適用されるのがさらに有益で、鏡像異性体過剰率も相対的に高く歩留りも相対的に高い、シロドシンを調製するのに特に所望される中間生成物となる、式ＩＩ’の化合物の（Ｒ）−鏡像異性体を提供する。

Claims (13)

1. 式ＩＩ
   

   

   ［式中、ｍは１から８であり、
   Ｒ_１は、ＣＮ、ＮＨ_２、ＮＯ_２およびカルバモイルに変換可能な基からなる群から選択され、
   Ｒ_２は、Ｈ、Ｎ保護基、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_３および−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４からなる群から選択され、ここでｎ＝１から１０であり、
   Ｒ_３は、ヒドロキシ保護基であり、Ｒ_４およびＲ_５は互いに独立して、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールから選択される。］
   のキラルアミン化合物を調製する方法であって、
   式Ｉ
   

   

   ［式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５およびｍは、上で定義されているとおりである。］
   の化合物をω−トランスアミナーゼの存在下でアミン供与体と反応させる方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   ω−トランスアミナーゼが、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、ヒポモナス・ネプツニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、（Ｒ）−アルスロバクター属種（（Ｒ）−Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、アロソバクター第１１ラウンド突然変異体（Ａｒｏｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｕｎｄ １１ ｍｕｔａｎｔ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）およびアルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）からなる群、好ましくは、シュードモナス・フルオレッセンスおよび（Ｒ）−アルスロバクター属種からなる群から選択される生物に由来し、または
   ω−トランスアミナーゼが（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼであり、好ましくは、この（Ｒ）−選択的ω−トランスアミナーゼが、（Ｒ）−アルスロバクター属種、ヒポモナス・ネプツニウム、アスペルギルス・テレウスおよびアルスロバクター第１１ラウンド突然変異体（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｕｎｄ １１ ｍｕｔａｎｔ）からなる群、より好ましくは、（Ｒ）−アルスロバクター属種およびアスペルギルス・テレウスからなる群、特に、（Ｒ）−アルスロバクター属種からなる群から選択される生物に由来する、方法。
3. 請求項１または２に記載の方法であって、
   アミン供与体が、アラニン、１−エチルアミン、１−プロピルアミン、２−プロピルアミン、１−インドールアミン、フェネチルアミンなどからなる群、好ましくは、アラニンおよび２−プロピルアミンからなる群、より好ましくは、２−プロピルアミンからなる群から選択される、方法。
4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の方法であって、
   式ＩＩのキラルアミン化合物が、光学的に活性であり、好ましくは、式ＩＩの光学活性化合物が、鏡像異性体過剰率を少なくとも６０−１００％、好ましくは、７５−１００％、より好ましくは、８５−１００％、さらにより好ましくは、９０−１００％、またさらにより好ましくは、９５−１００％、特に、９９−１００％有する、方法。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載の方法であって、
   式Ｉの化合物が、反応混合物において、１から２００ｍＭ、好ましくは、５から１５０ｍＭ、より好ましくは、１０から１００ｍＭ、特に、１５から５０ｍＭの濃度で供給され、および／または
   前記方法が、１６−４０℃、好ましくは、２０−３６℃、より好ましくは、２４−３４℃、さらにより好ましくは、２６−３２℃の反応温度で実施され、および／または
   ω−トランスアミナーゼが、アルスロバクター第１１ラウンド突然変異体である場合、前記方法が３５−５０℃、好ましくは、４０−４５℃の反応温度で実施される、方法。
6. 請求項１から５のいずれか一項に記載の方法であって、
   アミン供与体がアラニンである場合、反応混合物が、アラニン脱水素酵素（Ａｌａ−ＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ピリドキサール−５’−フォファット（ＰＬＰ）およびギ酸アンモニウムをさらに含み、または
   反応混合物が、アラニン脱水素酵素（Ａｌａ−ＤＨ）、ブドウ糖脱水素酵素（ＧＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ピリドキサール−５’−フォファット（ＰＬＰ）、ブドウ糖およびアンモニウム塩をさらに含み、または
   反応混合物が、アラニン脱水素酵素（Ａｌａ−ＤＨ）、亜リン酸脱水素酵素（ＰＴＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、ピリドキサール−５’−フォファット（ＰＬＰ）および亜リン酸アンモニウムをさらに含む、方法。
7. 式ＩＩ
   

   

   ［式中、Ｒ_１は、ＣＮ、ＮＨ_２、ＮＯ_２およびカルバモイルに変換可能な基からなる群から選択され、
   Ｒ_２は、Ｈ、Ｎ保護基、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_３または−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４からなる群から選択され、ここでｎ＝１から１０であり、
   Ｒ_３は、ヒドロキシ保護基であり、Ｒ_４およびＲ_５は互いに独立して、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールから選択される。］
   の光学的に活性なキラルアミン化合物を調製する方法であって、
   ｉ）式ＩＩ
   

   

   ［式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５およびｍは、上で定義されているとおりである。］
   の化合物の第１型および第２型の鏡像異性体の混合物を、ω−トランスアミナーゼの存在下でアミン受容体と反応させて、式ＩＩの化合物の第１型の鏡像異性体を、式Ｉ
   

   

   ［式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５およびｍは、上で定義されているとおりである。］
   の化合物に変換する工程、および
   ｉｉ）反応混合物から、式ＩＩの化合物の残りの未反応の第２型の鏡像異性体を分離する工程
   を含む、方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、
   ω−トランスアミナーゼが、ヒポモナス・ネプツニウム、クロモバテリウム・ビオラセウム、シュードモナス・プチダＩまたはＩＩ、アスペルギルス・テレウス、バチルス・メガテリウムおよびアルスロバクター属種からなる群、好ましくはシュードモナス・プチダＩ、アスペルギルス・テレウス、バチルス・メガテリウムおよびアルスロバクター属種からなる群から選択される、または
   ω−トランスアミナーゼが（Ｓ）−選択的であり、好ましくは、この（Ｓ）−選択的ω−トランスアミナーゼが、クロモバクテリウム・ビオラセウム、シュードモナス・プチダＩまたはＩＩ、バチルス・メガテリウムからなる群、より好ましくは、シュードモナス・プチダＩおよびバチルス・メガテリウムからなる群から選択される生物に由来する、方法。
9. アミン受容体がピルベートである、請求項７または８に記載の方法。
10. 請求項７から９のいずれか一項に記載の方法であって、
    工程ｉｉ）中で得られた式ＩＩの化合物の光学活性キラルアミンが、７０−１００％、好ましくは、８０−１００％、より好ましくは、９０−１００％、さらにより好ましくは、９５−１００％、またさらにより好ましくは、９９−１００％の鏡像異性体過剰率を有する、方法。
11. 以下の（ｉ）から（ｖ）の手順的製法条件のいずれか一つまたは組合せて実施される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）ＩＩの化合物とアミン受容体とのモル比が、１：１から１：１０、好ましくは、１：１．２から１：８、より好ましくは、１：１．２から１：４、最も好ましくは、１：１．５から１：２．５であり、
    （ｉｉ）ω−トランスアミナーゼが、ω−トランスアミナーゼを過剰発現している、易透過処理されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形態で供給され、または粗酵素抽出物もしくはそれらの凍結乾燥残渣として供給され、または（部分）精製酵素調製物もしくは凍結乾燥残渣もしくはそれらの凍結乾燥残渣として供給され、または
    固定化調製物として供給され、好ましくは、ω−トランスアミナーゼが、ω−トランスアミナーゼを過剰発現している、易透過処理されたＥ．コリ細胞の形態で供給され、より好ましくは、任意の酵素溶液の凍結乾燥残渣の形態で供給され、
    （ｉｉｉ）ω−トランスアミナーゼを過剰発現している、凍結乾燥されたＥ．コリ細胞の質量と式ＩＩの化合物のモル量との比が、１０ｇ／１ｍｏｌから２０００ｇ／１ｍｏｌであり、
    （ｉｖ）前記方法が、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、ＤＭＥおよびＣ１−Ｃ６アルコールからなる群、好ましくは、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、ＤＭＥおよびＣ１−Ｃ３アルコールからなる群、より好ましくは、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＭｅＣＮ、ＤＭＥからなる群、特に、ＤＭＦおよびＤＭＳＯからなる群から選択される有機溶媒の存在下で実施され、
    （ｖ）反応混合物が、場合によってリン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤、ＰＩＰＥＳ緩衝剤およびＨＥＰＥＳ緩衝剤からなる群から選択される水性緩衝剤系をさらに含み、好ましくは、緩衝剤は省略される、
    方法。
12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法であって、
    式ＩおよびＩＩの化合物が、ａ）、ｂ）および／またはｃ）の少なくとも１つの構造的特性によってそれぞれ独立して特徴づけられ、
    ａ）Ｒ_２は、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）からなる群から選択されるアミン保護基を表し、
    ｂ）ヒドロキシ保護基Ｒ_３が、ベンゾイル、トシル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、アセチル、ピバロイルからなる群から選択され、および／または
    ｃ）ｍ＝１から５であり、Ｒ_１はＣＮであり、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４（式中、ｎ＝１から５である。）であり、Ｒ_４は直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはフェニルであり、Ｒ_５は直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
    好ましくは、ｍ＝１から３であり、Ｒ_１はＣＮ、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４（式中、ｎ＝１から３である。）であり、Ｒ_５はメチルまたはエチルであり、
    より好ましくは、ｍ＝１であり、Ｒ_１はＣＮであり、Ｒ_２は−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＯ−Ｐｈであり、Ｒ_５はメチルである、方法。
13. 式
    

    

    を有するシロドシンを調製する方法であって、
    ａ）請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法によって調製される、式ＩＩ”
    

    

    ［式中、Ｒ_２’は、−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−Ｒ_３’または−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＯ−Ｒ_４’であり、ここで、Ｒ_３’およびＲ_４’は、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アリールまたは置換もしくは非置換Ｃ３−Ｃ１０アルキルアリールを表す。］
    の化合物を用意する工程、および
    ｂ）工程ａ）の式ＩＩ”の化合物をシロドシンに変換する工程
    を含む方法。